Name: Disección y aislamiento de tejido pulmonar descelularizado específico de la región (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-29T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 25 s
Description: Aprende a aislar tejido pulmonar descelularizado por regiones anatómicas específicas. Este método permite analizar la matriz extracelular y sus firmas proteómicas distintivas en pulmones sanos y enfermos.

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Los autores agradecen a los servicios de autopsia de UVM para la obtención de pulmón humano y a Robert Pouliot PhD por sus contribuciones a las técnicas generales de disección. Estos estudios fueron apoyados por R01 HL127144-01 (DJW).

Todos los estudios en animales se han realizado de acuerdo con el IACUC de la Universidad de Vermont (UVM). Todos los pulmones humanos fueron adquiridos de los Servicios de Autopsia UVM y los estudios relacionados se realizaron según las directrices del IRB de UVM.
NOTA: La descelularización de pulmones de cerdo y humanos ha sido previamente descrita por nuestro grupo 7,8,9,10,21. En resumen, los lóbulos pulmonares enteros se descelularizan mediante perfusión secuencial de las vías respiratorias y la vasculatura con una serie de detergentes de 2 L y soluciones enzimáticas utilizando una bomba peristáltica: 0,1% Triton-X 100, 2% desoxicolato de sodio, cloruro de sodio 1 M, 30 μg/mL DNasa/1,3 mM MgSO 4/2 mM CaCl2, 0,1% ácido peracético/4% etanol, y un lavado con agua desionizada. Los métodos estándar para confirmar la descelularización eficiente incluyen la determinación de ADN bicatenario residual de <50 ng/mg dentro de los pulmones descelularizados y la ausencia de fragmentos de ADN por electroforesis en gel, y la tinción nuclear por tinción de hematoxilina y eosina (H&E) 9,21.
1. Configuración
<ol><li>Reúna todo el equipo necesario para el procedimiento de disección, incluyendo una cazuela de vidrio, dos pares de pinzas quirúrgicas, un par de fórceps y un par de tijeras quirúrgicas, y autoclave antes de usar.</li>
	<li>Obtenga una sección del pulmón, colóquela en la cazuela de vidrio y oriente para que el extremo superior de la vía aérea se pueda ver claramente.</li>
	<li>Identifique el extremo proximal de la vasculatura y manténgalo intacto hasta pasos posteriores. El extremo de la vasculatura debe ser claramente visible y de color blanco completamente opaco.</li>
	<li>Con un par de pinzas y tijeras quirúrgicas, retire cualquier pleura que pueda estar recubriendo el exterior del pulmón y deséchela.</li>
</ol>2. Exponer las vías respiratorias
<ol><li>Usando una técnica de extensión con las tijeras quirúrgicas, trabaje suavemente para exponer las vías respiratorias adicionales.<ol><li>Localice la vía aérea más grande, que normalmente tendrá un diámetro de aproximadamente 2-4 cm. Otra forma de identificar una vía aérea es a través de la observación de anillos de cartílago, que se pueden detectar visualmente o mediante palpación del tejido.</li>
		<li>Usando un par de fórceps, palpar a lo largo de la vía aérea para determinar la ubicación de la vía aérea invisible a una profundidad de aproximadamente 1 pulgada. NOTA: Al estar revestida con anillos de cartílago, la vía aérea es característicamente más dura que los otros tejidos pulmonares. Como tal, encontrar y palpar las vías respiratorias invisibles debe ser relativamente simple.</li>
		<li>Sosteniendo las tijeras quirúrgicas paralelas a las vías respiratorias, inserte las puntas cerradas en el tejido que rodea directamente la vía aérea invisible.</li>
		<li>Abra lentamente las tijeras quirúrgicas para separar suavemente la membrana circundante. Posteriormente, retire las tijeras quirúrgicas y evite cortar cualquier tejido.</li>
		<li>Repita este proceso intermitentemente durante todo el procedimiento de disección para continuar exponiendo las vías respiratorias.</li>
	</ol></li>
	<li>Usando las tijeras quirúrgicas, corte las vías respiratorias en los puntos de ramificación y diseccione a lo largo de cualquiera de las ramas de forma independiente. NOTA: Un punto de ramificación es un lugar en el que una vía aérea se divide en dos vías respiratorias separadas.</li>
	<li>Cortar regiones de la vía aérea una vez que confíe en que los extremos intactos permanecerán identificables y fácilmente localizados para una mayor disección.</li>
	<li>Coloque las regiones cortadas de la vía aérea en el tubo correspondiente. El tamaño de las regiones cortadas variará dependiendo de la muestra pero, en general, oscilará entre 1-5 cm de longitud. El ancho varía según la ubicación relativa a lo largo del árbol de las vías respiratorias, con las regiones distales manteniendo anchos más pequeños que las regiones más proximales.</li>
</ol>3. Exponer y extirpar regiones de la vasculatura
<ol><li>Aplique una presión suave en la vasculatura y aléjese lentamente de las vías respiratorias. Permita que la vasculatura se estire ligeramente y use tijeras quirúrgicas para separar aún más la vasculatura de las vías respiratorias. NOTA: Demasiada presión rasgará la vasculatura. Si la vasculatura se rasga, simplemente coloque esa sección de vasculatura en el tubo etiquetado correspondiente e identifique su extremo intacto.</li>
	<li>Cuando se haya expuesto un punto de ramificación en el árbol vascular, use tijeras quirúrgicas y pinzas para exponer regiones más inferiores de la vasculatura.<ol><li>Comience insertando las puntas cerradas de las tijeras quirúrgicas justo debajo de un punto de ramificación y entre las dos regiones de vasculatura correspondientes.</li>
		<li>Abra lentamente las tijeras para separar los tejidos subyacentes.</li>
		<li>Intermitentemente, use un par de pinzas para eliminar el tejido que se separó usando las tijeras quirúrgicas, así como cualquier otro tejido que rodee directamente la vasculatura.</li>
	</ol></li>
	<li>Cuando la vasculatura cubra regiones de las vías respiratorias o se vuelva engorrosa para cualquier paso del procedimiento de disección, corte la vasculatura en un punto de ramificación y diseccione a lo largo de cualquiera de las ramas de forma independiente.</li>
	<li>Cortar regiones de la vasculatura una vez que confíe en que los extremos intactos permanecerán identificables y fácilmente localizados para una mayor disección.</li>
</ol>4. Identificación y extirpación del tejido alveolar
<ol><li>Usando un par de pinzas o pinzas, pellizque y luego arranque suavemente pequeñas regiones de tejido alveolar.<ol><li>Localice una región de tejido que no esté en las inmediaciones directas de las vías respiratorias o la vasculatura.</li>
		<li>Usando las pinzas, pellizque una pequeña región del tejido que parece estar desprovista de vasculatura o vía aérea.</li>
		<li>Desgarre la región pellizcada del tejido del pulmón.</li>
	</ol></li>
	<li>Observe la región de tejido extirpada y confirme si es o no tejido alveolar. NOTA: El tejido alveolar está presente en todo el pulmón, por lo que puede y debe eliminarse durante todo el procedimiento de disección. Cualquier tejido que no pueda identificarse fácilmente como principalmente alvéolo, vasculatura o vía aérea debe clasificarse como tejido a granel y colocarse en el tubo etiquetado correspondiente.</li>
</ol>

Aislamiento regional de tejido pulmonar descelularizado para estudiar las interacciones célula-célula y célula-ECM

<ol><li>López-Campos, J. L., Tan, W., Soriano, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+burden+of+COPD%5BTitle%5D)+AND+%22Respirology%22%5BJournal%5D)">Global burden of COPD.</a> Respirology. 21 (1), 14-23 (2016).</li>
<li>Raherison, C., Girodet, P. -O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+COPD%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Review%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of COPD.</a> European Respiratory Review. 18 (114), 213-221 (2009).</li>
<li>Glass, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Idiopathic+pulmonary+fibrosis%3A+Current+and+future+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22The+Clinical+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Idiopathic pulmonary fibrosis: Current and future treatment.</a> The Clinical Respiratory Journal. 16 (2), 84-96 (2022).</li>
<li>Dickinson, K. M., Collaco, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+Fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics+in+Review%22%5BJournal%5D)">Cystic Fibrosis.</a> Pediatrics in Review. 42 (2), 55-67 (2021).</li>
<li>DeFreitas, M. R., McAdams, H. P., Azfar Ali, H., Iranmanesh, A. M., Chalian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complications+of+lung+transplantation%3A+update+on+imaging+manifestations+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%3A+Cardiothoracic+Imaging%22%5BJournal%5D)">Complications of lung transplantation: update on imaging manifestations and management.</a> Radiology: Cardiothoracic Imaging. 3 (4), e190252(2021).</li>
<li>Young, K. A., Dilling, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+lung+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">The future of lung transplantation.</a> Chest. 155 (3), 465-473 (2019).</li>
<li>Wagner, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+decellularization+and+recellularization+of+normal+versus+emphysematous+human+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Comparative decellularization and recellularization of normal versus emphysematous human lungs.</a> Biomaterials. 35 (10), 3281-3297 (2014).</li>
<li>Booth, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acellular+normal+and+fibrotic+human+lung+matrices+as+a+culture+system+for+in+vitro+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 186 (9), 866-876 (2012).</li>
<li>Uhl, F. E., Wagner, D. E., Weiss, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+decellularized+lung+matrices+for+cell+culture+and+protein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of decellularized lung matrices for cell culture and protein analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1627, 253-283 (2017).</li>
<li>Wagner, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+scaffolds+of+acellular+human+and+porcine+lungs+for+high+throughput+studies+of+lung+disease+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional scaffolds of acellular human and porcine lungs for high throughput studies of lung disease and regeneration.</a> Biomaterials. 35 (9), 2664-2679 (2014).</li>
<li>Uhl, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+role+of+glycosaminoglycans+in+decellularized+lung+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Functional role of glycosaminoglycans in decellularized lung extracellular matrix.</a> Acta Biomaterialia. 102, 231-246 (2020).</li>
<li>Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+hydrogels+from+decellularized+tissues%3A+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: structure and function.</a> Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).</li>
<li>Giobbe, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+hydrogel+derived+from+decellularized+tissues+enables+endodermal+organoid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix hydrogel derived from decellularized tissues enables endodermal organoid culture.</a> Nature Communications. 10 (1), 5658(2019).</li>
<li>Petrou, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clickable+decellularized+extracellular+matrix+as+a+new+tool+for+building+hybrid-hydrogels+to+model+chronic+fibrotic+diseases+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry.+B%22%5BJournal%5D)">Clickable decellularized extracellular matrix as a new tool for building hybrid-hydrogels to model chronic fibrotic diseases in vitro.</a> Journal of Materials Chemistry. B. 8 (31), 6814-6826 (2020).</li>
<li>Nizamoglu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+of+fibrosis+using+crosslinked+native+extracellular+matrix-derived+hydrogels+to+modulate+biomechanics+without+changing+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">An in vitro model of fibrosis using crosslinked native extracellular matrix-derived hydrogels to modulate biomechanics without changing composition.</a> Acta Biomaterialia. 147, 50-62 (2022).</li>
<li>Marhuenda, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+extracellular+matrix+hydrogels+enhance+preservation+of+type+ii+phenotype+in+primary+alveolar+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Lung extracellular matrix hydrogels enhance preservation of type ii phenotype in primary alveolar epithelial cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 23 (9), 4888(2022).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+tissue+extracellular+matrix-derived+hydrogels+protect+against+radiation-induced+lung+injury+by+suppressing+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Lung tissue extracellular matrix-derived hydrogels protect against radiation-induced lung injury by suppressing epithelial-mesenchymal transition.</a> Journal of Cellular Physiology. 235 (3), 2377-2388 (2020).</li>
<li>Pouliot, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+naturally+derived+lung+extracellular+matrix+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 104 (8), 1922-1935 (2016).</li>
<li>Pouliot, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+lung-derived+extracellular+matrix+hydrogel+properties+are+dependent+on+pepsin+digestion+time%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">Porcine lung-derived extracellular matrix hydrogel properties are dependent on pepsin digestion time.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 26 (6), 332-346 (2020).</li>
<li>de Hilster, R. H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lung+extracellular+matrix+hydrogels+resemble+the+stiffness+and+viscoelasticity+of+native+lung+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Human lung extracellular matrix hydrogels resemble the stiffness and viscoelasticity of native lung tissue.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (4), L698-L704 (2020).</li>
<li>Hoffman, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+and+disease+specific+human+lung+extracellular+matrix+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Regional and disease specific human lung extracellular matrix composition.</a> Biomaterials. 293, 121960(2023).</li>
<li>Sicard, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+and+anatomical+variations+in+lung+tissue+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Aging and anatomical variations in lung tissue stiffness.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 314 (6), L946-L955 (2018).</li>
</ol>

Ninguno de los autores tiene ningún conflicto de intereses.

Los tejidos descelularizados de humanos y otras especies se utilizan con frecuencia como biomateriales para estudiar la composición de la ECM, así como las interacciones célula-MEC en modelos de cultivo ex vivo, incluidos los hidrogeles 3D12,13. Al igual que otros órganos, los pulmones descelularizados se han utilizado previamente para determinar las diferencias de composición de la ECM en pulmones sanos versus enfermos (es decir, enfisematosos e IPF) y ...

Las enfermedades pulmonares, incluyendo la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), la fibrosis pulmonar idiopática (FPI) y la fibrosis quística (FQ), actualmente permanecen sin cura 1,2,3,4. El trasplante pulmonar es a menudo la única opción para los pacientes en etapas posteriores, sin embargo, esta sigue siendo una opción limitada debido al suministro de pulmones de donantes adecuados y al rechazo agudo y crónico después del trasplante 3,5,6. Como tal, existe una necesidad crítica de nuevas estrategias de tratamiento. Un enfoque prometedor en bioingeniería respiratoria es la aplicación de andamios derivados de tejidos preparados a partir de tejido pulmonar nativo descelularizado. Como los andamios pulmonares completos acelulares conservan gran parte de la complejidad de la composición y bioactividad de la matriz extracelular nativa (MEC), se han estudiado intensamente para la ingeniería de órganos completos y como modelos mejorados para estudiar los mecanismos de la enfermedad pulmonar 7,8,9,10. Paralelamente, existe un creciente interés en utilizar tejidos descelularizados de diferentes órganos, incluidos los pulmones, como hidrogeles y otros sustratos para estudiar las interacciones célula-célula y célula-ECM en organoides y otros modelos de cultivo de tejidos 11,12,13,14,15,16,17 . Estos proporcionan modelos más relevantes que los sustratos disponibles comercialmente, como Matrigel, derivados de fuentes tumorales. Sin embargo, la información sobre los hidrogeles derivados de pulmón humano es relativamente limitada en la actualidad. Hemos descrito previamente hidrogeles derivados de pulmones de cerdo descelularizados y hemos caracterizado tanto sus propiedades mecánicas como materiales, así como demostrado su utilidad como modelos de cultivo celular18,19. Un informe reciente detalló la caracterización mecánica y viscoelástica inicial de hidrogeles derivados de pulmones humanos normales y enfermos descelularizados (EPOC, FPI)20. También hemos presentado datos iniciales que caracterizan el contenido de glicosaminoglicanos de pulmones humanos normales y EPOC descelularizados, así como su aplicabilidad para el estudio de las interacciones célula-célula y célula-MEC11.
Estos ejemplos ilustran el poder de utilizar ECM de pulmón humano descelularizado con fines de investigación. Sin embargo, el pulmón es un órgano complejo, y tanto la estructura como la función varían en diferentes regiones del pulmón, incluyendo la composición de la ECM y otras propiedades como la rigidez21,22. Como tal, es de interés estudiar la ECM en regiones individuales del pulmón, incluyendo la tráquea y las vías respiratorias grandes, las vías respiratorias medianas y pequeñas, y los alvéolos, así como los vasos sanguíneos grandes, medianos y pequeños. Con este fin, hemos desarrollado un método confiable y reproducible para diseccionar pulmones humanos y porcinos descelularizados y posteriormente aislar cada una de esas regiones anatómicas. Esto ha permitido un análisis diferencial detallado del contenido de proteínas regionales tanto en pulmones normales como enfermos21.

<table><tbody><tr><td>Bonn Tijeras</td><td>Fine Science Tools</td><td>14184-09</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 - Pinzas finas</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-02</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas, curvas, S/S, romas, dentadas - 130mm</td><td>CellPath</td><td>N/A Tijeras</td><td></td></tr><tr><td>Finas Endurecidas Herramientas de</td><td>Ciencia Fina</td><td>14090-11</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de Iris Moria</td><td>Herramientas de Ciencia Fina</td><td>11373-22</td><td></td></tr><tr><td>Cazuela de vidrio Pyrex</td><td>Cole-Parmer</td><td>3175-10</td><td></td></tr></tbody></table>

disección y aislamiento de tejido pulmonar descelularizado específico de la región

Dissection and Isolation of Region-Specific Decellularized Lung Tissue

El trasplante de pulmón es a menudo la única opción para los pacientes en las últimas etapas de la enfermedad pulmonar grave, pero esto es limitado debido tanto al suministro de pulmones de donantes adecuados como al rechazo agudo y crónico después del trasplante. Determinar nuevos enfoques de bioingeniería para el reemplazo de pulmones enfermos es imperativo para mejorar la supervivencia del paciente y evitar complicaciones asociadas con las metodologías actuales de trasplante. Un enfoque alternativo implica el uso de pulmones enteros descelularizados que carecen de componentes celulares que son típicamente la causa del rechazo agudo y crónico. Dado que el pulmón es un órgano tan complejo, es interesante examinar los componentes de la matriz extracelular de regiones específicas, incluida la vasculatura, las vías respiratorias y el tejido alveolar. El propósito de este enfoque es establecer métodos simples y reproducibles mediante los cuales los investigadores pueden diseccionar y aislar tejido específico de la región de pulmones completamente descelularizados. El protocolo actual ha sido diseñado para pulmones de cerdo y humanos, pero también puede aplicarse a otras especies. Para este protocolo, se especificaron cuatro regiones del tejido: vía aérea, vasculatura, alvéolos y tejido pulmonar a granel. Este procedimiento permite la obtención de muestras de tejido que representan con mayor precisión el contenido del tejido pulmonar descelularizado en comparación con los métodos tradicionales de análisis a granel.

En la figura 1 se muestra un esquema general del protocolo. Una vez dominada, la disección regional del tejido pulmonar descelularizado es fácilmente reproducible. Determinar la categorización de cada muestra de tejido cortado es imprescindible para el éxito del procedimiento de disección. El tejido vascular es sustancialmente más elástico que las vías respiratorias, por lo que el uso de fórceps para estirar el tejido es a menudo un fuerte indicador de si una muestra en particular es vascula...

Aquí se presenta un protocolo para el aislamiento del tejido pulmonar descelularizado regional. Este protocolo proporciona una poderosa herramienta para estudiar las complejidades en la matriz extracelular y las interacciones célula-matriz.

Disección y aislamiento de tejido pulmonar descelularizado específico de la región

Lung transplantation is often the only option for patients in the later stages of severe lung disease, but this is limited both due to the supply of ...

Los órganos descelularizados se utilizan continuamente en una variedad de aplicaciones de ingeniería de tejidos. Sin embargo, la mayoría de estos estudios consideran el órgano como un todo y no las regiones anatómicas individuales. Desarrollamos este método para observar regiones anatómicas individuales de pulmones humanos descelularizados para sistemas modelo más precisos para aplicaciones posteriores.Al desarrollar sistemas modelo, es importante considerar diferentes aspectos de diseño para que su sistema recapitule mejor la biología normal. Para el pulmón, esto incluye factores como el estrés ambiental, el estrés mecánico cíclico y la elasticidad, que pueden diferir entre regiones independientes del pulmón. Utilizando este método, hemos podido demostrar que la matriz extracelular derivada de regiones pulmonares anatómicas individuales de pulmones sanos y enfermos tiene distintas firmas proteómicas.Esto nos permite comprender mejor la enfermedad pulmonar y potencialmente encontrar nuevas vías terapéuticas. Para continuar con esta investigación, nuestro laboratorio está desarrollando actualmente hidrogeles tridimensionales a partir de una matriz extracelular pulmonar sana y enferma. Estos hidrogeles nos permiten realizar modelos de organoides in vitro para dilucidar el papel de las interacciones de la matriz extracelular en el comportamiento celular correspondiente.

dissection-and-isolation-of-region-specific-decellularized-lung-tissue

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Hemos desarrollado una matriz extracelular y de pulmón descelularizada biorreactor novela biomiméticos que se puede utilizar para generar tejido pulmonar funcional. Por la siembra de las células en la matriz y el cultivo en el biorreactor, que generan tejido que demuestra el intercambio de gases eficaz cuando se trasplantan en vivo por periodos cortos de tiempo.

Procedimiento para la Ingeniería de pulmón

Una preparación altamente purificada de células dendríticas del pulmón del ratón se describe. Especial énfasis se da al aislamiento de subgrupo de células dendríticas convencionales.

Aislamiento de células dendríticas del pulmón de ratón

Este video muestra un método de producción de andamios de matriz extracelular descelularizada o ECM mediante la aplicación de perfusión anterógrada de detergentes a través de la vasculatura. Los andamios estructurales de la MEC se pueden utilizar para analizar la remodelación de la MEC asociada a la enfermedad cardiopulmonar.

Descelularización del complejo cardiopulmonar: una técnica para descelularizar el corazón y los pulmones a partir de un modelo murino

La descelularización de todo el órgano produce andamios biológicos naturales que pueden ser utilizados para la medicina regenerativa. Se presenta la descripción de un modelo de regeneración pulmonar en primates no humanos en el que se descelularizan pulmones completos y luego se siembran con células madre adultas y células endoteliales en un biorreactor que facilita la circulación vascular y la ventilación de medios líquidos.

Descelularización y recelularización pulmonar de primates no humanos mediante un biorreactor especializado de órganos grandes

Este protocolo dirige eficientemente madre embrionarias de ratón endodermo definitivo derivado de las células de las vías respiratorias para madurar las células epiteliales. Esta técnica utiliza la diferenciación 3 dimensiones andamios pulmonares descelularizados para dirigir especificación linaje de pulmón, en un entorno de cultivo definido, libre de suero.

Generación de células epiteliales de las vías respiratorias del ratón ESC-Obtenido usando Descelularizado pulmón andamios

Aquí, presentamos un protocolo para un ex vivo lung cáncer modelo que imita los pasos de progresión del tumor y ayuda a aislar un tumor primario, circulación de las células tumorales y las lesiones metastáticas.

Modelo de pulmón acelular y celular para el estudio de metástasis de Tumor

Este protocolo tiene como objetivo descelularizar el corazón y los pulmones de los ratones. Los andamios de matriz extracelular (ECM) resultantes pueden ser inmunoteñidos y fotografiados para mapear la ubicación y la topología de sus componentes.

Descelularización del complejo cardiopulmonar murino

Este protocolo describe un método para generar tejidos pulmonares reproducibles y diseñados a pequeña escala, mediante la repoblación de rodajas pulmonares descelularizadas cortadas con precisión con células epiteliales alveolares tipo 2, fibroblastos y células endoteliales.

Tejidos pulmonares diseñados preparados a partir de rodajas pulmonares descelularizadas

El protocolo dilucida dos metodologías de descelularización distintas aplicadas a los tejidos pulmonares bovinos nativos, proporcionando una descripción completa de sus respectivas caracterizaciones.

Desarrollo y caracterización de hidrogeles de matriz extracelular pulmonar descelularizada

Este artículo describe cómo crear pulmones de ratón de bioingeniería utilizando métodos de descelularización y recelularización. También se detalla el posterior trasplante ortotópico de pulmón.

Trasplante de pulmón de bioingeniería utilizando pulmones de ratón descelularizados y células endoteliales humanas primarias

El protocolo que se describe a continuación es una forma sencilla y eficaz de aislar células que contienen retinoides de poblaciones de células pulmonares muy heterogéneas mediante el uso de la autofluorescencia de retinoides específicos y el empleo de la clasificación de células activadas por fluorescentes.

Aislamiento de células que contienen retinoides pulmonares mediante clasificación celular

Aprende a aislar tejido pulmonar descelularizado por regiones anatómicas específicas. Este método permite analizar la matriz extracelular y sus firmas proteómicas distintivas en pulmones sanos y enfermos.

Disección y aislamiento de tejido pulmonar descelularizado específico de la región

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