Diseño y construcción de un microscopio de fluorescencia de lámina de luz personalizable de un solo objetivo para la visualización de redes de citoesqueletos
26 de enero de 2024
Este protocolo describe en detalle cómo construir un microscopio de fluorescencia de hoja de luz de un solo objetivo y su uso para visualizar redes de citoesqueletos.
Nuestro trabajo tiene como objetivo avanzar en el conocimiento sobre la relación entre la dinámica de trabajo trans, la estructura local y las propiedades mecánicas en materiales alejados del equilibrio. La visualización de materiales alejados del equilibrio, como las redes de citoesqueletos, requiere la capacidad de obtener imágenes de muestras densas y tridimensionales con una calidad de imagen comparable en todo el volumen de la muestra, al tiempo que causa un daño mínimo a través del fotoblanqueo, una tarea técnicamente desafiante para la que la microscopía de lámina de luz de fluorescencia es la más adecuada. Los sistemas de microscopio de lámina de luz fluorescente proporcionan excelentes capacidades de seccionamiento óptico, lo que permite obtener imágenes de estas muestras gruesas y tridimensionales para escalas de tiempo largas con un fotoblanqueo mínimo.
En particular, el sistema de lámina de luz de objetivo único que presentaremos es compatible con las muestras tradicionales montadas en portaobjetos, lo que lo convierte en una herramienta muy versátil. La inmensa mayoría de las guías de hojas de luz de un solo objetivo están escritas para usuarios con amplia experiencia en óptica. Para hacer más accesible la compleja configuración del estilo de hoja de luz de un solo objetivo, esta guía detallada proporciona los pasos que puede seguir un usuario con un curso de óptica de nivel básico.
Descripción general
Este estudio tiene como objetivo mejorar la comprensión de la dinámica del trabajo trans en materiales fuera del equilibrio, centrándose específicamente en redes del citoesqueleto. La investigación describe la construcción y aplicación de un microscopio de hoja de luz de objetivo único para la visualización óptima de estas muestras tridimensionales densas.
Componentes Clave del Estudio
Área de Investigación
- Biología celular
- Microscopía
- Materiales lejos del equilibrio
Antecedentes
- Dificultades en la obtención de imágenes de muestras biológicas tridimensionales densas
- Importancia de minimizar el fotoblancamiento durante sesiones de imagen prolongadas
- Ventajas de la microscopía de hoja de luz para el corte óptico
Métodos Utilizados
- Construcción de un microscopio de hoja de luz de objetivo único
- Uso de muestras de prueba de microtúbulos marcados con rodamina
- Procedimientos de alineación y calibración para una imagen óptima
Resultados principales
- Visualización exitosa de las redes del citoesqueleto
- Demuestración de daño mínimo en las muestras durante la imagenología
- Imagenología eficaz a diferentes profundidades en la muestra
Conclusiones
- El protocolo presenta un enfoque factible para la obtención de imágenes de estructuras biológicas complejas
- Este método puede ayudar significativamente a los investigadores en el estudio de materiales biológicos con actividad mecánica
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La visualización de alta resolución de redes densas del citoesqueleto tridimensionales es fundamental para el descubrimiento temprano y la reducción de riesgos mecanicistas en la descubrimiento de fármacos basado en biología celular. El microscopio de hoja de luz de fluorescencia con objetivo único personalizable (SOLS) permite obtener imágenes reproducibles con bajo fotoblanqueo de ensamblajes biológicos complejos, lo que fortalece la confianza predictiva en la validación de dianas y en los cribados fenotípicos. Esta instrumentación accesible reduce la brecha entre el corte óptico avanzado y los flujos de trabajo prácticos de I+D, mejorando la toma de decisiones en las carteras en el punto crítico del descubrimiento.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la visualización directa de la dinámica del citoesqueleto en sistemas modelo reconstruidos para la comprobación de hipótesis.
- Apoya la reducción de riesgos mecanicistas al proporcionar imágenes volumétricas de alta fidelidad de estructuras biológicas fuera del equilibrio.
- Facilita la validación funcional de objetivos mediante resultados cuantitativos y reproducibles de imágenes.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Prepara sistemas biológicos 3D validados para flujos de trabajo de cribado fenotípico posterior.
- Proporciona datos estandarizados y cuantitativos de seccionamiento óptico para la reproducibilidad del ensayo.
- Permite la evaluación confiable de los efectos de compuestos sobre la arquitectura del citoesqueleto en muestras densas.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Correlaciona los resultados de imagen con fenotipos del citoesqueleto relevantes para la enfermedad en modelos traslacionales.
- Facilita la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante estudios de imagen robustos y longitudinales.
- Reduce el riesgo en el avance de candidatos al aclarar los mecanismos biológicos en sistemas complejos.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
El microscopio SOLS se integra en la continuidad de descubrimiento a preclínico al permitir la obtención de imágenes cuantitativas de modelos tridimensionales del citoesqueleto, apoyando tanto la investigación basada en hipótesis como el desarrollo de ensayos escalables.
- Biología del Descubrimiento: Proporciona seccionado óptico para la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías en ensamblajes biológicos densos.
- Selección: Ofrece resultados de imagen cuantitativos y reproducibles, adecuados para la estandarización de ensayos y la selección de compuestos.
- Análisis: Genera datos volumétricos y de lapso de tiempo para el análisis comparativo de condiciones experimentales.
- Investigación Traducional: Relaciona los fenotipos de imagen con mecanismos relevantes para enfermedades cuando se aplica a modelos adecuados.
- Reutilización Empresarial: El diseño modular facilita la adaptación en diversos sistemas biológicos y equipos de investigación.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la investigación dirigida al citoesqueleto.
- Valor operativo: Promueve la estandarización, la reproducibilidad y la escalabilidad en los flujos de trabajo de imágenes.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción y la eficiencia del capital al permitir la generación de datos robustos y con bajos artefactos.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo y el avance de activos en fase de descubrimiento.
Consideraciones de Implementación
- Requiere conocimientos fundamentales de óptica y una cuidadosa alineación de los componentes ópticos.
- Necesita acceso a instrumentación microscópica estándar y software analítico para el procesamiento de imágenes.
- Exige estandarización entre equipos para lograr imágenes reproducibles e interpretación de datos confiables.
- Adaptable a diversos sistemas modelo con calibración adecuada y preparación de muestras.
- Las limitaciones prácticas incluyen la complejidad del alineado y la necesidad de compatibilidad de la muestra con el montaje basado en portaobjetos.
