Name: Transformación de la raíz peluda de soja para el análisis de la función génica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-05T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Aprenda la transformación de raíces peludas de soja para analizar funciones génicas simultáneamente. Este método optimiza estrategias de ingeniería antes de la transformación estable.

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Esta investigación fue financiada por el Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC) número de subvención RGPIN-2020-06111 y por una generosa donación de Brad Lace. Nos gustaría agradecer a Wayne Parrott (Universidad de Georgia) por el K599 Agrobacterium y el protocolo preliminar, y al laboratorio Nakagawa & Hachiya (Universidad de Shimane) por los vectores vacíos pGWB2, pGWB6 y pANDA35HK.

NOTA: Se recomienda que todos los pasos del procedimiento se lleven a cabo en condiciones estériles.
1. Esterilización de semillas de soja
<ol><li>En un gabinete de bioseguridad, coloque 16-20 semillas de soja Williams 82 redondas en perfectas condiciones (es decir, sin grietas ni manchas) en un tubo de centrífuga de 50 ml.</li>
	<li>Agregue 30 ml de alcohol isopropílico al 70%, agite suavemente durante 30 s y luego decanta el alcohol.</li>
	<li>Agitar suavemente las semillas con 30 ml de lejía al 10% durante 10 s y dejar que las semillas reposen en la solución durante 5 min a temperatura ambiente (RT, 25 °C). Después de 5 minutos, escurrir la lejía.</li>
	<li>Repita la agitación tres veces con 30 mL de H2O ultrapuro estéril durante 1 minuto por enjuague y deseche elH2Oentrecada enjuague.</li>
	<li>Coloque las semillas esterilizadas en papel de filtro saturado con 5 ml de medio de germinación y cocultivo (GC) (medio líquido de autoclave de media fuerza Murashige y Skoog [MS] con 1% de sacarosa [pH = 5.8] y luego agregue 2.5 ml / L de vitaminas) en placas de Petri estériles.</li>
	<li>Coloque las placas en la oscuridad a RT (25 °C) durante 3 días antes de transferir las placas a 22 °C bajo 16 h de luces fluorescentes T5 de color blanco frío (100 μE m-2·s-1) durante 4 días para permitir que las semillas germinen. NOTA: Deseche las semillas que están arrugadas o agrietadas. Las mejores semillas son aquellas que son grandes y uniformemente amarillas. Esterilice al menos el doble del número de semillas requeridas para el experimento para seleccionar semillas de buena calidad, ya que algunas semillas pueden no ser óptimas debido a daños, enfermedades o falta de germinación.</li>
</ol>2. Infección de cotiledones con K599
NOTA: Utilice vectores de la serie pGWB, ya que su selección dual garantiza la integración genómica de todo el casete de ADN-T. La electroporación se utilizó para transformar un vector binario que alberga el gen de interés en A. rhizogenes pRi265918.
<ol><li>En base a la secuencia del plásmido A. rhizogenes pRi265918, se diseñaron cebadores para detectar el plásmido Ti del gen VirD2 (VirD2 hacia adelante: 5'-CCCGATCGAGCTCAAGTTAT-3'; Reverso de VirD2: 5'-TCGTCTGGCTGACTTTCGT-3'; Tamaño de amplificación esperado: 221 pb). Después de la transformación, pruebe las colonias de Agrobacterium para la retención de VirD2 por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando un kit de PCR (consulte la Tabla de materiales). Ciclo de PCR: 94 °C durante 3 min; 35 ciclos (94 °C durante 1 min, 58 °C durante 30 segundos, 72 °C durante 1 min); y 72 °C durante 10 min.</li>
	<li>Tras la selección de la colonia de A. rhizogenes que contiene tanto VirD2 como el gen de interés (GOI), colocar algunas placas medianas de Luria-Bertani (LB) que contengan los antibióticos apropiados (50 mg/L) para el plásmido de interés e incubar durante la noche a 30 °C. Si usa espectinomicina, agregue una concentración de 100 mg / L.</li>
	<li>Utilice una punta de pipeta P200 para raspar una longitud de ~1,5 cm de la K599 Agrobacterium de las placas LB y resuspender las células en 1 ml de tampón fosfato (PB; 0,01 M Na2HPO4, 0,15 M NaCl, pH 7,5).</li>
	<li>Diluir el Agrobacterium enH2Oultrapuro esterilizado (v/v = 1:1) y acetosiringona (AS; 100 mM de stock en dimetilsulfóxido [DMSO], v/v = 1:1000). Mida la absorbancia utilizando un tubo de cubeta a una densidad óptica de 600 nm (OD600). El rango óptimo esperado está entre 0,5 y 0,8.</li>
	<li>En un gabinete de bioseguridad, sumerja un bisturí esterilizado en la solución K599 Agrobacterium y haga varios cortes profundos de 1 mm a lo largo de la superficie interna (adaxial, lado plano) del cotiledón. Durante la inoculación, use fórceps esterilizados para estabilizar el cotiledón.</li>
	<li>Coloque alrededor de 6-8 cotiledones cortados con el lado hacia abajo en una placa de Petri que contenga papel de filtro saturado con medio GC con AS. NOTA: Para preparar 6 placas, 50 mL de medio GC y 50 μL de 100 mM AS para alcanzar una concentración final de 100 μM es suficiente.</li>
	<li>Incubar las placas a RT (25 °C) durante 3 días bajo un fotoperiodo de 16 h (~65 μE).</li>
	<li>Transfiera los cotiledones infectados a placas de crecimiento de raíces peludas (HRG) (MS de fuerza media en autoclave con sacarosa al 3% [pH = 5.8] y 2.6 g / L de Gelzan, luego agregue una mezcla de vitaminas de 2.5 ml / L y 500 mg / L de timentina). NOTA: Hubo algunos problemas con la timentina de algunos proveedores alternativos, de los cuales el K599 no fue eliminado. Se recomienda utilizar placas de Petri más altas (100 mm x 25 mm) para el medio HRG.</li>
	<li>Incubar las placas de HRG a 22 °C en una cámara de crecimiento con los parámetros ajustados a 100 μE de luz en un fotoperiodo de 16 h hasta que se observen raíces primarias con raíces secundarias de 2-3 cm de longitud (~3-4 semanas).</li>
</ol>3. Selección y recolección de HRs
<ol><li>Cosecha raíces primarias (5-7 cm de longitud) que crecen desde el callo y contienen raíces secundarias (2-3 cm de longitud) usando un bisturí estéril y fórceps. Transfiera a la selección las placas de HRG que contienen los antibióticos apropiados. Deje que los HR crezcan durante 5 días más en las placas HRG de selección. NOTA: Kanamicina (50 mg/L), higromicina (50 mg/L) o fosfinotricina (10 mg/L) se utilizan típicamente para la selección. Para vectores de expresión, pGWB2 se usa para la sobreexpresión, pANDA35HK se usa para silenciar ARNi, pGWB6 se usa para localización subcelular y pMDC7 se usa para expresión inducible.</li>
	<li>En el día 5, cosechar HRs transgénicos con raíces secundarias de 3-6 cm de longitud. Si se observan proteínas fluorescentes, las raíces secundarias tienen poca autofluorescencia. Si realiza tratamientos elicitores o químicos, corte las raíces secundarias en trozos de 1 cm y coloque ~ 100 mg en agar HRG en una pila. A continuación, saturar las pilas con 80 μL del tratamiento adecuado y dejar que las placas se incuben a RT (25 °C).</li>
	<li>Después del tiempo de tratamiento deseado, proceda con extracciones de ARN o metabolitos.</li>
	<li>Para el ARN, seque rápidamente las raíces en una toalla de papel esterilizada y coseche directamente en un tubo de microcentrífuga de 2 ml.</li>
	<li>Selle inmediatamente la parte superior del tubo con parafilm, haga dos orificios pequeños con pinzas puntiagudas y sumerja los tubos en nitrógeno líquido. Liofilizar durante 3 días, luego almacenar las muestras a -80 °C. NOTA: Es esencial seleccionar HR que sean blancos. Después de 5 días de crecimiento en la placa selectiva, las HR transgénicas permanecerán blancas, pero las raíces no transgénicas se volverán marrones.</li>
</ol>

Producción de alta eficiencia de raíces pilosas de soja transgénica

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Durante la última década, el método HR de soja se ha desarrollado como una poderosa herramienta para estudiar genes involucrados en la fijación de nitrógeno 22,23, tolerancia al estrés biótico y abiótico 24,25 y vías biosintéticas de metabolitos 26,27. El conocimiento de cómo las plantas producen metabolitos tiene una gran cantidad de beneficios p...

La soja (Glycine max) es uno de los cultivos más valiosos en la agricultura. Tiene miles de usos comerciales e industriales, como alimentos, piensos, aceite y como fuente de materias primas para la fabricación1. Su capacidad para formar una relación simbiótica con los microorganismos del suelo fijadores de nitrógeno, a saber, los rizobios, eleva aún más la importancia de estudiar la genética de la soja2. Por ejemplo, ajustar las propiedades de fijación de nitrógeno en las raíces de soja puede conducir a la reducción de las emisiones de carbono y reducir en gran medida los requisitos de fertilizante nitrogenado3. Por lo tanto, comprender la genética que controla aspectos de la biología de la raíz de la soja, en particular, tiene amplias aplicaciones en la agricultura y la industria. Teniendo en cuenta estos beneficios, es importante contar con un protocolo confiable para analizar la función de los genes de la soja.
Agrobacterium tumefaciens es quizás la herramienta más utilizada para la transformación genética de plantas, ya que tiene la capacidad de integrar el ADN de transferencia (ADN-T) en el genoma nuclear de muchas especies de plantas. Cuando Agrobacterium infecta una planta, transfiere el plásmido inductor de tumores (Ti) al cromosoma huésped, lo que lleva a la formación de un tumor en el sitio de la infección. La transformación mediada por Agrobacterium ha sido ampliamente utilizada durante décadas para el análisis funcional de genes y para modificar los rasgos de los cultivos4. Aunque cualquier gen de interés puede transferirse fácilmente a las células vegetales huésped a través de la transformación mediada por A. tumefaciens, este método tiene varios inconvenientes; Requiere mucho tiempo, es costoso y requiere una amplia experiencia para muchas especies de plantas, como la soja. Aunque algunas variedades de soja pueden ser transformadas por el enfoque de nodo cotiledonario utilizando A. tumefaciens, la ineficiencia de este enfoque requiere la necesidad de una tecnología alternativa de transformación genética que sea rápida y altamente eficiente 4,5. Incluso un no experto puede usar este método de transformación de raíz pilosa (HR) mediado por Agrobacterium rhizogenes para superar estas desventajas.
La transformación de HR es una herramienta relativamente rápida, no solo para analizar la función de los genes, sino también para aplicaciones biotecnológicas, como la producción de metabolitos especializados y productos químicos finos, y glicoproteínas bioactivas complejas6. La producción de HRs de soja no requiere una amplia experiencia, ya que pueden generarse hiriendo las superficies de los cotiledones, seguido de la inoculación con Agrobacterium rhizogenes7. A. rhizogenes expresa genes de virulencia (Vir) codificados por su plásmido Ti que transfieren, transportan e integran su segmento de ADN-T en el genoma de las células vegetales mientras estimulan simultáneamente el crecimiento de raíces ectópicas8.
En comparación con otros sistemas de expresión génica de soja, como los biolistics o la transformación de tejidos, células y cultivos de órganos basados en A. tumefaciens, el sistema de expresión de HR exhibe varias ventajas. En primer lugar, los HR son genéticamente estables y se producen rápidamente en medios libres de hormonas 1,9,10. Además, los HR pueden producir metabolitos especializados en cantidades equivalentes o mayores que las raíces nativas11,12. Estas ventajas hacen de los HR una herramienta biotecnológica deseable para especies vegetales que son incompatibles con A. tumefaciens o que requieren condiciones especiales de cultivo de tejidos para formar tejidos compatibles. El método HR es un enfoque eficiente para analizar las interacciones proteína-proteína, la localización subcelular de proteínas, la producción de proteínas recombinantes, la fitorremediación, la mutagénesis y los efectos de todo el genoma utilizando la secuenciación de ARN13,14,15. También puede ser utilizado para estudiar la producción de metabolitos especializados que tienen valor en la industria, incluyendo glicomolinas, que medican la defensa de la soja contra el importante patógeno microbiano Phytophthora sojae y tienen impresionantes actividades anticancerígenas y neuroprotectoras en humanos16,17.
Este informe demuestra un protocolo fácil y eficiente para producir HR de soja. En comparación con los métodos anteriores de transformación de HR, este protocolo proporciona una mejora significativa (33% -50%) en la tasa de formación de HR mediante la preselección de transformadores de A. rhizogenes para detectar la presencia del plásmido Ti antes de inocular cotiledones de soja. Demostramos la aplicabilidad de este protocolo transformando varios vectores binarios que sobreexpresan o silencian los genes del factor de transcripción de soja.

<table><tbody><tr><td>Acetosiriringa</td><td>Cayman</td><td>23224</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>lavo</td><td>21124</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Biorreactivos Fisher</td><td>195679</td><td></td></tr><tr><td>Gelzan</td><td>Phytotech</td><td>HYY3251089A</td><td></td></tr><tr><td>Higromicina</td><td>Phytotech</td><td>HHA0397050B</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol isopropílico</td><td>Fisher 206462</td><td></td><td></td></tr> <tr>químicos<td>Kanamicina</td><td>Phytotech</td><td>SQS0378007G</td><td></td></tr><tr><td>LB en polvo</td><td>Biorreactivos Fisher</td><td>200318</td><td></td></tr><tr><td>MS en polvo</td><td>Caisson labs</td><td>2210001</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Fisher biorreactivos</td><td>194171</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Químico</td><td>192946</td><td></td></tr><tr><td>placas de Petri Fisherbrand</td><td></td><td>08-757-11</td><td>100 mm x 25 mm</td></tr><tr><td>Fosfinotricina</td><td>Cedarlan</td><td>P034-250MG</td><td></td></tr><tr><td>REDExtract-N-Amp Kit de PCR</td><td>Sigma</td><td>R4775</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Bioshop</td><td>2D76475</td><td></td></tr><tr><td>Timentina</td><td>Caisson labs 12222002</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vitaminas</td><td>Caisson labs 2211010</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

transformación de la raíz peluda de soja para el análisis de la función génica

Soybean Hairy Root Transformation for the Analysis of Gene Function

La soja (Glycine max) es un cultivo valioso en la agricultura que tiene miles de usos industriales. Las raíces de soja son el sitio principal de interacción con los microbios transmitidos por el suelo que forman simbiosis para fijar nitrógeno y patógenos, lo que hace que la investigación que involucra la genética de la raíz de soja sea de suma importancia para mejorar su producción agrícola. La transformación genética de las raíces peludas de soja (HRs) está mediada por la cepa NCPPB2659 de Agrobacterium rhizogenes (K599) y es una herramienta eficiente para estudiar la función génica en las raíces de soja, tomando solo 2 meses de principio a fin. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado que describe el método para sobreexpresar y silenciar un gen de interés en las HR de soja. Esta metodología incluye la esterilización de semillas de soja, la infección de cotiledones con K599 y la selección y recolección de HR genéticamente transformadas para el aislamiento de ARN y, si se justifica, análisis de metabolitos. El rendimiento del enfoque es suficiente para estudiar simultáneamente varios genes o redes y podría determinar las estrategias de ingeniería óptimas antes de comprometerse con enfoques de transformación estables a largo plazo.

Los resultados representativos provienen de los datos publicados19,20. Los resultados de la PCR de colonias (cPCR) de la K599 Agrobacterium transformada se muestran en la Figura 1. Como indican las colonias positivas en la Figura 1, el gen de interés fue detectado por cPCR (Figura 1A). Sin embargo, entre un tercio y la mitad de las colonias fueron negativas para el ...

Aquí, presentamos un protocolo para la producción de alta eficiencia de raíces peludas de soja transgénica.

Transformación de la raíz peluda de soja para el análisis de la función génica

Soybean (Glycine max) is a valuable crop in agriculture that has thousands of industrial uses. Soybean roots are the primary site of interaction with ...

Nuestro método de transformación de raíces peludas de soja es suficiente para estudiar simultáneamente las funciones de varios genes o redes, y podría determinar las estrategias de ingeniería óptimas antes de comprometerse con enfoques de transformación estable a largo plazo. La transformación de la raíz peluda de la soja es una herramienta útil para el análisis de la función génica en las plantas de soja. La tecnología que se utiliza actualmente incluye la edición del genoma CRISPR-Cas9, la interferencia de ARN, la transcriptómica y la proteómica, y las tecnologías de imagen.El principal desafío en la era del modelo de genómica funcional es suficiente analizar la función de numerosos genes. La mayoría de los genes son poligénicos, siendo logrados por la interacción de muchos genes. Nuestro protocolo de raíz peluda facilitará el análisis de la función génica con suficiente rendimiento, para que las redes poligénicas puedan comenzar a comprenderse.Hemos establecido la importancia del plásmido Ti en cepas de agrobacterium rhizogene. Encontramos que sin la detección del plásmido Ti, aumentó el riesgo de que el cotiledón de soja transformado no produzca ningún colorante. Como resultado

soybean-hairy-root-transformation-for-the-analysis-of-gene-function

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Usando el montaje de ADN, múltiples vectores de CRISPR pueden ser construidos en paralelo en una única reacción de clonación, por lo que la construcción de un gran número de vectores de CRISPR una tarea simple. Tomate raíces peludas son un excelente sistema modelo para validar vectores de CRISPR y generar materiales mutantes.

De alto rendimiento CRISPR vector de la construcción y caracterización de las modificaciones del ADN mediante la generación de raíces peludas tomate

Análisis de expresión del promotor son cruciales para mejorar la comprensión de la regulación de los genes y la expresión espacio-temporal de genes diana. Adjunto presentamos un protocolo para identificar, aislar y clonar un promotor de la planta. Además, se describe la caracterización del promotor específico de nódulos en las raíces pilosas de frijol común.

Planta promotor análisis: Identificación y caracterización del promotor de la raíz específica de nódulo en el frijol común

Hemos desarrollado un protocolo sencillo y eficaz para la preparación de grandes cantidades de protoplastos de soja para el estudio de complejos mecanismos de regulación y señalización en células vivas.

Un método Simple para el aislamiento de protoplastos de soja y aplicación al análisis de expresión génica transitoria

Describimos un método de inducir raíces peludas por Agrobacterium rhizogenes-transformación mediada en trigo sarraceno tartá ) (Fagopyrum tataricum). Esto se puede utilizar para investigar las funciones genéticas y la producción de metabolitos secundarios en el trigo sarraceno tártaro, ser adoptado para cualquier transformación genética, o utilizado para otras plantas medicinales después de la mejora.

Inducción de raíces peludas por Agrobacterium rhizogenes-Transformación mediada en trigo sarracenotataricum tataricum)

Aquí, proporcionamos el protocolo detallado de un método de transformación de un solo paso mediado por Agrobacterium tumefaciens para producir plantas compuestas.

Un método eficiente y reproducible para producir plantas compuestas mediante la transformación de raíces peludas basadas en Agrobacterium rhizogenes

El protocolo describe la inducción de raíces pilosas utilizando tallos de inflorescencia primaria de Arabidopsis e hipocótilos de Brassica napus . Las raíces peludas pueden ser cultivadas y utilizadas como explantes para regenerar plantas transgénicas.

Transformación y regeneración de raíces pilosas en Arabidopsis thaliana y Brassica napus

Se trata de un paso a paso guía que muestra el propósito, el funcionamiento y los resultados representativos de la fuerza de la gravedad del espectrómetro novela.

Demostrando la Utilización del Espectrómetro de Novela de la Fuerza gravitacional para estirar y medir las proteínas fibrosas

Este artículo proporciona un protocolo para el cultivo de plántulas de Arabidopsis en el RootChip, una plataforma de imágenes de microfluidos que combina el control automatizado de las condiciones de crecimiento con control microscópico y la raíz FRET basada en la medición de los niveles intracelulares de metabolitos.

Time-lapse de imágenes de fluorescencia del crecimiento de raíces de Arabidopsis con la manipulación del ambiente rápido y raíz mediante la RootChip

Un protocolo para el análisis de nanopartículas de seguimiento (NTA) y de alto rendimiento de citometría de flujo para evaluar las nanopartículas poliméricas de suministro de genes se describe. NTA se utiliza para caracterizar la distribución del tamaño de partícula de nanopartículas y la distribución de partículas por plásmido. De alto rendimiento de la citometría de flujo permite una evaluación cuantitativa eficacia de la transfección de una biblioteca de biomateriales de suministro de genes.

La evaluación de la administración de genes nanopartículas poliméricas por nanopartículas de análisis de seguimiento y de alto rendimiento Citometría de Flujo

Este protocolo revisa eléctrico de la célula-sustrato Impedancia de detección, un método para registrar y analizar el espectro de impedancia de las células adherentes para la cuantificación de la unión celular, la proliferación, motilidad, y las respuestas celulares a estímulos farmacológicos y tóxicos. La detección de la permeabilidad endotelial y la evaluación de los contactos célula-célula y célula-sustrato que se obtienen.

Eléctrico de la célula-sustrato Impedancia de detección para la cuantificación de la proliferación endotelial, la función de barrera, y la motilidad

Aprenda la transformación de raíces peludas de soja para analizar funciones génicas simultáneamente. Este método optimiza estrategias de ingeniería antes de la transformación estable.

Transformación de la raíz peluda de soja para el análisis de la función génica

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