Name: Diseño y construcción de un microscopio de fluorescencia de lámina de luz personalizable de un solo objetivo para la visualización de redes de citoesqueletos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Aprende a construir un microscopio de fluorescencia de lámina de luz de un solo objetivo para visualizar redes de citoesqueletos en muestras tridimensionales densas. Este método minimiza el fotoblanqueo y permite imaginar estructuras biológicas complejas con excelente calidad óptica.

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Este trabajo fue apoyado por el Premio RUI de la Fundación Nacional de Ciencias (NSF) (DMR-2203791) a J.S. Estamos agradecidos por la orientación proporcionada por el Dr. Bin Yang y el Dr. Manish Kumar durante el proceso de alineación. Jenny Ross y K. Alice Lindsay por las instrucciones de preparación para los motores de kinesina.

Microscopio de fluorescencia personalizable para visualizar redes de citoesqueletos

<ol><li>Girkin, J. M., Carvalho, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+light-sheet+microscopy+revolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Optics%22%5BJournal%5D)">The light-sheet microscopy revolution.</a> Journal Optics. 20 (5), 053002(2018).</li>
<li>You, R., McGorty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+fluorescence+microscopy+illuminating+soft+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physics%22%5BJournal%5D)">Light sheet fluorescence microscopy illuminating soft matter.</a> Frontiers in Physics. 9, 760834(2021).</li>
<li>Fuchs, E., Jaffe, J. S., Long, R. A., Azam, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin+laser+light+sheet+microscope+for+microbial+oceanography%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Thin laser light sheet microscope for microbial oceanography.</a> Optics Express. 10 (2), 145-154 (2002).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li>
<li>Dunsby, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optically+sectioned+imaging+by+oblique+plane+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Optically sectioned imaging by oblique plane microscopy.</a> Optics Express. 16 (25), 20306-20316 (2008).</li>
<li>Bouchard, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swept+confocally-aligned+planar+excitation+%28SCAPE%29+microscopy+for+high-speed+volumetric+imaging+of+behaving+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Photonics%22%5BJournal%5D)">Swept confocally-aligned planar excitation (SCAPE) microscopy for high-speed volumetric imaging of behaving organisms.</a> Nature Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).</li>
<li>Smith, C. W., Botcherby, E. J., Wilson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+oblique-plane+images+in+sectioning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Resolution of oblique-plane images in sectioning microscopy.</a> Optics Express. 19 (3), 2662-2669 (2011).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epi-illumination+SPIM+for+volumetric+imaging+with+high+spatial-temporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Epi-illumination SPIM for volumetric imaging with high spatial-temporal resolution.</a> Nature Methods. 16 (6), 501-504 (2019).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+multiview+capture+and+fusion+improves+spatial+resolution+in+wide-field+and+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optica%22%5BJournal%5D)">Simultaneous multiview capture and fusion improves spatial resolution in wide-field and light-sheet microscopy.</a> Optica. 3 (8), 897-910 (2016).</li>
<li>Sahasrabudhe, A., Vittal, V., Ghose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peeping+in+on+the+cytoskeleton%3A+Light+microscopy+approaches+to+actin+and+microtubule+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Science%22%5BJournal%5D)">Peeping in on the cytoskeleton: Light microscopy approaches to actin and microtubule organization.</a> Current Science. 105 (11), 1562-1570 (2013).</li>
<li>Kumar, M., Kishore, S., Nasenbeny, J., McLean, D. L., Kozorovitskiy, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+one-+and+two-photon+scanned+oblique+plane+illumination+%28SOPi%29+microscopy+for+rapid+volumetric+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Integrated one- and two-photon scanned oblique plane illumination (SOPi) microscopy for rapid volumetric imaging.</a> Optics Express. 26 (10), 13027-13041 (2018).</li>
<li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oblique-plane+single-molecule+localization+microscopy+for+tissues+and+small+intact+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Oblique-plane single-molecule localization microscopy for tissues and small intact animals.</a> Nature Methods. 16 (9), 853-857 (2019).</li>
<li>Sapoznik, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+oblique+plane+microscope+for+large-scale+and+high-resolution+imaging+of+subcellular+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A versatile oblique plane microscope for large-scale and high-resolution imaging of subcellular dynamics.</a> eLife. 9, e57681(2020).</li>
<li>Bernardello, M., Marsal, M., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet+fluorescence+microscopy+for+the+in+vivo+study+of+microtubule+dynamics+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Light-sheet fluorescence microscopy for the in vivo study of microtubule dynamics in the zebrafish embryo.</a> Biomedical Optics Express. 12 (10), 6237-6254 (2021).</li>
<li>Shelden, E. A., Colburn, Z. T., Jones, J. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focusing+super+resolution+on+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Res%22%5BJournal%5D)">Focusing super resolution on the cytoskeleton.</a> F1000Res. 5, F1000 Faculty Rev-998 (2016).</li>
<li>Wulstein, D. M., Regan, K. E., Garamella, J., McGorty, R. J., Robertson-Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topology-dependent+anomalous+dynamics+of+ring+and+linear+DNA+are+sensitive+to+cytoskeleton+crosslinking%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Topology-dependent anomalous dynamics of ring and linear DNA are sensitive to cytoskeleton crosslinking.</a> Science Advances. 5 (12), (2019).</li>
<li>Sheung, J. Y., Garamella, J., Kahl, S. K., Lee, B. Y., McGorty, R. J., Robertson-Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor-driven+advection+competes+with+crowding+to+drive+spatiotemporally+heterogeneous+transport+in+cytoskeleton+composites%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physics%22%5BJournal%5D)">Motor-driven advection competes with crowding to drive spatiotemporally heterogeneous transport in cytoskeleton composites.</a> Frontiers in Physics. 10, 1055441(2022).</li>
<li>Zeiss Lightsheet 7. Light-Sheet Multiview Imaging of Living and Cleared Specimens. Zeiss. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lightsheet-7.html">https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lightsheet-7.html</a> (2023).</li>
<li>Zeiss Lattice Lightsheet 7. Long-Term Volumetric Imaging of Living Cells. Zeiss. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lattice-lightsheet-7.html">https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lattice-lightsheet-7.html</a> (2023).</li>
<li>Kumar, M., Kishore, S., McLean, D. L., Kozorovitskiy, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crossbill%3A+An+open+access+single+objective+light-sheet+microscopy+platform%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Crossbill: An open access single objective light-sheet microscopy platform.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Olarte, O. E., Andilla, J., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet+microscopy%3A+A+tutorial%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Optics+and+Photonics%22%5BJournal%5D)">Light-sheet microscopy: A tutorial.</a> Advances in Optics and Photonics. 10 (1), 111-179 (2018).</li>
<li>Pitrone, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OpenSPIM%3A+An+open-access+light-sheet+microscopy+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">OpenSPIM: An open-access light-sheet microscopy platform.</a> Nature Methods. 10 (7), 598-599 (2013).</li>
<li>Sheung Lab, Single Objective Light Sheet Microscope (SOLS) Guide. Sheung Lab. , Available from: 
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<li>Berezney, J., Goode, B. L., Fraden, S., Dogic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensile+to+contractile+transition+in+active+microtubule-actin+composites+generates+layered+asters+with+programmable+lifetimes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Extensile to contractile transition in active microtubule-actin composites generates layered asters with programmable lifetimes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (5), e2115895119(2022).</li>
<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isomorphic+coalescence+of+aster+cores+formed+in+vitro+from+microtubules+and+kinesin+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">Isomorphic coalescence of aster cores formed in vitro from microtubules and kinesin motors.</a> Physical Biology. 13 (5), 056002(2016).</li>
<li>Millett-Sikking, A., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMillett-Sikking%2C+A+%22High+NA+single-objective+lightsheet%22">High NA single-objective lightsheet</a>. , (2019).</li>
<li>Bourgenot, C., Saunter, C. D., Taylor, J. M., Girkin, J. M., Love, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+adaptive+optics+in+a+light+sheet+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">3D adaptive optics in a light sheet microscope.</a> Optics Express. 20 (12), 13252-13261 (2012).</li>
<li>Bernardello, M., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+multimodal+platform+for+classical+and+high+throughput+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Modular multimodal platform for classical and high throughput light sheet microscopy.</a> Scientific Reports. 12 (1), 1969(2022).</li>
<li>Crombez, S., Leclerc, P., Ray, C., Ducros, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+hyperspectral+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Computational hyperspectral light-sheet microscopy.</a> Optics Express. 30 (4), 4856-4866 (2022).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar. Toda la investigación se llevó a cabo en ausencia de relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un conflicto de intereses.

Dos detalles importantes con respecto a este protocolo son el costo total del sistema y el tiempo esperado de construcción y alineación. Aunque el costo exacto es variable, podemos estimar cómodamente que el costo in toto de este SOLS o un sistema de bricolaje similar estaría en el rango de $ 85,000 USD. Observamos que esta estimación tiene en cuenta el precio de venta al público de todos los componentes, por lo que este precio global puede reducirse considerablemente si se obtienen componentes usados. En términos de tiempo de construcción, sería razonable esperar que un usuario con poca experiencia en óptica construya y alinee todo este sistema SOLS en 1-2 meses, siempre que todos los componentes estén disponibles y listos. A pesar de la longitud y complejidad del protocolo, creemos que la cantidad de detalles en el manuscrito escrito, junto con el protocolo de video, debería hacer que este protocolo sea sencillo y rápido de seguir.
Hay dos pasos críticos en este protocolo. En primer lugar, la colocación del galvo determina la colocación de muchas lentes, ya que forma parte de tres pares de lentes 4f separados. Es crucial que el galvo esté conjugado con los planos focales posteriores de O1 y O2 y centrado correctamente para garantizar un escaneo invariante de inclinación. En segundo lugar, la calidad de la imagen es extremadamente sensible a la alineación de O2 y O3 entre sí. Aquí, se debe tener cuidado para garantizar que, en primer lugar, el ángulo de alineación de O3 a O2 coincida con la inclinación de la lámina de luz de excitación, proporcionando así una iluminación plana máxima a través del campo de visión inclinado de manera similar. En segundo lugar, el O3 debe colocarse a la distancia axial correcta para mantener un campo de visión plano con un área lo más grande posible. En tercer lugar, el O3 debe colocarse a la distancia lateral correcta del O2 para maximizar la señal que pasa a través de la interfaz O2-O3.

En cuanto al campo de visión utilizable, este sistema logró un campo plano y fiable con una iluminación constante en un área de 80 μm x 80 μm. Esta área es más pequeña que el campo de visión máximo proporcionado por la cámara, por lo que el campo de visión utilizable se indica mediante el cuadro amarillo de la Figura 13. En términos de poder de resolución, este sistema logró una distancia mínima resoluble de 432 nm a lo largo del eje x y 421 nm a lo largo del eje y, que se midió encontrando el promedio sigma x e y de los ajustes gaussianos a las funciones de dispersión puntual (PSF) en el campo de visión bueno y multiplicándolo por dos. Observamos que este sistema no se optimizó en términos de su NA total, lo que significa que hay margen de mejora significativa si los usuarios desean un poder de resolución superior al que logró este sistema. Hay una multitud de opciones de objetivos compatibles para este tipo de construcción de SOLS, muchas de las cuales contribuirían a una mayor resolución del sistema, pero con los inconvenientes de un costo más alto, un campo de visión más pequeño o técnicas de alineación más complicadas en la interfaz del relé 8,11,13,20. Por otra parte, si los usuarios desean un campo de visión más grande, la incorporación de un segundo galvo para permitir el escaneo 2D lograría este objetivo, pero requeriría que se integraran ópticas y mecánicas de control adicionales en el diseño32. Hemos proporcionado más detalles sobre las modificaciones al sistema en nuestra página web, junto con enlaces a otros recursos útiles sobre el proceso de diseño23.

Más allá de mejorar los componentes específicos para este diseño en particular, sería muy factible agregar otras técnicas o modalidades de microscopía de alta resolución a esta construcción. Una de esas mejoras sería incorporar iluminación de múltiples longitudes de onda, lo que implicaría alinear láseres de excitación adicionales con la ruta de excitación original8. Además, debido a que este tipo de diseño SOLS deja la muestra accesible, agregar funciones adicionales al microscopio, que incluyen, entre otras, pinzas ópticas, microfluídica y reometría, es relativamente sencillo 2,33.

En comparación con la miríada de guías de hojas de luz que se han publicado, este protocolo proporciona instrucciones a un nivel de comprensión que puede resultar útil para un usuario sin experiencia significativa en óptica. Al hacer que una construcción SOLS fácil de usar con capacidades tradicionales de montaje de portaobjetos de muestra sea accesible a un público más amplio, esperamos permitir una expansión aún mayor de las aplicaciones de la investigación basada en SOLS en todos los campos en los que el instrumento se ha utilizado o podría utilizarse. Incluso con las aplicaciones de los instrumentos SOLS creciendo rápidamente en número 2,34,35, creemos que muchos beneficios y usos de los instrumentos tipo SOLS aún permanecen inexplorados y expresamos entusiasmo por las posibilidades de este tipo de instrumento en el futuro.

La microscopía de fluorescencia de lámina de luz (LSFM) representa una familia de técnicas de imágenes de fluorescencia de alta resolución en las que la luz de excitación se moldea en una lámina 1,2, incluida la microscopía de iluminación de plano selectivo (SPIM), la excitación plana alineada confocal (SCAPE) y la microscopía de plano oblicuo (OPM)3,4,5,6,7. A diferencia de otras modalidades de microscopía, como la epifluorescencia, la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRFM) o la microscopía confocal, la fototoxicidad es mínima en la LSFM y las muestras se pueden obtener en escalas de tiempo más largas, ya que solo se ilumina el plano de la muestra que se está fotografiando activamente 8,9,10. Por lo tanto, las técnicas LSFM son extremadamente útiles para obtener imágenes de muestras 3D durante períodos de tiempo prolongados, especialmente incluso aquellas demasiado gruesas para las técnicas de microscopía confocal. Debido a estas razones, desde su desarrollo original en 2004, la LSFM se ha convertido en la técnica de imagen elegida por muchos fisiólogos, biólogos del desarrollo y neurocientíficos para la visualización de organismos completos como embriones vivos de pez cebra y Drosophila 3,4,6,11 . En estas últimas dos décadas, las ventajas de la LSFM se han aprovechado para visualizar la estructura y la dinámica a escalas progresivamente más pequeñas, incluyendo las escalas tisulares11,12, celulares y subcelulares, tanto in vivo como in vitro 13,14,15,17.
A pesar de los informes de casos de uso exitosos en la literatura, el alto costo de los sistemas comerciales de LSFM (~0,25 millones de dólares en el momento de escribir este artículo)18,19 impide el uso generalizado de la técnica. Para hacer de las construcciones de bricolaje una alternativa factible para los investigadores, se han publicado múltiples guías de construcción 8,13,20,21, incluido el esfuerzo de acceso abierto OpenSPIM 22. Sin embargo, hasta la fecha, los investigadores con una experiencia mínima en óptica solo pueden utilizar diseños anteriores de LSFM, que son incompatibles con las muestras tradicionales montadas en portaobjetos (Figura 1A). La reciente implementación de un solo objetivo, hoja de luz (SOLS) utiliza un solo objetivo tanto para la excitación como para la detección (Figura 1C), superando así la limitación relacionada con la compatibilidad 5,6,8,13,20. Sin embargo, el costo de la versatilidad del diseño de SOLS es un aumento sustancial en la complejidad de la construcción debido a la necesidad de dos objetivos adicionales para transmitir, desinclinar y volver a crear imágenes del plano del objeto en la cámara para obtener imágenes (Figura 1D). Para facilitar el acceso a las complejas configuraciones de estilo SOLS, este artículo presenta una guía paso a paso sobre el diseño, la construcción, el proceso de alineación y el uso de un sistema SOLS compatible con diapositivas, que sería útil para los investigadores con conocimientos de solo un curso de óptica de nivel básico.
Aunque el protocolo en sí es conciso, los lectores deben consultar otros recursos durante los pasos de preparación para obtener más información sobre partes particulares del diseño o consideraciones de hardware. Sin embargo, si un lector tiene la intención de seguir las especificaciones de este diseño, es posible que no sea necesario comprender cómo seleccionar componentes ópticos particulares.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65411/65411fig01.jpg"> Figura 1: Características de las diferentes configuraciones de LSFM. (A) La configuración con dos objetivos ortogonales comunes en los primeros diseños de LSFM. En esta configuración, se utiliza un tubo capilar o un cilindro de gel para contener la muestra, lo que no es compatible con las técnicas tradicionales de montaje de portaobjetos. (B) Un esquema de un diseño de lámina de luz SOLS que muestre lo siguiente: (C) el objetivo único utilizado para la excitación y la recolección de emisiones en el plano de muestra (O1); esto permite montar una corredera tradicional en la parte superior, y (D) el sistema de objetivo de relé en la ruta de emisión SOLS. El O2 recoge la luz de emisión y desamplía la imagen. O3 toma imágenes del avión con el ángulo de inclinación correcto en el sensor de la cámara. Abreviaturas: LSFM = microscopía de fluorescencia de lámina de luz; SOLS = hoja de luz de un solo objetivo; O1-O3 = objetivos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65411/65411fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Lente plano-cóncava de 1" f = -50 mm</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>LC1715-A-ML</td><td>Para alineación láser Costo estimado: $49.5</td></tr><tr><td>Doblete acromático de 1" f = 100 mm (x3)</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-100-A-ML</td><td>L2, L4 y láser de alineación Costo estimado: $342.42</td></tr><tr><td>Doblete acromático de 1" f = 125 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-125-A-ML</td><td>SL2 Costo estimado: $114.14</td></tr><tr><td>Doblete acromático de 1" f = 150 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-150-A-ML</td><td>L3 Costo estimado: $114.14</td></tr><tr><td>Doblete acromático de 1" f = 150 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-150-A-ML</td><td>TL2 Costo estimado: $114.14</td></tr><tr><td>Doblete acromático de 1" f = 45 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-045-A-ML</td><td>L1 Costo estimado: $114.14</td></tr><tr><td>Doblete acromático de 1" f = 75 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-075-A-ML</td><td>SL1 Costo estimado: $114.14</td></tr><tr><td>Lente cilíndrica de 1" f = 100 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LJ1567RM</td><td>CL3 Costo estimado: $117.62</td></tr><tr><td>Lente cilíndrica de 1" f = 200 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LJ1653RM</td><td>CL2 Costo estimado: $111.22</td></tr><tr><td>Lente cilíndrica de 1" f = 50 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LJ1695RM</td><td>CL1 Costo estimado: $117.62</td></tr><tr><td>Estenopeico montado de 1", 30 y micro; m Diámetro estenopeico</td><td>Thorlabs</td><td>P30K</td><td>Costo estimado: $77.08</td></tr><tr><td>Espejo plateado de 1" (x3)</td><td>Thorlabs</td><td>PF10-03-P01</td><td>M1, M2, uno para alineación Costo estimado: $168.78</td></tr><tr><td>Espejo elíptico de 2"</td><td>Thorlabs</td><td>PFE20-P01</td><td>M3 Costo estimado: $179.98</td></tr><tr><td>Soporte de poste de 2" (x11)</td><td>Thorlabs</td><td>PH2</td><td>Para montaje láser personalizado, rueda ND, pantallas de seguridad Costo estimado: $98.45</td></tr><tr><td>Postes de 2" (x47)</td><td>Thorlabs</td><td>TR2</td><td>Para montaje láser personalizado y componentes ópticos Costo estimado: $277.3</td></tr><tr><td>Postes de 3" (x4)&nbsp;</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>TR3</td><td>Para soportes M3 y otros soportes Costo estimado: $24.6</td></tr><tr><td>Soporte de poste de 3" (x4)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>PH3</td><td>Costo estimado: $38.48</td></tr><tr><td>Adaptador de jaula de 30 a 60 mm&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>LCP33</td><td>Para montar O1 Costo estimado: $45.42</td></tr><tr><td>Rueda de filtro de jaula de 30 mm</td><td>Thorlabs</td><td>CFW6</td><td>Para montar filtros ND Costo estimado: $172.36</td></tr><tr><td>Placa de jaula de 30 mm (x6)</td><td>Thorlabs</td><td>CP33</td><td>Para construir una jaula de alineación y un láser de alineación Costo estimado: $114.54</td></tr><tr><td>Montura de espejo cinemático en ángulo recto de 30 mm (x3)</td><td>Thorlabs</td><td>KCB1</td><td>Para montar M1 y M2 y para la alineación láser Costo estimado: $463.95</td></tr><tr><td>Soporte de poste de 4" (x30)</td><td>Thorlabs</td><td>PH4</td><td>Costo estimado: $320.1</td></tr><tr><td>Láser de 561 nm y fuente de alimentación&nbsp;</td><td>Opto Engine LLC</td><td>MGL-FN-561-100mW</td><td>Excitación láser Costo estimado: $6000</td></tr><tr><td>Placa de jaula de 60 mm (x2)</td><td>Thorlabs</td><td>LCP01</td><td>Para montar TL1 y M3 mount Costo estimado: $88.52</td></tr><tr><td>Montaje de espejo cinemático en ángulo recto de 60 mm</td><td>Thorlabs</td><td>KCB2</td><td>Para montar M3 Costo estimado: $187.26</td></tr><tr><td>90&deg; Montura abatible</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>TRF90</td><td>Para alineación láser Costo estimado: $95.5</td></tr><tr><td>Adaptador con roscas externas de montaje C y roscas internas SM1</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>SM1A9</td><td>Para conectar el tubo de la lente a la cámara Costo estimado: $20.96</td></tr><tr><td>Adaptador con roscas externas SM1 y roscas internas de montura C</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>SM1A10</td><td>Para conectar la lente de tubo a la montura de la lente Costo estimado: $21.82</td></tr><tr><td>Adaptador con roscas SM1 externas y roscas M25 internas (x2)</td><td>Thorlabs</td><td>SM1A12</td><td>Para montar O1 y O2 Costo estimado: $47.06</td></tr><tr><td>Adaptador con roscas externas SM1 y roscas internas M26</td><td>Thorlabs</td><td>SM1A27</td><td>Para montar O3 Costo estimado: $22.38</td></tr><tr><td>Disco de Alineación</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>SM1A7</td><td>Costo estimado: $20.45</td></tr><tr><td>Alineación Láser</td><td>BISKEE</td><td></td><td>https://www.amazon.com/Tactical-Presentation-Teaching-Interactive-Adjustable/dp/B09B1VXPNM Costo estimado: $16.98</td></tr><tr><td>Tobogán de plástico autoluorescente, rojo&nbsp;</td><td>Chroma</td><td>92001</td><td>Costo estimado: $ 20</td></tr><tr><td>Obturador de haz&nbsp;</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>SM1SH1</td><td>Para bloquear la luz láser Costo estimado: $65.8</td></tr><tr><td>Rotación de jaula Montaje (x3)</td><td>Thorlabs</td><td>CRM1T</td><td>Para montar CL1-3 Costo estimado: $282.15</td></tr><tr><td>Barras de sistema de jaula de 1" (x8)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>ER1</td><td>Para montar M3 y O1 Costo estimado: $44.8</td></tr><tr><td>Barras del sistema de jaula de 3" (x2)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>ER3</td><td>Para montar O3 Costo estimado: $14.28</td></tr><tr><td>Varillas del sistema de jaula 4" (x4)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>ER4</td><td>Para montar ranura Costo estimado: $30.76</td></tr><tr><td>Varillas del sistema de jaula 8" (x2)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>ER8</td><td>Para la alineación de lentes de tubo Costo estimado: $25.3</td></tr><tr><td>Sistema de jaula Varillas de 12" (x8)</td><td>Thorlabs</td><td>ER12</td><td>Para jaula de alineación Costo estimado: $145.36</td></tr><tr><td>Cámara</td><td>Andor</td><td>Zyla 4.2 sCMOS</td><td>Costo estimado: ~$14,000</td></tr><tr><td>Horquilla de sujeción (x35)</td><td>Thorlabs</td><td>CF125</td><td>Para sujetar soportes de poste Costo estimado: $338.8</td></tr><tr><td>Cubreobjetos, 22 x 22 mm&nbsp;</td><td>Corning</td><td>2850-22</td><td>Para muestras de portaobjetos Costo estimado: $265</td></tr><tr><td>Dicroico&nbsp;</td><td>AVR</td><td>DI01-R405/488/561/635-25x36</td><td>Para dividir las trayectorias de escisión/emisión Costo estimado: $965</td></tr><tr><td>Etapa de traducción de cola de milano</td><td>Thorlabs</td><td>DT12</td><td>Para traducir pinhole Costo estimado: $90.55</td></tr><tr><td>Filtro de emisión</td><td>Thorlabs</td><td>FELHO600</td><td>Costo estimado: $140.99</td></tr><tr><td>Disco de alineación de vidrio esmerilado (x2)</td><td>Thorlabs</td><td>DG10-1500-H1</td><td>Para la jaula de alineación y el plano intermedio Costo estimado: $75.14</td></tr><tr><td>Función Generador</td><td>Hewlett-Packard</td><td>HP 33120A 15 MHz</td><td>Para controlar galvo Costo estimado: $900</td></tr><tr><td>Galvanómetro - Sistema 1D de gran diámetro de haz</td><td>Thorlabs</td><td>GVS011</td><td>Costo estimado: $1715.78</td></tr><tr><td>Fuente de alimentación del galvanómetro</td><td>Siglent</td><td>SPD3303C</td><td>Costo estimado: $300</td></tr><tr><td>Gelrite</td><td>Research Products International</td><td>G35020-100.0</td><td>Goma gellan para muestra de cuentas 3D Costo estimado: $68.25</td></tr><tr><td>FIJI Software</td><td>de código</td><td></td> abierto <td>Descarga desde https://imagej.net/software/fiji/downloads Costo estimado:</td></tr><tr><td>Placa caliente / agitador</td> gratuito <td>Corning</td><td>6795-220</td><td>Para preparar soluciones de muestra Costo estimado: $550</td></tr><tr><td>Controlador de motor con escobillas K-Cube</td><td>Thorlabs</td><td>KDC101</td><td>Unidades Z825B Costo estimado: $757.51</td></tr><tr><td>Montura cinemática</td><td>Thorlabs</td><td>KM100S</td><td>Para montar dicroico Costo estimado: $92.01</td></tr><tr><td>Kinesis Software</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td></td><td>Descargar desde https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=10285 Costo estimado:</td></tr><tr><td>Bloqueador de luz láser gratis&nbsp;</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>LB1</td><td>Para reflejos de filtro ND Costo estimado: $57.65</td></tr><tr><td>Montaje láser</td><td>hecho</td><td></td> a medida <td>impreso en 3D Costo estimado: N/</td></tr><tr><td>A Pantalla de seguridad láser (x2)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>TPS4</td><td>Para bloquear la luz láser parásita Costo estimado: $92.02</td></tr><tr><td>Lente de tubo de escaneo láser</td><td>Thorlabs</td><td>TTL200MP</td><td>TL1 Costo estimado: $1491</td></tr><tr><td>Montura de lente (x10)&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>LMR1</td><td>Para montar todas las lentes y espejos de alineación adicionales. Costo estimado: $164.7</td></tr><tr><td>Regla magnética</td><td>Thorlabs</td><td>BHM4</td><td>Para verificar la alineación Costo estimado: $52.74</td></tr><tr><td>Micro-Manager Software&nbsp;</td><td>Descarga de código</td><td></td> abierto <td>desde https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release Costo estimado:</td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio</td> gratuitos <td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>12550400</td><td>Para muestras de portaobjetos Costo estimado: $123.9</td></tr><tr><td>Etapa de microscopio&nbsp;</td><td>ASI</td><td>FTP-2000 con piezas personalizadas</td><td>Para traducir muestras con precisión Costo estimado: ~ $ 16,000</td></tr><tr><td>Mini mezclador de vórtice &nbsp;</td><td>VWR</td><td>10153-688</td><td>Para la preparación de muestras Costo estimado: $152.64</td></tr><tr><td>Actuador motorizado</td><td>Thorlabs</td><td>Z825B</td><td>Para traducir con precisión M1 Costo estimado: $729.07</td></tr><tr><td>Iris estándar montado (x2)</td><td>Thorlabs</td><td>ID20</td><td>Al menos 2 para alineación Costo estimado: $118.02</td></tr><tr><td>Conjunto de filtros ND&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>NDK01&nbsp;</td><td>Para reducir la intensidad de excitación Costo estimado: $726.73</td></tr><tr><td>Lente del objetivo 1</td><td>Nikon &nbsp;</td><td>Plan Apo 60X/ 1.20 WI</td><td>O1 Costo estimado: ~$15,000</td></tr><tr><td>Lente de objetivo 2</td><td>Nikon</td><td>TU Plan Fluor 100X/0.90&nbsp;</td><td>O2 Costo estimado: ~$6,000</td></tr><tr><td>Objetivo Lente 3</td><td>Mitutoyo</td><td>Plan Apo HR 50X/0.75</td><td>O3 Costo estimado: ~$6,800</td></tr><tr><td>OPM Desviación</td><td>Software de código</td><td></td> abierto <td>Para el procesamiento de imágenes. Descargar desde https://github.com/QI2lab/OPM Costo estimado:</td></tr><tr><td>Sensor de potencia de fotodiodo</td> gratuito <td>Thorlabs&nbsp;</td><td>S121C</td><td>Para medir la intensidad del láser Costo estimado: $379.68</td></tr><tr><td>Objetivo de distorsión de cuadrícula positiva</td><td>Thorlabs</td><td>R1L3S3P</td><td>Alineación de campo claro Costo estimado: $267.87</td></tr><tr><td>Consola digital del medidor de potencia</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>PM100D</td><td>Para medir la intensidad del láser Costo estimado: $1245.48</td></tr><tr><td>Rhodamine 6G</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>J62315.14</td><td>Para muestra de portaobjetos con recubrimiento fluorescente Costo estimado: $27.7</td></tr><tr><td>Abrazadera de ángulo recto para</td><td>postes Thorlabs&nbsp;</td><td>RA90</td><td>Para soporte M3 y espejo abatible Costo estimado: $32.46</td></tr><tr><td>Placa de jaula roscada RMS (x2)&nbsp;</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>CP42</td><td>Para alineación láser Costo estimado: $70.56</td></tr><tr><td>Placa de corte 2.5-5.0 mm</td><td>Thorlabs</td><td>SI050P&nbsp;</td><td>Costo estimado: $182.85</td></tr><tr><td>Placa de corte 5.0-10.0 mm</td><td>Thorlabs</td><td>SI100P</td><td>Costo estimado: $201.47</td></tr><tr><td>Placa de corte 10.0-25.4 mm</td><td>Thorlabs</td><td>SI254P</td><td>Costo estimado: $236.42</td></tr><tr><td>Pantalla de visualización de placa de corte</td><td>Thorlabs</td><td>SIVS</td><td>Costo estimado: $337.74</td></tr><tr><td>Interferómetro de cizallamiento con placa de 1-3 mm</td><td>Thorlabs</td><td>SI035</td><td>Para verificar la colimación Costo estimado: $465.85</td></tr><tr><td>Collar de poste sin cordones (x35)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>R2</td><td>Para mantener la altura del poste Costo estimado: $208.25</td></tr><tr><td>Thorlabs</td><td>VA100</td> de<td>hendidura</td><td>Costo estimado: $294.64</td></tr><tr><td>Tubo de lente ranurado, 3"</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>SM1L30C</td><td>Para alineación láser Costo estimado: $77.45</td></tr><tr><td>Espejo cuadrado, 1 x 1"</td><td></td><td></td><td>https://www.amazon.com/Small-Square-Mirror-Pieces-Mosaic/dp/B07FBNMDC1/ref=asc_df_B07FBNMDC1/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hva did=642191768069& hvpos=& hvne tw=g& hvrand=1336734911900437 4691& hvpone=& hvptwo=& hvqmt= & hvdev=c& hvdvcmdl=& hvlocint=& hvlocphy=9031212& hvtargid=pla-1 943952718742& gclid=Cj0KCQiA6L yfBhC3ARIsAG4gkF_AYBpn5EdGL q3mc-RU-nanT5vM4ac9r3-obbzqJoWKPkIPIJU6e1caAjWmEA Lw_wcB& th=1 Costo estimado: $14.76</td></tr><tr><td>Tubo de lente apilable de 1/2" (x3)</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L05</td><td>Para montar CL1-3 Costo estimado: $40.86</td></tr><tr><td>Tubo de lente apilable de 1"</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L10</td><td>Para montar O3 Costo estimado: $15.41</td></tr><tr><td>Tubo de lente apilable de 2" (x2)</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L20</td><td>Para la ruta de la cámara Costo estimado: $35.7</td></tr><tr><td>Adaptador de base de pedestal con tachuelas (x37)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>BE1</td><td>Para acoplar monturas de poste a la mesa Costo estimado: $400.71</td></tr><tr><td>Traducción de la montura de lente (x3)</td><td>Thorlabs</td><td>LM1XY</td><td>Para traducir finamente el agujero de alfiler, O2 y O3 Costo estimado: $441</td></tr><tr><td>Etapa de traducción con micrómetro estándar (x2)</td><td>Thorlabs</td><td>PT1/M</td><td>TS1-2 Costo estimado: $647.54</td></tr><tr><td>Etapa de traducción manual de viaje</td><td>Thorlabs</td><td>CT1A</td><td>Montura de traslación de jaula O3 Costo estimado: $497.3</td></tr><tr><td>Lente de tubo</td><td>Nikon</td><td>MXA20696</td><td>TL3 Costo estimado: $359</td></tr><tr><td>Thorlabs</td> <td>LED montados en blanco</td>Fuente de luz de campo claro <td>MNWHL4</td><td> Costo estimado: $171.28</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>COSTO TOTAL ESTIMADO: $84,858.98</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>Los autores señalan que muchas piezas se compraron usadas. Aquí, hemos intentado reflejar el precio de venta al público de todos los artículos, por lo que el costo total se puede reducir en gran medida comprando artículos particulares usados, especialmente los más caros.</td></tr><tr><td>COMPONENTES OPCIONALES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grasshopper3 USB3</td><td>FLIR</td><td>&nbsp; GS3-U3-23S6C-C</td><td>Para comprobaciones diagnósticas durante la alineación. En su lugar, se puede usar la cámara Acquisiton, pero requiere una realineación posterior. Costo estimado: $1089</td></tr></tbody></table>

diseño y construcción de un microscopio de fluorescencia de lámina de luz personalizable de un solo objetivo para la visualización de redes de citoesqueletos

Design and Building of a Customizable, Single-Objective, Light-Sheet Fluorescence Microscope for the Visualization of Cytoskeleton Networks

Los compuestos de citoesqueletos reconstituidos han surgido como un valioso sistema modelo para el estudio de la materia blanda fuera de equilibrio. La captura fiel de la dinámica de estas densas redes 3D requiere el corte óptico, que a menudo se asocia con los microscopios confocales de fluorescencia. Sin embargo, los desarrollos recientes en microscopía de fluorescencia de lámina de luz (LSFM) la han establecido como una alternativa rentable y, a veces, superior. Para que LSFM sea accesible para los investigadores de citoesqueletos menos familiarizados con la óptica, presentamos una guía paso a paso para principiantes sobre la construcción de un microscopio de fluorescencia de lámina de luz versátil a partir de componentes estándar. Para permitir el montaje de muestras con muestras de portaobjetos tradicionales, este LSFM sigue el diseño de hoja de luz de un solo objetivo (SOLS), que utiliza un solo objetivo tanto para la excitación como para la recolección de emisiones. Describimos la función de cada componente del SOLS con suficiente detalle para permitir a los lectores modificar la instrumentación y diseñarla para que se ajuste a sus necesidades específicas. Finalmente, demostramos el uso de este instrumento SOLS personalizado mediante la visualización de ásteres en redes de microtúbulos impulsadas por kinesina.

Se realizaron exploraciones volumétricas de perlas de 1 μm incrustadas en goma gellan. La Figura 14 muestra las proyecciones de intensidad máxima de los escaneos volumétricos desviados a lo largo de las direcciones x, y y z.
<img alt="Figure 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65411/65411fig14.jpg"> Figura 14: Imagen volumétrica de perlas fluorescentes de 1 μm en goma gellan. Se muestran las proyecciones de intensidad máxima de los escaneos volumétricos delicados. Barras de escala = 30 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65411/65411fig14large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Hemos demostrado el uso del microscopio de hoja de luz de objetivo único para caracterizar redes de citoesqueletos reconstituidas mediante la realización de barridos volumétricos de muestras de ásteres de microtúbulos. En resumen, los microtúbulos marcados con rodamina y estabilizados con taxol se polimerizaron a partir de dímeros reconstituidos por GTP; luego, después de la polimerización, se mezclaron grupos motores de quinesina basados en estreptavidina en muestras junto con ATP para concentraciones finales de 6 μM de microtúbulos, 0,5 μM de dímeros de quinesina y 10 mM de ATP. En los sitios web de Mitchson Lab y Dogic Labse pueden encontrar extensos protocolos y guías para la preparación de microtúbulos estabilizados con taxol y grupos motores de kinesina 25,26. Las muestras se pipetearon suavemente en portaobjetos de microscopio, se sellaron y se dejaron reposar durante 8 horas antes de la obtención de imágenes para permitir que cesara la actividad motora y que las muestras alcanzaran un estado estructural estable que se asemejara a los ásteres.
Los estudios de sistemas de citoesqueletos reconstituidos emplean con mayor frecuencia microscopía confocal o de epifluorescencia para obtener imágenes de filamentos marcados. Sin embargo, ambas técnicas están limitadas en su capacidad para obtener imágenes de muestras 3D densas27. Si bien se ha avanzado mucho en la investigación in vitro de la materia activa basada en citoesqueletos al restringir las muestras a ser cuasi2D 28,29, las redes de citoesqueletos son inherentemente 3D, y muchos esfuerzos actuales radican en comprender los efectos que solo pueden surgir en muestras 3D29,30, lo que crea la necesidad de imágenes 3D de alta resolución.
<img alt="Figure 15" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65411/65411fig15.jpg"> Figura 15: Facilitación de la visualización en 3D de muestras de citoesqueleto reconstituidas mediante microscopía de lámina de luz de objetivo único. (A) Imágenes de ásteres de microtúbulos fluorescentes adquiridos en un microscopio confocal de barrido láser Leica DMi8. Las imágenes muestran diferentes planos de un z-scan. Barra de escala = 30 μm. (B) Imágenes desconvolucionadas y destorcidas de un escaneo volumétrico realizado en la configuración de hoja de luz de un solo objetivo de la misma muestra. Barra de escala = 30 μm. El área de imagen distorsionada aquí corresponde al campo de visión utilizable (cuadro amarillo) que se muestra en la Figura 13B. Si bien el confocal sobresale en la obtención de imágenes de planos individuales cerca del cubreobjetos, la densidad de la muestra fluorescente presenta complicaciones cuando se obtienen imágenes en planos más altos debido a la señal adicional desde debajo del plano de imagen. La lámina de luz evita este problema iluminando solo el plano de imagen, lo que permite obtener imágenes uniformemente nítidas en diferentes planos en z. Abreviaturas: SOLS = hoja de luz de un solo objetivo; FoV = campo de visión. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65411/65411fig15large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
En la Figura 15, demostramos la obtención de imágenes volumétricas de una red de microtúbulos reconstituida contraída en estructuras similares a asters por grupos motores de kinesina. Como se ha demostrado en investigaciones previas28,31, estas estructuras 3D tienden a volverse densas hacia el centro, lo que da lugar a regiones brillantes de fluorescencia que son predominantes en la señal. En los planos de obtención de imágenes cerca del cubreobjetos (nivel z bajo), la microscopía confocal (Figura 15A) puede resolver filamentos individuales alrededor de la periferia del aster, con un fondo adicional hacia el centro debido a las señales de fluorescencia desenfocadas desde arriba. Sin embargo, moverse unas pocas micras en z reduce rápidamente la calidad de las imágenes debido a que las secciones densas desenfocadas del aster son predominantes en la señal en el plano de imagen. La iluminación de un solo plano de la lámina de luz (Figura 15B) elimina las señales desenfocadas de las partes densas del aster por encima y por debajo del plano de imagen, lo que permite una calidad de imagen comparable entre los planos. La capacidad de la lámina de luz para producir datos de escaneo volumétrico confiables y de alta calidad abre la posibilidad de visualizar y caracterizar fenómenos 3D en sistemas de citoesqueletos reconstituidos.

Este protocolo describe en detalle cómo construir un microscopio de fluorescencia de hoja de luz de un solo objetivo y su uso para visualizar redes de citoesqueletos.

Diseño y construcción de un microscopio de fluorescencia de lámina de luz personalizable de un solo objetivo para la visualización de redes de citoesqueletos

Reconstituted cytoskeleton composites have emerged as a valuable model system for studying non-equilibrium soft matter. The faithful capture of the ...

Nuestro trabajo tiene como objetivo avanzar en el conocimiento sobre la relación entre la dinámica de trabajo trans, la estructura local y las propiedades mecánicas en materiales alejados del equilibrio. La visualización de materiales alejados del equilibrio, como las redes de citoesqueletos, requiere la capacidad de obtener imágenes de muestras densas y tridimensionales con una calidad de imagen comparable en todo el volumen de la muestra, al tiempo que causa un daño mínimo a través del fotoblanqueo, una tarea técnicamente desafiante para la que la microscopía de lámina de luz de fluorescencia es la más adecuada. Los sistemas de microscopio de lámina de luz fluorescente proporcionan excelentes capacidades de seccionamiento óptico, lo que permite obtener imágenes de estas muestras gruesas y tridimensionales para escalas de tiempo largas con un fotoblanqueo mínimo.En particular, el sistema de lámina de luz de objetivo único que presentaremos es compatible con las muestras tradicionales montadas en portaobjetos, lo que lo convierte en una herramienta muy versátil. La inmensa mayoría de las guías de hojas de luz de un solo objetivo están escritas para usuarios con amplia experiencia en óptica. Para hacer más accesible la compleja configuración del estilo de hoja de luz de un solo objetivo, esta guía detallada proporciona los pasos que puede seguir un usuario con un curso de óptica de nivel básico.

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Investigación

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Biology

Biología

En muchas situaciones clínicas y biológicas es conveniente estudiar los procesos celulares a medida que evolucionan en su microambiente nativa. A continuación se describe el montaje y el uso de un bajo costo de fibra óptica de microscopio que puede ofrecer imágenes en tiempo real en el cultivo celular, los estudios en animales y estudios clínicos del paciente.

De alta resolución de fibra óptica para Microendoscopy In situ Celular imágenes

Imágenes microscópicas de vida las células endoteliales que expresan GFP-actina permite la caracterización de los cambios dinámicos en las estructuras del citoesqueleto. A diferencia de las técnicas que utilizan las muestras fijadas, este método proporciona una evaluación detallada de los cambios temporales en el citoesqueleto de actina en las células del mismo, antes, durante y después de diversos estímulos físicos, farmacológicos o inflamatorios.

Estudio del citoesqueleto de actina en vivo las células endoteliales que expresan GFP-actina

Este protocolo se describe la configuración de un microscopio de lámina de luz y su aplicación para la visualización in vivo de C. elegans embriones.

Configuración de un microscopio de luz Hoja simple para<em&gt; En Toto</em&gt; Imágenes de<em&gt; C. elegans</em&gt; Desarrollo

Un módulo para la iluminación microscopía de plano único (SPIM) se describe que se adapta fácilmente a un microscopio de campo amplio invertida y optimizado para cultivos celulares 3-dimensionales. La muestra se encuentra dentro de un capilar rectangular, y a través de un sistema de microfluidos colorantes fluorescentes, agentes farmacéuticos o medicamentos puede ser aplicado en pequeñas cantidades.

Módulo de iluminación solo plano y Aproximación Micro-capilar para un microscopio de campo amplio

Aquí se muestra la preparación de bicapas lipídicas planas funcionalizadas con proteínas, la determinación de la movilidad de las proteínas en su interior y la medición de las densidades de las proteínas. Se esboza una hoja de ruta para la construcción de un microscopio de reflexión interna total con reducción de ruido, que permite visualizar fluorocromos residentes de una sola capa con alta resolución espacio-temporal.

Bilayers Individual Molécula microscopía de fluorescencia en planar compatibles

En este sentido, describimos un microscopio de luz para visualizar el infiltrado de leucocitos CD45 + cardíaco en un modelo murino de miocarditis fulminante aséptica, que es inducido por el tratamiento de la toxina diftérica intratraqueal de ratones CD11c.DTR.

Visualización Cuantitativa del Infiltrado de Leucocitos en un Modelo Murino de Miocarditis Fulminante por Microscopía de Hoja Ligera

Imágenes de la morfogénesis de los embriones de insectos con microscopía de fluorescencia basada en la hoja de luz se ha convertido en estado de la técnica. Este protocolo describe y compara tres técnicas de montaje adecuadas para los embriones Tribolium castaneum, introduce dos nuevos líneas transgénicas medida muy adecuado para imágenes en vivo, discute los controles de calidad esenciales e indica limitaciones experimentales actuales.

Microscopía de fluorescencia de vida o fijadas y teñidas a base de hoja de luz<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Los embriones

Aquí, describimos un protocolo para la visualización de proyección de la neurona de motor y arborización de axon en embriones de ratón Hb9::GFP transgénicos. Después de inmunotinción para las neuronas motoras, se utilizó microscopía de fluorescencia de la ficha técnica de iluminación a los embriones de la imagen para el posterior análisis cuantitativo. Este protocolo es aplicable a otros procesos de navegación de la neurona en el sistema nervioso central.

Visualización de la navegación del axón Motor y cuantificación de arborización de Axon en embriones de ratón utilizando microscopía de fluorescencia de la ficha técnica de iluminación

Este estudio utiliza una técnica de microscopía (LSFM) de hoja de luz fluorescencia iluminación doble cara combinada con la compensación óptica para estudiar el corazón murino.

Hoja de luz fluorescencia microscopía para el estudio del corazón murino

Una instrucción detallada se describe en cómo construir una muy inclinada de barrido microscopio de azulejo (HIST) y su uso para la proyección de imagen de una sola molécula.

Una guía para crear un altamente inclinado barrido microscopio de azulejo para la proyección de imagen de una sola molécula campo de visión extendida

La microscopía de fluorescencia basada en láminas de luz es la herramienta más valiosa en biología del desarrollo. Un problema importante en los estudios comparativos es la varianza ambiental. Nuestro protocolo describe un marco experimental para la proyección de imagen viva simultánea de especímenes múltiples y, por lo tanto, trata este problema favorablemente activamente.

Imágenes simultáneas en vivo de múltiples embriones de insectos en microscopios de fluorescencia de hoja de luz basados en cámaras de muestra

Aprende a construir un microscopio de fluorescencia de lámina de luz de un solo objetivo para visualizar redes de citoesqueletos en muestras tridimensionales densas. Este método minimiza el fotoblanqueo y permite imaginar estructuras biológicas complejas con excelente calidad óptica.

Diseño y construcción de un microscopio de fluorescencia de lámina de luz personalizable de un solo objetivo para la visualización de redes de citoesqueletos (Video) | JoVE Journal

Diseño y construcción de un microscopio de fluorescencia de lámina de luz personalizable de un solo objetivo para la visualización de redes de citoesqueletos

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