Name: Generación y manipulación de organoides intestinales de rata (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T12:55:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Aprende a generar organoides intestinales de rata con cultivo a largo plazo y manipulación genética mediante infección lentiviral y transfección transitoria. Este modelo robusto facilita estudios de biología intestinal con relevancia fisiológica humana.

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Agradecemos a los miembros de los laboratorios Sumigray y Ameen por sus reflexivas discusiones. Este trabajo fue apoyado por una beca de salud infantil de la Fundación Charles H. Hood y una subvención de la Fundación de Fibrosis Quística (004741P222) a KS y por el Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales de los Institutos Nacionales de Salud a NA bajo el número de adjudicación 2R01DK077065-12.

Aislamiento de criptas intestinales de ratas y generación de organoides intestinales

<ol><li>Beumer, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fate+specification+and+differentiation+in+the+adult+mammalian+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+BiologyI%22%5BJournal%5D)">Cell fate specification and differentiation in the adult mammalian intestine.</a> Nature Reviews. Molecular Cell BiologyI. 22 (1), 39-53 (2021).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Yin, Y. -B., de Jonge, H. R., Wu, X., Yin, Y. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteroids+for+nutritional+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Nutrition+%26+Food+Research%22%5BJournal%5D)">Enteroids for nutritional studies.</a> Molecular Nutrition & Food Research. 63 (16), 1801143(2019).</li>
<li>Cai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+six+common+dietary+nutrients+on+murine+intestinal+organoid+growth%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Effects of six common dietary nutrients on murine intestinal organoid growth.</a> PLoS One. 13 (2), e0191517(2018).</li>
<li>Davoudi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+Organoid+as+a+new+platform+to+study+alginate+and+chitosan+mediated+PLGA+nanoparticles+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Drugs%22%5BJournal%5D)">Gut Organoid as a new platform to study alginate and chitosan mediated PLGA nanoparticles for drug delivery.</a> Marine Drugs. 19 (5), 282(2021).</li>
<li>Vlachogiannis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+model+treatment+response+of+metastatic+gastrointestinal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers.</a> Science. 359 (6378), 920-926 (2018).</li>
<li>Yin, Y. B., de Jonge, H. R., Wu, X., Yin, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mini-gut%3A+a+promising+model+for+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Mini-gut: a promising model for drug development.</a> Drug Discovery Today. 24 (9), 1784-1794 (2019).</li>
<li>Zietek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+to+study+intestinal+nutrient+transport%2C+drug+uptake+and+metabolism+-+update+to+the+human+model+and+expansion+of+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Organoids to study intestinal nutrient transport, drug uptake and metabolism - update to the human model and expansion of applications.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 577656(2020).</li>
<li>Gunther, C., Winner, B., Neurath, M. F., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+in+gastrointestinal+diseases%3A+from+experimental+models+to+clinical+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Organoids in gastrointestinal diseases: from experimental models to clinical translation.</a> Gut. 71 (9), 1892-1908 (2022).</li>
<li>Pleguezuelos-Manzano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+culture+of+human+intestinal+organoids+derived+from+adult+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells.</a> Current Protocols in Immunology. 130 (1), 106(2020).</li>
<li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Organoids.</a> Nature Reviews Methods Primers. 2 (1), 94(2022).</li>
<li>Powell, R. H., Behnke, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WRN+conditioned+media+is+sufficient+for+in+vitro+propagation+of+intestinal+organoids+from+large+farm+and+small+companion+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">WRN conditioned media is sufficient for in vitro propagation of intestinal organoids from large farm and small companion animals.</a> Biology Open. 6 (5), 698-705 (2017).</li>
<li>Fagerholm, U., Johansson, M., Lennernas, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+between+permeability+coefficients+in+rat+and+human+jejunum%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison between permeability coefficients in rat and human jejunum.</a> Pharmaceutical Research. 13 (9), 1336-1342 (1996).</li>
<li>Dubbelboer, I. R., Dahlgren, D., Sjogren, E., Lennernas, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+intestinal+drug+permeability%3A+A+status+report+and+summary+of+repeated+determinations%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Rat intestinal drug permeability: A status report and summary of repeated determinations.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 142, 364-376 (2019).</li>
<li>Bryda, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mighty+Mouse%3A+the+impact+of+rodents+on+advances+in+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Missouri+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Mighty Mouse: the impact of rodents on advances in biomedical research.</a> Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).</li>
<li>Zhang, Z., Carriero, N., Gerstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+processed+pseudogenes+in+the+mouse+and+human+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of processed pseudogenes in the mouse and human genomes.</a> Trends in Genetics. 20 (2), 62-67 (2004).</li>
<li>Lambracht-Washington, D., Fischer Lindahl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+MHC+class+Ib+genes+in+rat+are+pseudogenes+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Immunogenetics%22%5BJournal%5D)">Active MHC class Ib genes in rat are pseudogenes in the mouse.</a> Immunogenetics. 56 (2), 118-121 (2004).</li>
<li>Busslinger, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gastrointestinal+epithelia+of+the+esophagus%2C+stomach%2C+and+duodenum+resolved+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Human gastrointestinal epithelia of the esophagus, stomach, and duodenum resolved at single-cell resolution.</a> Cell Reports. 34 (10), 108819(2021).</li>
<li>Burclaff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proximal-to-distal+survey+of+healthy+adult+human+small+intestine+and+colon+epithelium+by+single-cell+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">A proximal-to-distal survey of healthy adult human small intestine and colon epithelium by single-cell transcriptomics.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 13 (5), 1554-1589 (2022).</li>
<li>Haber, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+survey+of+the+small+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single-cell survey of the small intestinal epithelium.</a> Nature. 551 (7680), 333-339 (2017).</li>
<li>Olivier, A. K., Gibson-Corley, K. N., Meyerholz, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+gastrointestinal+and+liver+diseases.+Animal+models+of+cystic+fibrosis%3A+gastrointestinal%2C+pancreatic%2C+and+hepatobiliary+disease+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Animal models of gastrointestinal and liver diseases. Animal models of cystic fibrosis: gastrointestinal, pancreatic, and hepatobiliary disease and pathophysiology.</a> American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 308 (6), G459-G471 (2015).</li>
<li>Lu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+gastrointestinal+and+liver+diseases.+Animal+models+of+necrotizing+enterocolitis%3A+pathophysiology%2C+translational+relevance%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Animal models of gastrointestinal and liver diseases. Animal models of necrotizing enterocolitis: pathophysiology, translational relevance, and challenges.</a> American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 306 (11), G917-G928 (2014).</li>
<li>Fujii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+intestinal+organoids+maintain+self-renewal+capacity+and+cellular+diversity+in+niche-inspired+culture+condition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).</li>
<li>Hedrich, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+rat+duodenal+organoids+for+ADME+and+toxicology+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of rat duodenal organoids for ADME and toxicology applications.</a> Toxicology. 446, 152614(2020).</li>
<li>How to Cryopreserve Intestinal Organoids. STEMCELL. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.stemcell.com/technical-resources/area-of-interest/organoid-research/intestinal-research/tech-tips-protocols/how-to-cryopreserve-intestinal-organoids.html">https://www.stemcell.com/technical-resources/area-of-interest/organoid-research/intestinal-research/tech-tips-protocols/how-to-cryopreserve-intestinal-organoids.html</a> (2023).</li>
<li>How to Thaw Intestinal Organoids. STEMCELL. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.stemcell.com/technical-resources/educational-materials/protocols/how-to-thaw-intestinal-organoids.html">https://www.stemcell.com/technical-resources/educational-materials/protocols/how-to-thaw-intestinal-organoids.html</a> (2023).</li>
<li>Sancak, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rag+GTPases+bind+raptor+and+mediate+amino+acid+signaling+to+mTORC1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Rag GTPases bind raptor and mediate amino acid signaling to mTORC1.</a> Science. 320 (5882), 1496-1501 (2008).</li>
<li>Van Lidth de Jeude, J. F., Vermeulen, J. L., Montenegro-Miranda, P. S., Vanden Brink, G. R., Heijmans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+lentiviral+transduction+and+downstream+analysis+of+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A protocol for lentiviral transduction and downstream analysis of intestinal organoids.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), e52531(2015).</li>
<li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forskolin-induced+swelling+in+intestinal+organoids%3A+an+in+vitro+assay+for+assessing+drug+response+in+cystic+fibrosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Forskolin-induced swelling in intestinal organoids: an in vitro assay for assessing drug response in cystic fibrosis patients.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), e55159(2017).</li>
<li>Regent, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinamide+promotes+formation+of+retinal+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+via+enhanced+neural+cell+fate+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Nicotinamide promotes formation of retinal organoids from human pluripotent stem cells via enhanced neural cell fate commitment.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 16, 878351(2022).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Breau, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transgenesis+and+homology-directed+gene+targeting+in+monolayers+of+primary+human+small+intestinal+and+colonic+epithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient transgenesis and homology-directed gene targeting in monolayers of primary human small intestinal and colonic epithelial stem cells.</a> Stem Cell Reports. 17 (6), 1493-1506 (2022).</li>
<li>Berkers, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rectal+organoids+enable+personalized+treatment+of+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Rectal organoids enable personalized treatment of cystic fibrosis.</a> Cell Reports. 26 (7), 1701-1708 (2019).</li>
<li>deWinter-de Groot, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forskolin-induced+swelling+of+intestinal+organoids+correlates+with+disease+severity+in+adults+with+cystic+fibrosis+and+homozygous+F508del+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cystic+Fibrosis%22%5BJournal%5D)">Forskolin-induced swelling of intestinal organoids correlates with disease severity in adults with cystic fibrosis and homozygous F508del mutations.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 19 (4), 614-619 (2020).</li>
<li>Dekkers, J. F., vander Ent, C. K., Beekman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+opportunities+for+CFTR-targeting+drug+development+using+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Rare+Diseases%22%5BJournal%5D)">Novel opportunities for CFTR-targeting drug development using organoids.</a> Rare Diseases. 1, 27112(2013).</li>
<li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+CFTR+assay+using+primary+cystic+fibrosis+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids.</a> Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).</li>
<li>van Mourik, P., Beekman, J. M., vander Ent, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+organoids+to+model+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Intestinal organoids to model cystic fibrosis.</a> European Respiratory Journal. 54 (1), 1802379(2019).</li>
<li>Tong, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+of+artificial+virus-like+nanocarriers+through+intestinal+monolayers+via+microfold+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Transport of artificial virus-like nanocarriers through intestinal monolayers via microfold cells.</a> Nanoscale. 12 (30), 16339-16347 (2020).</li>
<li>Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+and+genetic+modification+of+gastrointestinal+stem+cells+in+spheroid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture.</a> Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).</li>
<li>Ootani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+in+vitro+intestinal+epithelial+culture+within+a+Wnt-dependent+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche.</a> Nature Medicine. 15 (6), 701-706 (2009).</li>
<li>Xu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+development+in+the+retina+and+inner+ear%3A+control+by+Norrin+and+Frizzled-4%2C+a+high-affinity+ligand-receptor+pair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Vascular development in the retina and inner ear: control by Norrin and Frizzled-4, a high-affinity ligand-receptor pair.</a> Cell. 116 (6), 883-895 (2004).</li>
<li>Jabaji, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+collagen+as+an+extracellular+matrix+for+the+in+vitro+growth+of+human+small+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Type I collagen as an extracellular matrix for the in vitro growth of human small intestinal epithelium.</a> PLoS One. 9 (9), e107814(2014).</li>
<li>Sachs, N., Tsukamoto, Y., Kujala, P., Peters, P. J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+organoids+fuse+to+form+self-organizing+tubes+in+floating+collagen+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial organoids fuse to form self-organizing tubes in floating collagen gels.</a> Development. 144 (6), 1107-1112 (2017).</li>
<li>Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+alternatives+to+Matrigel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Materials%22%5BJournal%5D)">Synthetic alternatives to Matrigel.</a> Nature Reviews Materials. 5 (7), 539-551 (2020).</li>
</ol>

El desarrollo de un modelo de organoide intestinal de rata conserva importantes características funcionales que se encuentran en el órgano in vivo y es una herramienta prometedora para las pruebas preclínicas, el cribado de fármacos y los ensayos funcionales. Este modelo in vitro puede ser utilizado en paralelo a los estudios preclínicos de gastroenterología in vivo , para los cuales las ratas suelen ser un modelo preferido debido a su mayor tamaño intestinal, aspectos fisiológicos compartidos con los humanos y, en algunos casos, por ser mejores modelos de enfermedad38. Aquí, se describe un sólido protocolo paso a paso para el aislamiento de criptas intestinales de ratas, la generación y el cultivo a largo plazo de organoides intestinales de ratas, así como aplicaciones posteriores que incluyen ensayos de hinchazón funcional de forskolina, inmunofluorescencia de montaje completo, cultivo de monocapa 2D y manipulación genética lentiviral. Es probable que los organoides intestinales de rata sean relevantes en muchos contextos de enfermedad en los que la fisiopatología de los modelos de ratón es inapropiada y pueden proporcionar un mejor modelo para la fisiología intestinal humana en comparación con los organoides intestinales de ratón.
Para establecer cultivos organoides de larga vida que puedan ser transitados y expandidos, es esencial identificar los factores de crecimiento clave necesarios para mantener la proliferación epitelial intestinal. Los organoides de ratón se cultivan con mayor frecuencia en un cóctel simple de EGF, R-espondina y Noggin, aunque se ha informado que Noggin no es necesario para el cultivo de organoides intestinales39. Los medios acondicionados pueden reemplazar los factores de crecimiento recombinantes y las líneas celulares más utilizadas son L-WRN, que secreta Wnt3a, Rspondin-3 y Noggin39, L-Wnt3a y HA-Rspondin1-Fc 293Tcells 40. Los medios acondicionados con L-WRN son suficientes para apoyar no solo el crecimiento de organoides intestinales de ratón39 , sino también el crecimiento de organoides intestinales de varios animales de granja y animales de compañía, incluidos perros, gatos, pollos, caballos, vacas, ovejas y cerdos12. Sin embargo, los organoides intestinales humanos son muy diferentes en sus requerimientos de factores de crecimiento, ya que requieren formulaciones de medios distintas para su fase de crecimiento de expansión (es decir, la progresión de esferoides pequeños a grandes) frente a su fase de diferenciación (es decir, la generación y maduración de tipos celulares diferenciados)10. Los requisitos de medios de los organoides intestinales de rata son muy similares a los de los medios de crecimiento de expansión para los organoides intestinales humanos, sin embargo, en particular, los organoides de rata son capaces tanto de crecer como de diferenciarse en este entorno de medios, lo que simplifica considerablemente sus requisitos de cultivo. Si bien nuestros intentos iniciales se centraron en establecer y cultivar organoides intestinales de rata en medios acondicionados con L-WRN, el cultivo a largo plazo fue tenue y las líneas de organoides intestinales de rata sufrieron una falta de robustez (datos no mostrados). Esto puede deberse a que las líneas celulares L-WRN están diseñadas para secretar R-espondina 3, mientras que la línea celular 293T-Rspo1 recomendada aquí está diseñada para secretar R-espondina 1. Es posible que los organoides de ratas y humanos prefieran la R-espondina 1, lo que podría explicar el fracaso de las líneas de organoides de rata en medios acondicionados con L-WRN.
Para recapitular de la manera más cercana posible el entorno in vivo , es importante desarrollar condiciones de cultivo de organoides que permitan la supervivencia, el mantenimiento y la proliferación de las células madre, y que puedan mantener el recambio celular y los eventos de diferenciación simultáneos en tipos celulares discretos. Por lo tanto, las concentraciones de proteínas recombinantes y/o proteínas en medios acondicionados deben ser ajustadamente tituladas y controladas para lograr este equilibrio perfecto. En particular, los niveles óptimos de Wnt son esenciales para evitar la pérdida de cultivos de organoides intestinales. Muy poco Wnt en medios acondicionados será incapaz de soportar el crecimiento, lo que conducirá a una pérdida de células madre y la posterior muerte de organoides; La sobreactivación de Wnt hará que los organoides sean quísticos e indiferenciados10. Si bien no se detalla aquí, se recomienda encarecidamente probar cada lote de medios acondicionados L-Wnt3a y 293T-Rspo1 utilizando un ensayo de luciferasa reportera Wnt, como una línea celular Topflash41. Estudios anteriores han descrito que un lote óptimo de medios L-Wnt3a debería dar como resultado un aumento de la señal de 15 veces al 12,5% y un aumento de la señal de 300 veces al 50%, en comparación con el 1% de L-Wnt3a10. Dado que los organoides de rata son más sensibles que los organoides de ratón a los requisitos de cultivo, en particular a los niveles de activación de Wnt, estos pasos adicionales de control de calidad ayudan en gran medida a facilitar la robustez y fiabilidad de los cultivos de organoides de rata. Debido a que no se dispone de una línea reportera similar para analizar la actividad de Bmp y las concentraciones relativas de Noggin en medios acondicionados de Noggin, se recomienda utilizar Noggin recombinante cuando sea posible para controlar con precisión los niveles de Noggin. Si bien los organoides intestinales de ratón pueden cultivarse y mantenerse en ausencia de Noggin39, esto no se ha intentado para los cultivos de organoides intestinales de rata.
Más allá de los requisitos de cultivo celular, el establecimiento inicial exitoso de una línea de organoides de rata depende críticamente del agotamiento eficiente de las vellosidades diferenciadas durante el aislamiento de la cripta. Los altos niveles de contaminación de villar causan la muerte de las criptas, presumiblemente debido a las señales de las células moribundas o al secuestro de factores esenciales. Para agotar estas vellosidades diferenciadas de las preparaciones epiteliales de manera precisa y consistente, se recomienda realizar aislamientos epiteliales con la ayuda de un estereoscopio. El examen visual del epitelio que se libera proporciona una indicación clara de cuándo desechar el PBS y reemplazarlo (Figura 1). Las criptas no deben recolectarse hasta que haya suficiente agotamiento de vellosidades. Las células de Villar están diferenciadas terminalmente y no pueden generar organoides en cultivo. Además, el paso posterior de organoides intestinales de rata y su uso para cualquier aplicación posterior requiere un cuidado delicado. La incubación en reactivos de disociación durante períodos de tiempo más largos (10 min) da como resultado una muerte celular significativa y la pérdida de la línea de organoides.
Aquí se describe un protocolo simple y rápido para generar monocapas intestinales a partir de organoides de rata. Los sustratos de EME y colágeno I tienen diferentes efectos sobre el epitelio, que pueden aprovecharse según el propósito del estudio. La EME permite la adhesión rápida y eficiente de células individuales y la formación de proyecciones celulares. Por el contrario, recubrir la superficie con colágeno I retrasa estos procesos. Una vez que las monocapas alcanzan aproximadamente el 80% de confluencia, las células cultivadas en EME comienzan a generar estructuras organoides 3D nuevamente. Sin embargo, carecen de suficiente apoyo físico y químico para un crecimiento continuo. Esta reversión al estado organoide puede evitarse manteniendo las monocapas en EME a una confluencia del 50%-80%. La adición de EME diluido a la superficie apical de las monocapas promueve la rápida recuperación y formación de organoides de novo, generando regiones de convergencia de forma más rápida y rápida. En una superficie de colágeno I, las células pueden formar una monocapa uniforme y generar pequeños grupos. Sin embargo, la adición de colágeno I sobre monocapas no es suficiente para inducir la formación de organoides. La EME debe diluirse cuando se agrega a la superficie de la monocapa, ya que habrá una resistencia mecánica más fuerte para que el organoide naciente la supere. Sin embargo, esta EME diluida no permite la formación robusta de grandes organoides. Cualquier organoide de rata generado de novo que se desprenda naturalmente de la superficie debe eliminarse inmediatamente y transferirse a EME sin diluir para que se pueda restaurar el soporte estructural y el crecimiento. Debido al pequeño tamaño de los organoides en este paso, no se recomienda el paso de organoides hasta que se haya establecido un crecimiento robusto. No está claro el significado biológico subyacente de por qué la EME puede apoyar la reforma de los organoides, pero no está claro si el colágeno I puede o no puede hacerlo. Sin embargo, ha habido informes de que las células cultivadas en colágeno 3D no pueden formar organoides en brotes42,43 o apoyar el mantenimiento a largo plazo. Los productos EME disponibles en el mercado son mezclas heterogéneas de proteínas extracelulares, principalmente laminina y colágeno IV44. Por lo tanto, la composición distinta de las proteínas y la capacidad de una célula epitelial para interactuar con la matriz extracelular utilizando diferentes complejos celulares podrían permitir la remodelación en EME pero no en el colágeno I. No se ha probado si las monocapas derivadas del colágeno I se pueden poner en EME para apoyar la formación y el crecimiento de organoides.
Aquí se describe la manipulación genética del modelo de organoide intestinal de rata, y se describen los protocolos para la transducción lentiviral de organoides 3D y la transfección transitoria de monocapas 2D. Para superar la baja eficiencia de la transducción de organoides lentivirales, se desarrolló un protocolo para la transfección transitoria de monocapas 2D. La morfología plana y los dominios apicales expuestos de las monocapas proporcionan un acceso más fácil a los virus y a los complejos que contienen ADN. Para la validación de esta técnica se utilizó la expresión de un reportero de EGFP utilizando el vector pLJM1-EGFP. La expresión del GFP reportero se observó después de 24 h, y se mantuvo durante 5-6 días en monocapas. Es probable que los estudios futuros centrados en la transducción lentiviral de monocapas tengan una mayor eficiencia que la transducción de organoides 3D. Utilizando los protocolos anteriores, los organoides 3D pueden reformarse a partir de monocapas 2D infectadas para facilitar la creación de líneas estables. Con cuidado, las líneas de organoides intestinales de rata se pueden mantener con éxito durante más de un año, permaneciendo estables en muchos pasajes, criopreservadas, descongeladas con éxito y modificadas genéticamente mediante transducción lentiviral, abordando así la necesidad de un modelo de organoide intestinal in vitro accesible y manejable que conserve la relevancia fisiológica para los seres humanos.

La arquitectura epitelial del intestino delgado humano y su composición celular son complejas, lo que refleja sus funciones fisiológicas. La función principal del intestino delgado es absorber los nutrientes de los alimentos que pasan a través de su lumen1. Para maximizar esta función, la superficie intestinal se organiza en protuberancias en forma de dedos llamadas vellosidades, que aumentan el área de superficie de absorción, e invaginaciones en forma de copa llamadas criptas, que albergan y aíslan las células madre. Dentro del epitelio, se generan varios tipos de células absorbentes y secretoras especializadas para realizar distintas funciones1. Debido a esta complejidad, ha sido difícil modelar tejidos como el intestino en líneas celulares inmortalizadas transformadas de alto paso. Sin embargo, el estudio de las células madre, especialmente las células madre adultas y sus mecanismos de diferenciación, ha permitido el desarrollo de cultivos de organoides intestinales en 3D. El uso de modelos organoides ha transformado el campo, en parte debido a su recapitulación de algunos componentes arquitectónicos y la heterogeneidad del tipo de célula que se encuentra en el intestino intacto. Los organoides intestinales pueden ser cultivados in vitro a largo plazo debido al mantenimiento de la población activa de células madre2.
Los organoides intestinales se han convertido rápidamente en un modelo adaptable para estudiar la biología de las células madre, la fisiología celular, las enfermedades genéticas y la nutrición3,4, así como en una herramienta para desarrollar nuevos métodos de administración de fármacos5. Además, los organoides derivados de pacientes se están utilizando para el modelado de enfermedades, el descubrimiento de fármacos y la detección de tratamientos personalizados, entre otros 6,7,8,9. Sin embargo, los organoides intestinales humanos aún presentan desafíos. La disponibilidad de tejidos, los requisitos para la aprobación de la Junta de Revisión Institucional y las cuestiones éticas limitan el uso generalizado de muestras humanas. Además, los organoides intestinales humanos generados a partir de criptas intestinales requieren dos condiciones de cultivo distintas para el mantenimiento de células madre indiferenciadas o para inducir la diferenciación de tipos celulares maduros10. Esto contrasta con el in vivo, donde las células madre y los tipos de células maduras diferenciadas están presentes simultáneamente y se generan/mantienen continuamente1. Por otro lado, los organoides intestinales de ratón, que se cultivan en un cóctel menos complejo de factores de crecimiento, no requieren este cambio en la composición del medio y pueden mantener las células madre y las células diferenciadas en el mismo contexto del medio 2,11. Sin embargo, las diferencias clave en el intestino del ratón en comparación con los humanos pueden hacer que los organoides del ratón sean un modelo subóptimo en muchos casos. En general, muchos organoides intestinales de mamíferos más grandes, incluidos caballos, cerdos, ovejas, vacas, perros y gatos, se han generado con éxito en condiciones de cultivo más estrechamente alineadas con los organoides intestinales de ratón que las condiciones de cultivo de organoides intestinales humanos12. Las diferencias en las condiciones del factor de crecimiento entre los organoides de ratón y humanos probablemente reflejan diferencias en la composición del nicho de células madre y diferentes requisitos para la supervivencia, proliferación y mantenimiento de las células madre. Por lo tanto, existe la necesidad de un sistema organoide modelo de fácil acceso que 1) se parezca mucho a la composición de las células intestinales humanas, 2) contenga células madre con requisitos de factor de crecimiento como los de los organoides intestinales humanos, y 3) sea capaz de mantener continuamente compartimentos indiferenciados y diferenciados. Idealmente, el sistema sería a partir de un modelo animal preclínico de uso común, de modo que los experimentos in vivo e in vitro puedan correlacionarse y usarse en tándem.
Las ratas son un modelo preclínico comúnmente utilizado para estudios de fisiología intestinal y farmacología debido a su fisiología intestinal y bioquímica muy similares a las humanas13, particularmente en lo que respecta a la permeabilidad intestinal14. Su tamaño relativamente más grande en comparación con los ratones los hace más susceptibles a los procedimientos quirúrgicos. Si bien a veces se utilizan modelos de animales grandes, incluidos los cerdos, las ratas son un modelo más asequible, requieren menos espacio para la cría y tienen cepas estándar fácilmente disponibles comercialmente15. Un inconveniente del uso de modelos de ratas es que el conjunto de herramientas genéticas para estudios in vivo no está bien desarrollado en comparación con los ratones, y la generación de nuevas líneas de ratas, incluidos knockouts, knock-ins y transgénicos, a menudo tiene un costo prohibitivo. El desarrollo y la optimización de un modelo robusto de organoide intestinal de rata permitiría la manipulación genética, los tratamientos farmacológicos y los estudios de mayor rendimiento en un modelo accesible que conserva una relevancia fisiológica clave para los seres humanos. Sin embargo, las ventajas de un modelo de organoide de roedores frente a otro dependen en gran medida del proceso o gen particular que se esté estudiando; Ciertos genes que se encuentran en los seres humanos pueden ser pseudogenes en ratones, pero no en ratas16,17. Además, los subtipos celulares específicos de la especie están siendo revelados cada vez más por RNAseq18,19,20 de una sola célula. Por último, los modelos de enfermedades intestinales en ratas y ratones a menudo muestran variaciones considerables en los fenotipos21,22, de modo que el modelo que recapitula más fielmente los síntomas y el proceso de la enfermedad observado en los seres humanos debe seleccionarse para el trabajo posterior. La generación de un modelo de organoide intestinal de rata proporciona flexibilidad y opciones adicionales para los investigadores a la hora de seleccionar el sistema modelo más apropiado para sus circunstancias. Aquí, se amplían los protocolos existentes23,24 para la generación de organoides intestinales de rata y se esboza un protocolo para la generación y mantenimiento de organoides intestinales de rata a partir del duodeno o yeyuno. Además, se describen varias aplicaciones posteriores, como la infección lentiviral, la tinción de montaje completo y los ensayos de hinchazón por forskolina.

<table><tbody><tr><td>Matriz de cultivo 3-D Colágeno de rata I</td><td>Cultrex/R& D Sistemas</td><td>3447-020-01</td><td></td></tr><tr><td>70 y micro; filtro de células m</td><td>Corning/Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Gibco/Thermo Fisher</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>Anfotericina B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2942-20ML</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Suplemento (50X), sin suero</td><td>Thermo Fisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Cayman Chemical</td><td>13122</td><td></td></tr><tr><td>CryoStor</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>100-1061</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex HA-Rspondin1-Fc 293T</td><td>células R & D Systems</td><td>3710-001-01</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco/Thermo Fisher</td><td>16-000-044</td><td></td></tr><tr><td>Gastrin I (humano)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9145</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de disociación celular suave</td><td>Tecnologías de células madre</td><td>100-0485</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermo Fisher</td><td>35-050-061</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel reducido en factor de crecimiento, sin fenol</td><td>rojo Corning</td><td></td><td></td>356231</tr><tr><td>HEPES</td><td>AmericanBio AB06021</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lanolina</td><td>Beantown Químico</td><td>144255-250G</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco/Thermo Fisher</td><td>A2916801</td><td></td></tr><tr><td>células L-Wnt3a</td><td>ATCC</td><td>CRL-2647</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Suplemento (100X)</td><td>Thermo Fisher</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>N-acetilcisteína</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamida &nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Medio de suero reducido</td><td>Gibco/Thermo Fisher</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Parafina</td><td>Fisher Scientific</td><td>P31-500</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7793</td><td>película transparente</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Fisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Gibco/Thermo Fisher</td><td></td><td></td>15140122</tr><tr><td>pLJM1-EGFP</td><td>Addgene</td><td>19319</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de polietilenimina (PEI)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>764965</td><td></td></tr><tr><td>p-fenilendiamina&nbsp;</td><td>Acros Organics/Thermo Fisher</td><td>417481000</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>VWR</td><td>J593-25mg</td><td></td></tr><tr><td>Proteína FGF2 humana recombinante</td><td>Peprotech</td><td>100-18B-250ug</td><td></td></tr><tr><td>Proteína IGF-1 humana recombinante</td><td>Biolegend</td><td>B356441</td><td></td></tr><tr><td>Proteína Noggin humana recombinante</td><td>R & D Systems</td><td>6057-NG-100</td><td></td></tr><tr><td>Proteína EGF recombinante de ratón</td><td>Thermo Fisher</td><td>PMG8041</td><td></td></tr><tr><td>Sprague Rata Dawley</td> Charles <td>River Laboratories</td><td>Cepa 001</td><td></td></tr><tr><td>Tritón X-100</td><td>Bioanalítico Americano</td><td>AB02025-00500</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzima</td><td>Gibco/Thermo Fisher</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>Y27632 diclorhidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr></tbody></table>

generación y manipulación de organoides intestinales de rata

Generation and Manipulation of Rat Intestinal Organoids

Cuando se utilizan organoides para evaluar la fisiología y las decisiones sobre el destino celular, es importante utilizar un modelo que recapitule estrechamente los contextos in vivo . En consecuencia, los organoides derivados del paciente se utilizan para el modelado de enfermedades, el descubrimiento de fármacos y la detección de tratamientos personalizados. Los organoides intestinales de ratón se utilizan comúnmente para comprender aspectos tanto de la función/fisiología intestinal como de la dinámica/decisión de destino de las células madre. Sin embargo, en muchos contextos de enfermedades, a menudo se prefieren las ratas a los ratones como modelo debido a su mayor similitud fisiológica con los humanos en términos de fisiopatología de la enfermedad. El modelo de rata se ha visto limitado por la falta de herramientas genéticas disponibles in vivo, y los organoides intestinales de rata han demostrado ser frágiles y difíciles de cultivar a largo plazo. Aquí, nos basamos en protocolos publicados anteriormente para generar organoides intestinales de ratas de forma robusta a partir del duodeno y el yeyuno. Proporcionamos una visión general de varias aplicaciones posteriores que utilizan organoides intestinales de ratas, incluidos los ensayos de hinchazón funcional, la tinción de montaje completo, la generación de monocapas enteroides, 2D y la transducción lentiviral. El modelo de organoide de rata proporciona una solución práctica a la necesidad del campo de un modelo in vitro que conserve la relevancia fisiológica para los seres humanos, que pueda manipularse genéticamente rápidamente y que se obtenga fácilmente sin las barreras involucradas en la obtención de organoides intestinales humanos.

Los organoides duodenales y yeyunales de rata se generaron utilizando el protocolo descrito en la sección 2. Es muy importante durante los pasos de aislamiento de la cripta que las vellosidades se agoten eficientemente del PBS. Si se siembran demasiadas vellosidades en el EME con criptas, puede causar la muerte de todo el cultivo y la imposibilidad de establecer una línea de organoide. Debido a esto, es útil aislar las criptas bajo un telescopio de disección, lo que permite la confirmación visual del agotamiento del villar. La Figura 1 muestra fragmentos y criptas representativas de villar (Figura 1A). Obsérvese el tamaño significativamente menor de las criptas en comparación con las vellosidades (Figura 1B). Después de la siembra, las criptas se expandirán en esferoides durante los próximos días y comenzarán a brotar y diferenciarse en el día 4-7 (Figura 2). Una vez que los organoides alcanzan una etapa de gemación extensa, deben ser dejados. Durante el paso, es importante alterar los organoides lo suficiente como para separar las yemas de la cripta, de modo que se pueda ampliar el número de organoides (Figura 3B).
La recuperación exitosa de los organoides después de la congelación depende en gran medida del estado en el que se congelan. Los organoides en estado indiferenciado altamente proliferativo se recuperan con la mayor eficiencia. Por lo tanto, recomendamos inducirlos para que sean esféricos y quísticos en lugar de gemados y diferenciados. Para lograr esto, Wnt puede ser hiperactivado aumentando la cantidad del ligando Wnt R-espondina en el medio e incluyendo nicotinamida en el medio, lo que ha demostrado apoyar la formación de organoides y la supervivencia celular en varios sistemas de cultivo30,31. La Figura 3A muestra un cultivo de organoides sano solo 2 días después de la descongelación. La inclusión de BSA en los medios durante la descongelación también ha ayudado a la supervivencia de los cultivos de organoides intestinales de ratas, que han demostrado ser más delicados que los organoides intestinales de ratones.
Si bien a menudo se prefiere el cultivo de organoides en 3D porque recapitula parte de la arquitectura intestinal normal, hace que otros enfoques, incluidas las imágenes en vivo, las transfecciones y las transducciones lentivirales, sean más desafiantes desde el punto de vista técnico. El uso de monocapas 2D generadas a partir de organoides3D 32 (Figura 4) permite una introducción más eficiente de los plásmidos. Mientras que los organoides intestinales 3D son tradicionalmente resistentes a las transfecciones transitorias, los plásmidos que codifican para el EGFP pueden introducirse con éxito utilizando métodos de transfección basados en lípidos. El enfoque más rentable que utiliza PEI se describe en el paso 6.1 (Figura 5), pero la electroporación y los reactivos de transfección disponibles comercialmente también han arrojado resultados comparables (datos no mostrados). Los estudios futuros se centrarán en si estos enfoques pueden utilizarse para introducir construcciones CRISPR en monocapas.
Era importante poder reformar organoides 3D a partir de monocapas 2D después de la transfección para que pudieran mantenerse como una línea transitable con componentes arquitectónicos 3D de las criptas. Curiosamente, las monocapas 2D colocadas en el EME se reformaron fácilmente en pequeños esferoides cuando se volvió a añadir el EME a la parte superior de las células, mientras que un sustrato de colágeno I no fue suficiente para la reformación de las estructuras 3D (Figura 6).
Si bien las transfecciones transitorias son útiles para muchos estudios, la formación de líneas estables suele ser más útil, ya que requiere la introducción de lentivirus en las células. Los organoides intestinales de ratas se infectaron con lentivirus modificando los protocolos publicados previamente (Figura 7). Un paso clave en el protocolo es la disrupción de organoides en pequeños agregados o grupos de células. Si los cultivos no se interrumpen de manera eficiente y los organoides permanecen intactos, las partículas lentivirales no entrarán en las células. Después de la infección, los organoides deben recuperarse y volver a crecer. El protocolo descrito aquí permite la absorción de partículas virales por parte del 10%-48% (media: 19,4% ± 6,5%) de las células antes de la selección.
La tinción de todo el montaje de organoides puede resultar difícil debido a la eliminación incompleta del residuo de EME o a la penetrancia incompleta de los anticuerpos. El protocolo descrito aquí permite la tinción robusta de organoides. La visualización de organoides en un microscopio confocal también puede resultar difícil si están demasiado lejos del cubreobjetos. Mediante el uso de VALAP, se crea un pocillo con cierta altura de modo que los organoides no sean aplastados por el cubreobjetos, sino que aún se permite que se asienten cerca del cubreobjetos para facilitar la obtención de imágenes. En la Figura 8 se muestra la tinción representativa contra el regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística del canal aniónico apical (CFTR) y la faloidina para marcar la F-actina.
Por último, los organoides tienen utilidad en ensayos funcionales. Los organoides derivados de pacientes con fibrosis quística se han utilizado para detectar la función de CFTR, ya que el tratamiento con el agonista del AMPc forskolina induce una secreción robusta de líquido mediada por CFTR, causando inflamación de los organoides 29,33-37. Uno de los objetivos de este trabajo fue identificar y desarrollar un modelo de organoide que pueda utilizarse en paralelo a los estudios preclínicos in vivo. Por lo tanto, nuestro objetivo fue determinar si los organoides intestinales de ratas experimentan hinchazón inducida por forskolina. De hecho, a los 30 minutos del tratamiento con forskolina, los organoides de rata se hincharon, con un efecto máximo observado a los 120 minutos (Figura 9).
<img alt="Interacción celular en imagen de microscopía que muestra protozoos que engullen bacterias, estudio de procesos biológicos." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: Fragmentos y criptas de Villar durante el aislamiento epitelial. (A) Imagen representativa de fragmentos de Villar en solución de EDTA durante el protocolo de aislamiento de criptas. Las puntas de flecha amarillas marcan los fragmentos de villar. Las flechas rojas representan criptas unidas a un fragmento de villar. Tenga en cuenta la diferencia en los tamaños relativos. (B) Imagen de mayor aumento de una sola cripta (flecha roja) para que se pueda visualizar la morfología. Barras de escala: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Imágenes de microscopía de desarrollo de organoides, día 0-7, que muestran progresión del crecimiento y cambios morfológicos." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2: Progresión de organoides intestinales de ratas. Las criptas de yeyuno de rata se sembraron en EME inmediatamente después del aislamiento (A,B). En 2 días, las criptas se convirtieron en esferoides (C,D). Para el día 5, comenzaron a iniciar brotes de cripta (E, F), que se elaboraron y crecieron en el día 7 (G). Barras de escala: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Imágenes de microscopía de cultivo celular que comparan la morfología 2 días después de la descongelación y después del paso; análisis." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3: Organoides después de la descongelación y el paso. (A) Los organoides yeyunales de rata se descongelaron siguiendo los protocolos descritos después de la criopreservación. Tenga en cuenta la presencia de esferoides y organoides gemados solo 2 días después de la descongelación. (B) La misma línea organoide representada en A inmediatamente después de la pasada siguiendo el protocolo descrito. Obsérvese la diferencia de tamaño relativo entre las estructuras de A y B y la presencia de dominios de una sola cripta en B. Barras de escala: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Migración celular a lo largo del tiempo en EME, Colágeno I; Imágenes de microscopio, 24h a 5D, resultados experimentales." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figura 4: Formación de monocapas 2D a partir de organoides 3D. (A-C) Progresión de monocapas 2D en EME. (D-F) Progresión de monocapa 2D sobre colágeno I. Para el día 5, cada condición produjo ~80% de confluencia. Barras de escala: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Imágenes de microscopía, visualización de pLJM1-EGFP; morfología celular, análisis de expresión de proteínas de fluorescencia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Figura 5: Transfección transitoria de una monocapa 2D. Imagen representativa de una monocapa 2D cultivada en EME transfectada transitoriamente con plásmido pLJM1-EGFP utilizando PEI. (A) Campo claro, (B) fluorescencia (GFP), (C) superposición. La línea roja punteada marca el límite de la monocapa. Barras de escala: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Imagen microscópica de estructuras celulares; comparación de la matriz de colágeno; Análisis de matrices EME y Colágeno I." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig06.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> Figura 6: Reformación de organoides 3D a partir de monocapas 2D en EME. (A) Formación de organoides 3D a partir de monocapas 2D cultivadas en EME. Organoides formados eficientemente a los 5 días de añadir EME a la superficie apical de la monocapa. Nótese la abundancia de células muertas que rodean a los pequeños esferoides 3D. (B) Persistencia de monocapas 2D 5 días después de que se añadiera colágeno I a la superficie apical de monocapas 2D cultivadas sobre colágeno I. Barras de escala: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Imagen de microscopía confocal; expresión nuclear de GFP en grupos celulares, análisis de marcaje fluorescente." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig07.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 7"> Figura 7: Infección lentiviral de organoides 3D. Los organoides de rata yeyuno se infectaron con partículas lentivirales nucleares de GFP utilizando el protocolo descrito. Después de la recuperación y el crecimiento durante 5 días, los organoides se fijaron y se contratiñeron con DAPI. (A) DAPI: gris; nuclearGFP: verde. (B) nuclearGFP:verde. La línea roja punteada marca el límite del organoide. Barras de escala: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Imágenes de microscopía confocal, tinción de CFTR y faloidina de estructuras celulares, análisis de fluorescencia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig08.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 8"> Figura 8: Inmunofluorescencia de montaje completo de organoides intestinales de rata. (A) CFTR, (B) faloidina y (C) inmunofluorescencia de montaje completo fusionado de organoides yeyunales de rata. Obsérvese el enriquecimiento apical de la tinción con CFTR en organoides (gris en A, magenta en C). La faloidina marca la F-actina y etiqueta de forma prominente el borde apical en forma de pincel (gris en B, cian en C). Barras de escala: 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig08large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Microscopía de lapso de tiempo del proceso de difusión, 0-120 min, diagrama con análisis de límites de puntos rojos." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig09.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 9"> Figura 9: Los organoides intestinales de las ratas se hinchan tras la estimulación de la forskolina. Evolución temporal representativa de la inflamación de los organoides intestinales de rata después de la adición del agonista del AMPc forskolina. El tiempo de 0 min representa el punto de tiempo inmediatamente anterior a la adición de 10 μM de forskolina. Las imágenes muestran el mismo organoide a intervalos de tiempo de 30 minutos. Se observó hinchazón máxima a los 120 min después de la adición de forskolina. La línea roja punteada delinea el límite del organoide. El material oscuro en el medio de la luz del organoide está compuesto por células muertas. Barras de escala: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig09large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tabla 1: Receta de AdDMEM+. Ingredientes para hacer el medio AdDMEM+ estándar, que es el medio base a través de los métodos que se muestran aquí. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/Table1_Re.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Tabla 2: Receta de medios organoides intestinales para ratas (rIOM). Receta detallada de los medios organoides intestinales estándar de rata, incluyendo el disolvente y las condiciones de almacenamiento de las proteínas recombinantes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/Table2_RE.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Tabla 3: Soluciones. Recetas e instrucciones para elaborar otras soluciones utilizadas a lo largo del protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/Table3_resub2_Re.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Tabla 4. Medio organoide intestinal de rata para cultivo 2D monocapa (rIOM2D). Receta modificada de medios de cultivo de organoides optimizados para el crecimiento 2D de monocapas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/Table4_resub2_RE.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>

Aquí, presentamos un protocolo para generar organoides intestinales de ratas y usarlos en varias aplicaciones posteriores. Las ratas suelen ser un modelo preclínico preferido, y el robusto sistema de organoides intestinales satisface la necesidad de un sistema in vitro para acompañar los estudios in vivo .

Generación y manipulación de organoides intestinales de rata

When using organoids to assess physiology and cell fate decisions, it is important to use a model that closely recapitulates in vivo contexts. ...

En este estudio establecimos un modelo de organoide intestinal de rata que es robusto en cultivos celulares a largo plazo. También demostramos las primeras manipulaciones genéticas exitosas utilizando tanto la infección lentiviral como la transfección transitoria. Este modelo es una excelente herramienta para manipular la biología intestinal en ratas donde las herramientas genéticas disponibles in vivo son limitadas.Los organoides intestinales de las ratas han sido difíciles de cultivar a largo plazo. Al generar un modelo de organoide de rata robusto y genéticamente manipulable, estamos proporcionando a los investigadores flexibilidad y opciones adicionales para seleccionar el modelo de organoide que mejor se adapte a sus circunstancias particulares. Los organoides intestinales de ratón se utilizan para estudiar el comportamiento, el destino y la fisiología de las células madre, pero pueden ser un modelo subóptimo.Ya que existen diferencias clave entre la biología del ratón y la humana. Por otro lado, los organoides intestinales humanos pueden ser difíciles de obtener y tienen requisitos complejos de cultivo celular. El modelo de organoide de rata que describimos aquí conserva una relevancia fisiológica clave para la biología humana, a la vez que es considerablemente más fácil de acceder y cuidar que los organoides intestinales humanos.El desarrollo y la optimización del modelo de organoide intestinal de rata permite la manipulación genética, los tratamientos farmacológicos y los estudios de mayor rendimiento de la biología intestinal y el modelo accesible con una relevancia fisiológica clave para los seres humanos. Además, estos organoides de rata permitirán el estudio de la fisiología específica de la especie, el destino celular y las variaciones fenotípicas y los modelos de enfermedad en el intestino.

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Investigación

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Biología

En este protocolo de vídeo damos una explicación paso a paso de la transducción lentiviral en organoides del epitelio intestinal primario y del procesamiento y análisis posterior de estos cultivos mediante RT-PCR cuantitativo, microarrays de ARN e inmunohistoquímica.

Un protocolo para la de Lentiviral Transducción y Análisis de Aguas abajo de Intestinal organoides

Describimos instrucciones paso a paso para: 1) diseñar de manera eficiente organoides intestinales utilizando nanopartículas magnéticas para la transducción lenti- o retroviral, y, 2) generar secciones congeladas a partir de organoides diseñados. Este enfoque proporciona una poderosa herramienta para alterar eficientemente la expresión génica en organoides para la investigación de los efectos posteriores.

Ingeniería Genética de Organoides Intestinales de Ratón Primario utilizando Vectores Virales de Transducción de Nanopartículas Magnéticas para Seccionamiento Congelado

Este protocolo permite la diferenciación de células pluripotentes humanas en organoides intestinales. El protocolo imita el desarrollo humano normal mediante la diferenciación de células en una población de endodermo definitivo, endodermo del intestino posterior y luego epitelio intestinal. Esto hace que el protocolo sea adecuado para estudiar tanto el desarrollo intestinal como las aplicaciones de modelización de enfermedades.

Generación de organoides intestinales derivados de hiPSC para aplicaciones de modelización del desarrollo y de enfermedades

Aquí presentamos dos protocolos que permiten el modelado de interacciones intestinales apical-específicas. las monocapas intestinales Organoide-derivadas y las culturas de la interfaz aire-líquido (ALI) facilitan la generación de epitelios bien diferenciados accesibles de lados luminales y basolaterales, mientras que los organoids intestinales polaridad-invertidos exponen su lado apical y son susceptibles a los análisis de alto rendimiento.

Métodos de cultivo para estudiar las interacciones apicales específicas utilizando modelos organoides intestinales

Aquí, se describen métodos detallados para generar, mantener y caracterizar organoides de intestino delgado y colon derivados de células madre pluripotentes humanas. Estos métodos están diseñados para mejorar la reproducibilidad, ampliar la escalabilidad y disminuir el tiempo de trabajo necesario para el recubrimiento y el paso de organoides.

Generación, mantenimiento y caracterización de organoides intestinales y colónicos derivados de células madre pluripotentes humanas

Este protocolo describe un modelo apical-out necrotizante enterocolitis (ECN) en un plato que utiliza enteroides del intestino delgado con polaridad invertida, lo que permite el acceso a la superficie apical. Proporcionamos un protocolo de tinción inmunofluorescente para detectar la disrupción epitelial relacionada con NEC y un método para determinar la viabilidad de enteroides apicales sometidos al protocolo NEC en un plato.

In vitro Modelo enteroide apical de enterocolitis necrosante

Describimos un protocolo para aislar criptas murinas del intestino delgado y cultivar organoides 3D intestinales de las criptas. Además, describimos un método para generar organoides a partir de una sola célula madre intestinal en ausencia de un nicho celular subepitelial.

El cultivo 3D de organoides a partir de criptas intestinales murinas y una sola célula madre para la investigación de organoides

Este estudio describe un protocolo para generar monocapas 2D de organoides porcinos derivados del intestino delgado y grueso. El crecimiento de estas monocapas se caracteriza por el aumento de los valores de TEER, lo que indica una sólida integridad epitelial. Además, estas monocapas exhiben respuestas secretoras fisiológicas en experimentos en cámara de Ussing después de la aplicación de forskolina.

Organoides intestinales porcinos bidimensionales que reflejan las propiedades fisiológicas del intestino nativo

Aquí, describimos un protocolo para generar organoides intestinales apicales a partir de cultivos de organoides estándar incrustados en matriz. También describe la posterior incorporación de EdU en células en proliferación activa y la cuantificación semiautomática de células EdU positivas.

Generación de organoides intestinales apicales y evaluación de la tasa de proliferación de organoides mediante el marcaje EdU

Describimos un protocolo simple para desarrollar organoides epiteliales mucociliares a partir de células ectoderm profundas aisladas de embriones Xenopus laevis. Los progenitores multipotentes regeneran precursores de células de copa epitelial y permiten el seguimiento en vivo de la iniciación y progresión de las transiciones celulares en la superficie de los organoides.

Organoides epiteliales mucocilios de células embrionarias de Xenopus: generación, cultura e imágenes en vivo de alta resolución

Aprende a generar organoides intestinales de rata con cultivo a largo plazo y manipulación genética mediante infección lentiviral y transfección transitoria. Este modelo robusto facilita estudios de biología intestinal con relevancia fisiológica humana.

Generación y manipulación de organoides intestinales de rata

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