Name: Un material fantasma estable para imágenes ópticas y acústicas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-16T12:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 54 s
Description: Aprende a fabricar un material fantasma estable para imágenes ópticas y acústicas usando polímeros SEBS y LDPE en aceite mineral. Este protocolo valida modalidades de imagen biomédica con propiedades ajustables.

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LH fue financiado por el programa MedAccel de NPL financiado por el Fondo de Desafío de Estrategia Industrial del Departamento de Negocios, Energía y Estrategia Industrial. JMG recibió financiación de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundación Alemana de Investigación) en el marco del proyecto GR 5824/1. JJ reconoce el apoyo financiero del premio Springboard de la Academia de Ciencias Médicas (REF: SBF007 \ 100007). SEB reconoce el apoyo de Cancer Research UK bajo el número de subvención C9545/A29580. AMI, BZ y SR fueron apoyados por el Departamento de Negocios, Energía y Estrategia Industrial del Reino Unido a través de la financiación del Sistema Nacional de Medición. La Figura 1 y la Figura 2 se crearon con BioRender.

Tabla 1: Descripción general de las propiedades acústicas y ópticas encontradas en los tejidos blandos. Las propiedades ópticas cubren un espectro que va de 600 a 900 nm. Cabe señalar que estos son solo valores representativos destinados a proporcionar orientación general. Los valores precisos pueden variar dependiendo de la condición experimental (por ejemplo, temperatura) y frecuencia/longitud de onda. La literatura proporciona valores más específicos. *No se encontró ninguna referencia específica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65475/65475_Table%201_rev.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
El protocolo dado ha sido desarrollado para hacer ~ 120 ml de material fantasma. Las masas de los componentes se pueden escalar para hacer diferentes volúmenes de material fantasma. Tenga en cuenta que para volúmenes más grandes (&gt;500 ml), es posible que el equipo propuesto no pueda calentar suficientemente la mezcla fantasma de manera homogénea. Para ello, los equipos de calefacción deben adaptarse adecuadamente.
PRECAUCIÓN: Asegúrese siempre de que se use el equipo de protección personal (EPP) adecuado durante todo el proceso de fabricación. Esto puede incluir el uso de batas de laboratorio, gafas de seguridad y guantes de seguridad; Consulte y cumpla con las pautas de seguridad locales. El procedimiento está adaptado de Hacker et al.39; en la figura 1 se muestra un resumen de los pasos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65475/65475fig01.jpg"> Figura 1: Fabricación del material de copolímero en aceite. (1) Los materiales para la dispersión óptica y la absorción se añaden al aceite mineral y (2) se suonican a 90 °C hasta que se disuelven. (3) Se añaden polímeros y estabilizadores, y (4) la mezcla se calienta en un baño de aceite a 160 °C con agitación baja. (5) Tras la disolución de todos los componentes, la muestra se vierte en un molde fantasma adecuado y (6) se deja endurecer a temperatura ambiente. Esta figura se reproduce de Hacker et al.39. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65475/65475fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
1. Preparación de la mezcla
<ol><li>Preparar la solución madre de nigrosina añadiendo 0,4 g de nigrosina a 40 ml de aceite mineral. Asegurar una mezcla homogénea por sonicación y vórtice minucioso de la muestra. Guarde la solución madre a temperatura ambiente. NOTA: La solución madre siempre debe mezclarse bien antes de volver a utilizarla. Si se prefiere un material fantasma sin dispersor óptico (TiO 2) o absorbedor (tinte), se pueden omitir los pasos 1 y2. Continúe con el paso 3.</li>
	<li>Sonicar 0,15 g deTiO2 y 1 ml de la solución madre de colorante en 100 ml (83,8 g) de aceite mineral hasta que todos los componentes se hayan disuelto completamente (~60 min) (Figura 1: pasos 1 y 2). Ajuste el sonicador a temperaturas elevadas (90 °C) si el equipo lo permite, ya que esto facilita el proceso de mezcla. Continúe con los pasos 3-5 durante el tiempo de sonicación. NOTA: Si se prefiere un fantasma con mayores propiedades de absorción y dispersión, es posible que sea necesario extender el tiempo de sonicación.</li>
	<li>Pesar el poliestireno-bloque-poli(etileno-ran-butileno)-bloque-poliestireno (SEBS) y el polietileno de baja densidad (LDPE) a las concentraciones deseadas (p. ej., SEBS = 25,14 g; LDPE = 6,70 g) (Figura 1: paso 3).<ol><li>Opcional: Se puede agregar un antioxidante para aumentar la estabilidad, pero no es obligatorio si las temperaturas de calentamiento no superan los 180 ° C. NOTA: En caso de que se encuentren problemas de solubilidad o viscosidad en una etapa posterior del proceso de fabricación, es aconsejable excluir el LDPE. Se incorpora LDPE para mejorar la velocidad del sonido en el material (Tabla 3); Sin embargo, no es obligatorio para crear un fantasma estable. Al omitir el LDPE, el proceso de fabricación y moldeo se puede simplificar, pero resultará en una disminución en la velocidad posterior del sonido del material final (Tabla 3).</li>
	</ol></li>
	<li>Cree un baño de aceite con cristalería adecuada y aceite de silicona; Con cuidado, asegúrelo en la placa eléctrica. Asegúrese de que el termopar permanezca en el baño de aceite de silicona y no toque los bordes de la cristalería durante todo el procedimiento (Figura 2). NOTA: Asegúrese de que el accesorio termorregulador esté montado cuidadosamente, según las instrucciones del fabricante del equipo.</li>
	<li>Coloque una barra agitadora magnética de longitud adecuada dentro del baño de aceite para garantizar una distribución uniforme del calor.</li>
	<li>Encienda la placa calefactora, ajuste la temperatura de calentamiento a 160 °C y ajuste las revoluciones por minuto (rpm) del agitador a 50.</li>
	<li>Transfiera el LDPE y el SEBS al vaso de precipitados de vidrio que contiene el aceite mineral sonicado (con TiO2 y Nigrosin). Introduzca una barra agitadora magnética de longitud adecuada en el vaso de precipitados de vidrio y transfiérala al centro del baño de aceite para calentar los componentes medidos. Asegúrese de que el nivel de aceite en el baño permanezca por encima del nivel de aceite mineral dentro del vaso de precipitados (Figura 1: paso 4).</li>
</ol>2. Calentar la mezcla
<ol><li>Si en cualquier etapa el polímero añadido parece flotar sobre el aceite mineral, agite manualmente la solución de aceite mineral con una espátula metálica, de modo que cualquier polímero flotante se distribuya dentro del aceite mineral. Use guantes resistentes al calor.</li>
	<li>Dejar la mezcla a 160 °C hasta que todo el polímero se haya disuelto y la solución aparezca uniformemente mezclada, con una textura lisa y homogénea (~1,5 h).</li>
</ol>3. Aspirar
NOTA: Para eliminar burbujas de aire, siga los siguientes pasos, dependiendo del equipo disponible.
<ol><li>Coloque el vaso de precipitados caliente con cuidado en la cámara de vacío y aspire las muestras durante 2-3 minutos en el ajuste más alto ( vacío más bajo). Use una espátula metálica para eliminar cuidadosamente cualquier burbuja de aire que se acumule en la superficie. Si las burbujas de aire todavía están presentes después de este paso, vuelva a calentar la mezcla y repita el paso de aspiración hasta que se hayan eliminado todas las burbujas de aire.</li>
	<li>Encienda el horno de vacío y caliéntelo hasta 160 °C. Una vez que haya alcanzado la temperatura deseada, transfiera el vaso de precipitados con la solución al horno de vacío. NOTA: Siempre manipule el vaso de precipitados con guantes protectores contra el calor.<ol><li>Encienda la aspiradora al ajuste más alto (vacío más bajo) disponible. Si se ha producido una capa de espuma encima de la solución, apague el vacío y retire las burbujas de la superficie con una espátula (repita este paso hasta que se hayan eliminado todas las burbujas de aire).</li>
		<li>Deje el vaso de precipitados en el horno de vacío durante 1 h al vacío más alto. NOTA: Para mantener limpio el horno de vacío, limpie la superficie externa del vaso de precipitados de aceite de silicona con una toalla de papel. </li>
	</ol></li>
</ol>4. Verter las muestras en el molde
<ol><li>Antes de verter las muestras en moldes de muestras, retire cualquier burbuja de aire restante en la superficie de la mezcla con una espátula si es necesario.</li>
	<li>Vierta cuidadosamente la solución en un molde adecuado, usando guantes resistentes al calor o usando el equipo de protección adecuado. Asegure un vertido suave y constante desde una altura baja para reducir la posibilidad de que se formen burbujas de aire (Figura 1: paso 5). Para moldes con formas complejas, cubra el molde con una capa delgada de aceite (que no sea aceite mineral [por ejemplo, aceite de ricino o silicona]) antes de verterlo para facilitar la extracción de la muestra curada. NOTA: El precalentamiento de los moldes en un horno puede ayudar a lograr una mayor homogeneidad de la muestra.</li>
	<li>Retire cualquier burbuja de aire de la parte superior de las muestras rápidamente con una espátula metálica una vez vertida. Si se han acumulado numerosas burbujas de aire dentro de la mezcla, repita el paso de vacío, siempre que el tipo y la forma del molde lo permitan.</li>
	<li>Deje que la solución se ajuste a temperatura ambiente. Aunque las muestras más pequeñas pueden curarse en menos de 2 h, deje las muestras durante la noche para eliminar cualquier riesgo de curado incompleto. Almacene las muestras a temperatura ambiente (Figura 1: paso 6).</li>
</ol>5. Adquisición de imágenes
<ol><li>Para la adquisición de imágenes, coloque el fantasma en el campo de visión del dispositivo de imágenes.</li>
	<li>Para PAI o sistemas de ultrasonido, realice el acoplamiento acústico de la superficie fantasma al transductor de ultrasonido, por ejemplo, con gel de ultrasonido o agua. NOTA: Si el protocolo se ha seguido correctamente, ninguna falta de homogeneidad debería perturbar el campo de visión. Los soportes fantasma personalizados pueden ayudar en el posicionamiento de muestras repetibles entre mediciones.</li>
	<li>Si la temperatura de adquisición difiere de la temperatura de almacenamiento del fantasma, permita que la temperatura fantasma se estabilice con el entorno.</li>
	<li>Adquirir una imagen.</li>
</ol>6. Mediciones de caracterización de materiales
NOTA: El propósito de las mediciones de caracterización de materiales es la verificación de las propiedades ópticas y acústicas del material. Cabe señalar que el protocolo de fabricación fantasma ha demostrado una alta reproducibilidad39, por lo que los protocolos generales de medición que siguen solo se proporcionan como orientación si se desean estudios de verificación adicionales. Los pasos individuales de las mediciones dependerán del equipo de caracterización utilizado. En este caso, se empleó un sistema basado en un método de sustitución de transmisión de banda ancha41 (disponible en el National Physical Laboratory (NPL), Reino Unido) para la caracterización acústica y se utilizó un sistema interno de doble esfera integradora (DIS) (basado en 42) para la caracterización óptica. La configuración de los sistemas de caracterización se muestra en la Figura complementaria 1. Detalles adicionales sobre las configuraciones de medición (acústica43; óptica42,44) y el procedimiento de medición39 se pueden encontrar en otra parte. El procedimiento de medición debe adaptarse en consecuencia a cada sistema de caracterización específico utilizado.
<ol><li>Caracterización acústica NOTA: Las mediciones de caracterización acústica se basan en un sistema que emplea un transductor de ultrasonido de frecuencia central de 10 MHz (diámetro del elemento activo de 10 mm) para la generación de pulsos y un hidrófono de banda ancha (hidrófono de membrana bilaminar de 30 mm de diámetro de elemento activo) para la detección de pulsos (ambos colocados en un tanque de agua lleno de agua desionizada; dimensiones de 112 cm x 38 cm x 30 cm3). El transductor es accionado por un pulsador-receptor. Las formas de onda se adquieren utilizando un osciloscopio. Se pueden encontrar más detalles sobre el procedimiento de configuración y medición (incluidos los efectos de tipo B específicos del sistema en las mediciones) en 43.<ol><li>Prepare muestras adecuadas para la configuración de medición (por ejemplo, en este caso, muestras circulares con un diámetro de 7-8 cm y un grosor de 6-9 mm). Asegúrese de que las muestras sean de composición homogénea y libres de impurezas, burbujas de aire o irregularidades superficiales.</li>
		<li>Mida el grosor de la muestra de prueba con calibradores vernier y registre la temperatura del tanque de agua con un termómetro calibrado.</li>
		<li>Coloque la muestra en el sistema. Asegúrese de que la muestra esté correctamente alineada con los componentes del sistema. NOTA: Un portamuestras controlado automáticamente basado en un soporte de cardán43 puede ayudar a controlar con precisión la rotación y la inclinación de la muestra.</li>
		<li>Adquirir cuatro pulsos acústicos para cada conjunto de medición: un pulso de referencia a través del agua sin muestra presente en la trayectoria acústica; una transmisión a través de la muestra; y reflexiones acústicas recibidas en el transmisor desde las superficies delantera y trasera de la muestra.</li>
		<li>Derivar las propiedades acústicas de la muestra a partir de las mediciones. Calcula la velocidad del sonido c(f ) (en m·s−1) usando la ecuación (1)43. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65475/65475eq01.jpg" style="margin: auto;">(1) CW representa la velocidad dependiente de la temperatura del sonido del agua, y θ1 (f), θ2 (f), θw (f) y θs (f) son los espectros de fase no envueltos correspondientes de los pulsos de voltaje reflejados frontalmente, retroreflejados, a través del agua y a través de la muestra, respectivamente. El coeficiente de atenuación dependiente de la frecuencia (αi(f)) del material puede obtenerse utilizando la técnica de sustitución de dos muestras que se muestra en la ecuación (2)43. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/65475/65475eq02v2.jpg" style="margin: auto;">(2) U w(f) y Us(f) son los respectivos espectros de magnitud de voltaje del pulso a través del agua y a través de la muestra, αw(f) es el coeficiente de atenuación del ultrasonido (en dB·cm-1) del agua pura a la temperatura específica del tanque de agua45, y d 1 y d 2 (d 2 &gt; d1) son dos espesores de muestra. NOTA: Para el presente protocolo, se evaluó la atenuación que contabiliza las pérdidas interfaciales, encontrando que su impacto es insignificante.</li>
		<li>Repita la medición más de tres veces en diferentes posiciones de la muestra problema. Calcule la media y la desviación estándar de las mediciones para obtener un valor de muestra final.</li>
	</ol></li>
	<li>Caracterización óptica NOTA: Para las pruebas ópticas, se utilizó un sistema de esfera de doble integración (basado en 42), empleando dos esferas integradoras (50 mm de diámetro interno) que están conectadas a dos espectrómetros a través de dos fibras ópticas. La esfera de reflectancia está conectada a una fuente de luz a través de una tercera fibra óptica.<ol><li>Prepare muestras adecuadas para la configuración de medición (por ejemplo, en este caso, muestras rectangulares con un ancho de 5,9 cm, una altura de 1,8 cm y un grosor que oscile entre 2 y 3 mm). Asegúrese de que las muestras sean de composición homogénea y libres de impurezas, burbujas de aire o irregularidades superficiales.</li>
		<li>Encienda la fuente de luz y deje que se estabilice de acuerdo con las instrucciones del fabricante (por ejemplo, 15 min).</li>
		<li>Determine el grosor de la muestra utilizando calibradores vernier. Si corresponde, especifique el rango de longitud de onda y el tamaño del paso para la medición (por ejemplo, 450-900 nm con un tamaño de paso de 1 nm).</li>
		<li>Registre las mediciones de referencia para la esfera de transmisión y reflectancia.<ol><li>Para la esfera de reflectancia, primero tome una medición de puerto abierto registrando el valor de reflectancia R0 con la esfera de transmitancia eliminada y la fuente de luz encendida. Luego, registre el valor de reflectancia R1 con un estándar de referencia colocado delante de la esfera de reflectancia (fuente de luz encendida).</li>
			<li>Para la esfera de transmitancia, primero tome una medición de haz bloqueado registrando el valor de transmitancia T0 con las esferas de reflectancia y transmitancia alineadas y la fuente de luz apagadas. Luego, tome una medición de haz incidente registrando el valor de transmitancia T1 con las esferas de reflectancia y transmitancia alineadas y la fuente de luz encendidas. NOTA: Se debe garantizar una superficie limpia de las esferas y un patrón de referencia para las mediciones, ya que la adherencia de polvo u otros contaminantes puede afectar el rendimiento de los componentes46.</li>
		</ol></li>
		<li>Coloque la muestra entre las esferas. Mida los valores de reflectancia Rs y transmitancia Ts. Asegúrese de que la muestra no esté comprimida, ya que esto puede afectar la precisión de la medición. Colocar una esfera en una plataforma motorizada puede ayudar a controlar con precisión la distancia entre las esferas adaptándola al grosor de la muestra medida.</li>
		<li>Calcule los valores normalizados de reflectancia M R y transmitancia MT utilizando las ecuaciones (3) y (4)42. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/65475/65475eq03.jpg" style="margin: auto;">(3) <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/65475/65475eq04.jpg" style="margin: auto;">(4) RSTD representa la intensidad reflejada por el estándar de reflectancia del 99%.</li>
		<li>Introduzca los valores medidos en un programa de duplicación sumada inversa (IAD) (código fuente: http://omlc.org/software/iad/)44 para estimar las propiedades ópticas del material. NOTA: Sobre la base de informes anteriores, el factor de anisotropía de dispersión (g) se puede tomar como g = 0,7, y el índice de refracción como n = 1,4 30.</li>
		<li>Repita la medición al menos tres veces en diferentes posiciones a lo largo de la muestra problema. Calcule la media y la desviación estándar de las mediciones para obtener un valor de muestra final.</li>
	</ol></li>
</ol>

Fabricación de un material fantasma estable y biológicamente relevante

Sarah Bohndiek ha recibido previamente apoyo de investigación de CYBERDYNE INC e iThera Medical GmbH, proveedores de instrumentos de imagen fotoacústica. Los otros autores no tienen ningún conflicto de intereses relacionado con el presente manuscrito para revelar.

Aquí, se presenta un protocolo que tiene como objetivo proporcionar una receta versátil para un material estable y biológicamente relevante que se puede utilizar para crear fantasmas para mediciones de calibración y estandarización en aplicaciones multimodales de imágenes biomédicas acústicas y ópticas. Anteriormente se ha demostrado que el material es estable a lo largo del tiempo39, tiene una alta reproducibilidad de lote a lote, es seguro de usar y consiste en ingredientes rentables y fácilmente disponibles de proveedores científicos estándar. Las propiedades del material son ajustables independientemente a través de regímenes acústicos y ópticos relevantes. Además, es mecánicamente robusto e insoluble en agua, por lo que resiste un manejo brusco, y es inerte a los agentes de acoplamiento a base de agua que se utilizan en la investigación ultrasónica / fotoacústica. Se destacó que se pueden crear diferentes diseños fantasmas con diferentes tipos de inclusiones, compuestas por el mismo o por diferentes tipos de materiales. Dadas estas propiedades, el material cumple con los criterios clave antes mencionados para un fantasma biofotónico ideal y muestra ventajas clave en comparación con otros materiales existentes que imitan el tejido3. Al detallar el proceso de fabricación exacto, esperamos minimizar las variaciones derivadas del procedimiento de fabricación, optimizando así su uso para calibrar, validar y rastrear el rendimiento de los sistemas de imágenes.
Se han identificado dos pasos clave como críticos para el proceso de fabricación. Primero, los ingredientes deben mezclarse bien y calentarse uniformemente para crear un material homogéneo. El uso de un sonicador y agitador magnético para mezclar y un baño de aceite para calentar garantiza la distribución uniforme de los componentes del material dentro de la matriz base. Se debe tener cuidado de que el baño de aceite no alcance temperaturas muy altas (>180 ° C), ya que esto dará lugar a la oxidación de los componentes del material, lo que provocará una decoloración amarillenta. La agitación manual puede apoyar el proceso de mezcla y compensa el calentamiento insuficiente de la interfaz material-aire. El tiempo de sonicación y mezcla puede necesitar ser extendido cuando se utiliza una mayor concentración deTiO2 y / o polímeros para garantizar una composición homogénea del material. En segundo lugar, las burbujas de aire deben eliminarse para evitar la formación de heterogeneidades dentro de la matriz base. Si bien esto se puede lograr con una bomba de vacío u horno, también se debe practicar un vertido cuidadoso desde una altura baja para minimizar el aire atrapado dentro del material.
Una ventaja significativa del material son sus propiedades termoplásticas (derivadas del polímero SEBS), lo que permite ser recalentado y remoldeado sin ningún impacto significativo en sus propiedades acústicas y ópticas39. Sin embargo, el recalentamiento debe realizarse de forma gradual y cuidadosa, ya que el material puede quemarse y oxidarse fácilmente si se recalienta demasiado rápido. El recalentamiento también se vuelve más difícil cuando se utilizan concentraciones más altas de LDPE, ya que el LDPE no exhibe el mismo comportamiento termoplástico que SEBS.
Siguen existiendo varias limitaciones del protocolo. Debido a la alta temperatura de fusión de los polímeros (150 ° C), los moldes fantasmas deben estar hechos de un material resistente al calor, como vidrio o acero inoxidable. Además, el material es bastante viscoso en estado líquido si se utiliza una alta concentración de polímero para ajustar las propiedades acústicas, lo que dificulta el llenado de pequeños objetivos de imagen. Finalmente, la afinación de las propiedades acústicas se limita hasta ahora a una velocidad de rango de sonido de ~ 1450-1,516 m · s-1 que admite imitar tejidos como el pecho o la grasa (c = 1,450-1,480 m · s−1), pero puede ser insuficiente para tejidos como el músculo o el riñón (c > 1,520 m · s−1). También debe tenerse en cuenta el cambio concomitante de la atenuación acústica.
Aquí, hemos destacado la aplicación del material como un fantasma estable para aplicaciones de ultrasonido e imágenes ópticas. Sin embargo, los materiales de copolímero en aceite también han demostrado ser valiosos en aplicaciones de elastografía35, y podrían permitir la compatibilidad con otras modalidades de imagen, como la resonancia magnética. El aumento del realismo anatómico de los fantasmas se puede lograr utilizando moldes impresos en 3D, como se muestra en estudios similares 29,47,48,49. Los primeros estudios también han demostrado la capacidad de impresión 3D del material en sí, ampliando aún más su flexibilidad en términos de procesamiento y fabricación. Estos desarrollos resaltan el emocionante potencial futuro del material como un medio fantasma estable y ampliamente utilizado para aplicaciones de imágenes multimodales.

Establecer la precisión y exactitud de nuevos biomarcadores de imagen óptica a través de la validación técnica 1,2 es fundamental para garantizar su implementación exitosa en la práctica clínica. Para lograr esto, los estudios de validación técnica con frecuencia emplean fantasmas físicos duraderos, que facilitan la evaluación del rendimiento entre instrumentos y el control de calidad de rutina. Para el uso generalizado de un material fantasma en la investigación y la traducción clínica, se requiere un protocolo de fabricación simple y altamente reproducible. Un material fantasma biofotónico ideal debe incluir las siguientes propiedades3: (1) propiedades sintonizables independientemente dentro de rangos biológicamente relevantes; (2) robustez mecánica; 3) estabilidad a largo plazo; (4) flexibilidad en geometría y arquitectura; (5) manejo seguro; (6) ingredientes ampliamente disponibles que pueden comprarse a proveedores científicos estándar; y (7) bajo costo. En la actualidad, las aplicaciones biofotónicas carecen de un protocolo estandarizado para un material fantasma ampliamente aceptado que cumpla con los requisitos descritos y también incluya propiedades acústicas sintonizables para aplicaciones híbridas, como la imagen fotoacústica (PAI).
Los materiales fantasma biológicamente relevantes destinados a aplicaciones ópticas y acústicas combinadas incluyen hidrogeles4,5, alcohol polivinílico (PVA)6,7,8,9 y plastisol de cloruro de polivinilo (PVCP)10,11,12,13,14,15,16 . Sin embargo, estos materiales se caracterizan por ciertas limitaciones que restringen su aplicación como material fantasma estable. Los hidrogeles, por ejemplo, son propensos a la deshidratación, daño mecánico y crecimiento bacteriano, limitando su vida útil17,18,19. La adición de productos químicos puede aumentar la longevidad, pero los conservantes comunes, como el formaldehído20 o el cloruro de benzalconio21, son peligrosos y requieren medidas de precaución durante la manipulación. Además, los objetivos que contienen colorantes solubles en agua pueden difundirse dentro del material base si no están encapsulados. Los criogeles de PVA se caracterizan por una mayor longevidad y robustez estructural, pero su proceso de preparación implica largos ciclos de congelación-descongelación22. Esto puede limitar la sintonización independiente de los parámetros acústicos y ópticos23 y, si varía ligeramente, puede conducir a inhomogeneidades6, comprometiendo así la reproducibilidad. Además, la difusión de colorantes a partir de inclusiones se ha observado después de 1 año13. El PVCP tiene un proceso de fabricación complejo que incluye altas temperaturas de hasta 180-220 °C 13,14,24,25. El PVCP también adolece de una falta de cadena de suministro con proveedores científicos26 y puede contener plastificantes a base de ftalatos, que pueden causar daños reproductivos y de desarrollo27, lo que los convierte en sustancias controladas en algunos países.
Las composiciones de copolímero en aceite, como la cera de gel 28,29,30,31 o las mezclas basadas en elastómeros estirénicos termoplásticos 32,33,34,35,36, exhiben una buena estabilidad longitudinal y presentan propiedades acústicas y ópticas similares a los tejidos 31,35,36,37 , por lo que tiene un alto potencial como candidato fantasma duradero en aplicaciones multimodales. Además, esta clase de material es rentable, no absorbe agua, no es tóxico y biológicamente inerte35,38. La velocidad del sonido c(f) y el coeficiente de atenuación acústica α(f) pueden ajustarse en un intervalo biológicamente relevante (cuadro 1) mediante la variación de la concentración del polímero 33,35,39, mientras que la absorción óptica μa(λ) y la dispersión reducida μlos coeficientes s'(λ) pueden variar principalmente mediante la adición de colorantes solubles en aceite o dióxido de titanio (TiO2)39, respectivamente.
Aquí, se presenta un protocolo simple y fácil de seguir para la creación de fantasmas duraderos de copolímero en aceite adecuados para su uso en calibración óptica, de ultrasonido o de dispositivos fotoacústicos. Todos los ingredientes tienen números definidos del Chemical Abstract Service (CAS) y están fácilmente disponibles a través de proveedores científicos estándar. Se destacan las posibles dificultades en el procedimiento de fabricación y se presentan formas de superarlas. Mientras que el protocolo permite la fabricación de materiales con una gama de propiedades acústicas y ópticas, el protocolo presentado produce un material con una velocidad de sonido de ~1.481 m·s-1, alineándose con la velocidad del sonido del agua a temperatura ambiente (20 °C)40. Este valor fue seleccionado como un estándar neutral para representar la amplia gama de propiedades tisulares existentes (Tabla 1), permitiendo el establecimiento de un punto de referencia consistente y confiable para la comparación. Al proporcionar este protocolo detallado, nuestro objetivo es ampliar la aceptación y la reproducibilidad de fabricación de este prometedor tipo de material fantasma, facilitando así los estudios de validación biofotónica, acústica y fotoacústica y apoyando el control de calidad de rutina en aplicaciones de imágenes preclínicas y clínicas.

<table><tbody><tr><td>Polietileno de baja densidad (LDPE)</td><td>Alfa Aesar&nbsp;</td><td>43949.30 CAS: 9002-88-4</td><td>6.70 g 5.8% p/p</td></tr><tr><td>Aceite mineral</td><td>Sigma Aldrich</td><td>330779-1L CAS: 8042-47-5</td><td>83.80 g 72.5% p/p</td></tr><tr><td>Nigrosin&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>211680-100G CAS: 11099-03-9</td><td>0.4 g&nbsp;</td></tr><tr><td>Poliestireno-bloque-poli(etileno-ran-butileno)-bloque-poliestireno (SEBS)</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>200557-250G CAS: 66070-58-4</td><td>25.14 g 21.7% p/p</td></tr><tr><td>Aceite de silicona para baño de aceite</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>85409-1L CAS: 63148-62-9 ~1 L (dependiendo del tamaño del baño de aceite)Óxido de</td> titanio (IV), <td></td></tr><tr><td>anatasa (TiO2)</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>232033 CAS: 1317-70-0</td><td>0.15 g</td></tr><tr><td>Antioxidante (opcional; p. ej., hidroxitolueno)</td> <td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>W218405-1KG-K CAS: Se puede agregar 128-37-0</td><td>para evitar la decoloración si se utilizan temperaturas de fabricación más altas&nbsp;</td></tr><tr>Se pueden agregar <td>tintes de aceite olule para inclusiones (opcional),</td> <td>por ejemplo, tintas de alivio de lavado seguras Caligo, Cranfield Colours, Cwmbran, UK*</td><td></td> <td>según la absorción preferida</td></tr><tr><td>Bath Sonicator&nbsp;</td><td>Ultrawave Ltd, Reino Unido*</td><td>Baño de limpieza ultrasónico U500H*</td><td>idealmente con control de temperatura; frecuencias de funcionamiento recomendadas entre 30-50 kHz)</td></tr><tr><td>Plato de cristalización para baño de aceite de silicona (hasta +200 &deg; C)</td> <td>cualquier proveedor</td><td></td> adecuado <td>(diámetro ext. ~ 140 mm para vaso de precipitados de vidrio de 250 mL)</td></tr><tr><td>Vaso de vidrio (~ 250 mL); platos de muestra de vidrio / molde fantasma</td><td>cualquier proveedor</td><td></td><td></td>adecuado</tr><tr><td>Placa calefactora con agitador magnético y termorregulador (termopar de sonda externa) con temperatura máxima de > 200 & grados; C</td><td>Thermo Fisher Scientific, Reino Unido*</td><td>Velp Scientifica AREC. X Agitador digital de placa calefactora de cerámica*</td><td></td></tr><tr><td>Básculas de laboratorio / balanzas científicas con una precisión de 0,01 g</td><td>cualquier proveedor</td><td></td><td></td>adecuado</tr><tr><td>Espátula metálica</td><td>cualquier proveedor</td><td></td><td></td>adecuado</tr><tr><td>Horno de vacío o cámara de vacío</td><td>Memmert, Alemania (Horno de vacío)* Cole-Parmer Instrument Company, Reino Unido (Cámara de vacío)*</td><td>VO29 (Horno de vacío) DWK Life Sciences (Kimble) Desecador de vacío de vidrio con collar (cámara de vacío)*</td><td></td></tr><tr><td>1. Sistema de caracterización acústica*</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hidrófono</td><td>GEC Marconi</td><td>30 mm de diámetro de elemento activo membrana bilaminar hidrófono</td><td></td></tr><tr><td>Osciloscopio</td><td>Tektronix UK, Bracknell, UK</td><td>DPO 7254&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pulsador &ndash; receptor&nbsp;</td><td>Olympus NDT, Waltham, MA, EE. UU</td>. <td>Olympus 5073PR</td><td></td></tr><tr><td>Portamuestras</td><td>Newport Spectra-Physics, Didcot, Reino Unido</td> La <td>montura óptica de cardán de sujeción axial de baja distorsión de la serie Newport 605-4</td><td>puede requerir un adaptador adicional para la retención de muestras</td></tr><tr><td>Termómetro</td><td>G. H. Zeal, Londres, Reino Unido</td><td>Termómetro de alcohol en vidrio IP 39C calibrado por UKAS</td> Transductor de ultrasonidos&nbsp;<td></td></tr><tr><td></td><td>Force Technology, Brondby, Dinamarca</td><td>Transductor de diámetro del elemento activo 10 mm&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Vernier</td><td>cualquier proveedor</td><td></td><td></td>adecuado</tr><tr><td>Tanque de agua lleno de agua desionizada &nbsp;</td><td>cualquier proveedor</td><td></td> adecuado <td>requiere un tamaño suficiente (por ejemplo, dimensiones 112 y veces; 38 veces 30 cm3)</td></tr><tr><td>2.Sistema de caracterización óptica*</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Esfera integradora (dos)</td><td>Avantes, Apeldoorn, Países Bajos</td><td>AvaSphere-50, 50 cm de diámetro</td><td></td>interno</tr><tr><td>Fuente de luz&nbsp;</td><td>Avantes, Apeldoorn, Países</td><td>Bajos Avalight-HAL-s-mini</td><td></td></tr><tr><td>Platina motorizada (opcional)</td><td>Thorlabs,Thorlabs</td> <td>MTS50</td><td></td></tr><tr><td>Fibras ópticas (tres)</td><td>cualquier proveedor</td><td></td><td></td>adecuado</tr><tr><td>Reflectancia estándar</td><td>Labsphere, North Sutton, EE. UU.</td><td>99%, blanco, 1,25" de diámetro, USRS-99-010, AS-01158-060</td><td></td></tr><tr><td>Espectrómetro</td><td>Avantes, Apeldoorn, el Países Bajos</td><td>Starline Avaspec-2048</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software de adquisición de datos (p. ej., Labview)</td><td>National Instruments, Austin, TX, EE. UU</td><td></td><td></td></tr>. <tr><td>Software de análisis de datos (p. ej., Matlab)</td><td>Mathworks, Natick, EE. UU</td><td></td><td></td></tr><tr><td>. Programa de duplicación de suma inversa (IAD)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Código fuente:</td></tr> <tr><td>http://omlc.org/software/iad/* Tenga en cuenta que también se pueden utilizar equipos similares.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un material fantasma estable para imágenes ópticas y acústicas

A Stable Phantom Material for Optical and Acoustic Imaging

El establecimiento de materiales fantasmas biofotónicos que imitan el tejido y que proporcionan estabilidad a largo plazo es imprescindible para permitir la comparación de dispositivos de imágenes biomédicas entre proveedores e instituciones, apoyar el desarrollo de estándares reconocidos internacionalmente y ayudar a la traducción clínica de nuevas tecnologías. Aquí, se presenta un proceso de fabricación que da como resultado un material de copolímero en aceite estable, de bajo costo y que imita el tejido para su uso en esfuerzos de estandarización fotoacústica, óptica y de ultrasonido.
El material base consiste en aceite mineral y un copolímero con números definidos del Servicio de Resumen Químico (CAS). El protocolo presentado aquí produce un material representativo con una velocidad de sonido c(f) = 1.481 ± 0,4 m·s-1 a 5 MHz (corresponde a la velocidad del sonido del agua a 20 °C), atenuación acústica α(f) = 6,1 ± 0,06 dB·cm-1 a 5 MHz, absorción óptica μ a(λ) = 0,05 ± 0,005 mm-1 a 800 nm, y dispersión óptica μs'(λ) = 1 ± 0,1 mm-1 a 800 nm. El material permite el ajuste independiente de las propiedades acústicas y ópticas variando respectivamente la concentración de polímero o la dispersión de la luz (dióxido de titanio) y los agentes absorbentes (colorante soluble en aceite). Se muestra la fabricación de diferentes diseños fantasmas y se confirma la homogeneidad de los objetos de prueba resultantes mediante imágenes fotoacústicas.
Debido a su proceso de fabricación fácil y repetible y durabilidad, así como a sus propiedades biológicamente relevantes, la receta del material es muy prometedora en iniciativas de estandarización acústica-óptica multimodal.

Siguiendo esta receta, se han creado tres diseños fantasmas representativos con el propósito de imágenes fotoacústicas, dirigidos a diferentes diseños de sistemas con diferentes geometrías de iluminación óptica y detección acústica (Figura 3A). Si el procedimiento de preparación fantasma se realiza con éxito, el material fantasma aparece liso y homogéneo sin burbujas de aire atrapadas o impurezas, y no se pueden ver artefactos en la imagen resultante (aquí visualizada usando imágenes fotoacústicas; Figura 3B,C). El protocolo produce un material representativo con una velocidad de sonido c(f) = 1481 ± 0,4 m·s-1 (correspondiente a la velocidad del sonido del agua a 20 °C40), atenuación acústica α(f) = 6,1 ± 0,06 dB·cm-1 (ambos a 5 MHz), absorción óptica μa(λ) = 0,05 ± 0,005 mm-1, y dispersión óptica μs'(λ) = 1 ± 0,1 mm-1 (ambos a 800 nm) (la incertidumbre representa la desviación estándar de n = 3 lotes producidos independientemente por diferentes operadores; todas las mediciones se llevaron a cabo a temperatura ambiente [20 °C]).
El coeficiente de dispersión óptica se puede ajustar mediante la variación de TiO 2, mientras que el coeficiente de absorción óptica se puede ajustar mediante la adición de cualquier colorante soluble en aceite, aquí demostrado con nigrosina (Tabla 2 y Figura 3D). Si bien los valores de la Tabla 2 se centran en tejidos de menor absorción y dispersión, como el músculo o la mama (Tabla 1), no hemos encontrado ninguna dificultad con la adición de absorbentes y dispersores a concentraciones más altas. Sin embargo, la adición de dispersores/absorbedores ópticos a concentraciones más altas puede requerir tiempos de sonicación más largos para lograr una mezcla homogénea de la solución.
La atenuación acústica y la velocidad del sonido se pueden ajustar mediante la variación de la concentración del polímero (Tabla 3). Aquí, la afinación está hasta ahora limitada a una velocidad de rango de sonido de ~ 1,450-1,516 m · s-1. Las concentraciones de polímero respectivas más bajas pueden resultar en una baja estabilidad física de la muestra, lo que lleva a la deformación plástica con el tiempo34. Las concentraciones más altas de polímero dan como resultado la fragilidad y una textura desigual del material. El rango de propiedades acústicas puede ayudar a imitar tejidos como el pecho o la grasa (c = 1.450-1.480 m·s−1), pero puede ser insuficiente para tejidos como el músculo o el riñón (c &gt; 1.520 m·s−1; Tabla 1).
Las fuentes de error comunes en la preparación fantasma incluyen la eliminación insuficiente de burbujas de aire y la mezcla no homogénea de los componentes base (Figura 4). Esto se puede minimizar pasando la aspiradora y vertiendo cuidadosamente, y agitando / vórtice, respectivamente.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65475/65475fig02.jpg"> Figura 2: Configuración experimental para la fabricación fantasma. El vaso de precipitados de vidrio que contiene los ingredientes fantasmas se coloca en el baño de aceite de silicona utilizando una abrazadera para evitar el contacto directo entre las superficies del baño de aceite y el vaso de precipitados de vidrio. La retroalimentación de temperatura en la placa caliente garantiza un control cuidadoso de la temperatura. Los agitadores magnéticos permiten mezclar tanto el aceite de silicona como los ingredientes fantasma. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65475/65475fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65475/65475fig03.jpg"> Figura 3: Resultados representativos del procedimiento de fabricación fantasma. (A) Varios diseños fantasmas que muestran versatilidad para su aplicación en diferentes sistemas de imágenes fotoacústicas. Izquierda: pequeño fantasma rectangular con cuerdas incrustadas a diferentes profundidades (0,5, 1,5 y 2,5 mm; distancia entre objetivos de 1,25 mm) diseñado para probar sistemas de imágenes de alta resolución; medio: fantasma cilíndrico con dos inclusiones (distancia de interinclusión de 12 mm) utilizando un colorante verde y violeta soluble en aceite, diseñado para probar sistemas de tomografía; Derecha: Gran fantasma rectangular con canales incrustados a diferentes profundidades (6 mm, 10 mm y 14 mm; distancia de interinclusión de 3,5 mm), diseñado para probar un sistema portátil. (B) Ejemplo de imagen fotoacústica del fantasma rectangular con cuerdas incrustadas, adquirida a 532 nm con un sistema comercial de imágenes fotoacústicas. (C) Ejemplo de imagen fotoacústica del fantasma tomográfico cilíndrico, adquirida a 800 nm con un sistema comercial de imágenes fotoacústicas. (D) Fantasmas con concentraciones de absorción óptica crecientes mediante concentraciones crecientes de nigrosina (concentraciones dadas en porcentaje en peso del volumen total de aceite mineral en la imagen). La figura 3B,C se reproduce de Hacker et al.39. Barras de escala = 10 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65475/65475fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65475/65475fig04.jpg"> Figura 4: Fallas fantasmas comunes . (A,B) Fotografías que muestran burbujas de aire atrapadas dentro de la matriz base. (C) La mezcla insuficiente de los componentes básicos conduce a inhomogeneidades (flechas rojas) en la imagen fotoacústica resultante. Barra de escala = 5 mm (A). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65475/65475fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tabla 2: Resumen tabular del ajuste de los valores de absorción óptica (μa) y dispersión (μs'). Los valores porcentuales se indican como porcentaje en peso del volumen total de la solución de base (aceite mineral, columna 1) y del peso total del material fantasma (columna 2). Las concentraciones de nigrosina representan la cantidad total de nigrosina absoluta (no solución madre). Todas las muestras incluyeron hidroxitolueno butilado al 5% como antioxidante (opcional). n = 3 mediciones por muestra. Una representación visual de la tabla se puede encontrar en Hacker et al.39. Abreviatura: neg = insignificante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65475/Table%202v3.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Tabla 3: Resumen tabular de la afinación de los valores de atenuación acústica (α) y velocidad del sonido (c). Descrito por la ley de potencia α 0f n con parámetros α0 y n obtenidos de un ajuste de mínimos cuadrados no lineales (n = 4 mediciones por muestra). F representa la frecuencia en MHz. Los valores porcentuales se dan como porcentaje en peso del peso total de la solución base (aceite mineral). Todas las muestras incluyeron hidroxitolueno butilado al 5% como antioxidante (opcional). Una representación visual de la tabla se puede encontrar en Hacker et al.39. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65475/65475_Table%203_rev.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Figura complementaria S1: Configuración de los sistemas de caracterización acústica y óptica utilizados para las verificaciones. Se muestra una fotografía (A) y un esquema (B) del sistema de caracterización acústica para la determinación del coeficiente de atenuación acústica y la velocidad del sonido. Los componentes individuales del sistema se indican mediante anotaciones HP (HydroPhone), S (Sample) y T (Transductor) en la foto y el esquema. Se muestra una fotografía (C) y un esquema (D) del sistema de esfera de doble integración para la evaluación del coeficiente de absorción óptica y el coeficiente de dispersión reducido. Los componentes individuales del sistema se indican mediante anotaciones S (muestra), RS (esfera de reflectancia), TS (esfera de transmisión), OF (fibra óptica) y MS (etapa motorizada) en la foto y el esquema. Esta figura se reproduce de Hacker et al. 39. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65475/Suppl.%20Fig%201.pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Este protocolo describe la fabricación de un material fantasma estable y biológicamente relevante para aplicaciones de imágenes biomédicas ópticas y acústicas, con propiedades acústicas y ópticas sintonizables de forma independiente.

Un material fantasma estable para imágenes ópticas y acústicas

Establishing tissue-mimicking biophotonic phantom materials that provide long-term stability are imperative to enable the comparison of biomedical imaging ...

Nuestra investigación se centra en el desarrollo de nuevas modalidades de imagen para la detección temprana del cáncer. En este estudio en particular, nos centramos en desarrollar un objeto de prueba estable, o también llamado fantasma, para validar las modalidades de imagen basadas en la luz y / o el sonido. Se han propuesto diferentes recursos para desarrollar materiales que imitan el tejido en el régimen óptico acústico.Por ejemplo, PVA, hidrogeles, poliuretano o PVCP. Este estudio se centra en un nuevo tipo de material prometedor basado en la composición del aceite de poliman, que supera muchos de los desafíos de ajuste y estabilidad. El campo de la óptica biomédica cubre una amplia gama de modalidades de imagen que se pueden aplicar a algunos de los desafíos clave que enfrenta la medicina actual.Muchas de las modalidades de imágenes ópticas son relativamente limitadas en profundidad, pero también podemos acoplar la luz con el sonido a través del efecto fotoacústico para aprovechar algunos de los beneficios de penetración de profundidad del ultrasonido. Las imágenes fotoacústicas se han mostrado prometedoras en una amplia gama de ensayos clínicos, desde imágenes de inflamación hasta diagnóstico de cáncer. Sin embargo, la evaluación cuantitativa del rendimiento sigue siendo un desafío debido a la falta de materiales fantasmas disponibles que puedan imitar con precisión las propiedades ópticas y acústicas del tejido y permanecer estables a lo largo del tiempo.Se están desarrollando muchos nuevos sistemas de imágenes ópticas y fotoacústicas, pero carecemos de un fantasma de referencia estandarizado para validar esos sistemas y comparar su rendimiento. Nuestro material es un candidato prometedor para llenar este vacío y apoyar un mayor desarrollo y traducción de estas nuevas y emocionantes técnicas en la clínica. En el futuro, nos gustaría centrarnos en crear diseños y arquitecturas fantasmas más anatómicamente realistas que sean adecuados para evaluar el rendimiento de diferentes configuraciones de sistemas.Por ejemplo, sistemas microscópicos, mesoscópicos y macroscópicos, que tienen diferentes geometrías y resoluciones espaciales.

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