Name: Fabricación y encapsulación de esferoides tumorales en hidrogeles de polietilenglicol para el estudio de las interacciones esferoide-matriz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-22T14:55:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Aprende a fabricar y encapsular esferoides tumorales en hidrogeles de polietilenglicol para estudiar interacciones esferoide-matriz. Este método rápido y económico imita el microambiente tumoral sin equipo especializado.

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Este trabajo fue financiado por los fondos iniciales proporcionados a la Dra. Silviya P Zustiak por la Universidad de Saint Louis, así como por una subvención inicial del Centro Henry y Amelia Nasrallah de Neurociencia de la Universidad de Saint Louis otorgada a la Dra. Silviya P Zustiak.

Fabricación seguida de encapsulación 3D de esferoides tumorales en hidrogeles PEG

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<li>Costa, E. C., de Melo-Diogo, D., Moreira, A. F., Carvalho, M. P., Correia, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroids+formation+on+non-adhesive+surfaces+by+liquid+overlay+technique%3A+Considerations+and+practical+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Spheroids formation on non-adhesive surfaces by liquid overlay technique: Considerations and practical approaches.</a> Biotechnology Journal. 13 (1), 1700417(2018).</li>
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<li>Kamatar, A., Gunay, G., Acar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+and+synthetic+biomaterials+for+engineering+multicellular+tumor+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Polymers%22%5BJournal%5D)">Natural and synthetic biomaterials for engineering multicellular tumor spheroids.</a> Polymers. 12 (11), 2506(2020).</li>
<li>Wang, C., Tong, X., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+3D+brain+tumor+model+to+elucidate+the+effects+of+matrix+stiffness+on+glioblastoma+cell+behavior+using+PEG-based+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Bioengineered 3D brain tumor model to elucidate the effects of matrix stiffness on glioblastoma cell behavior using PEG-based hydrogels.</a> Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2115-2125 (2014).</li>
<li>Nakod, P. S., Kim, Y., Rao, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+biomimetic+hyaluronic+acid+hydrogels+to+investigate+glioblastoma+stem+cell+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional biomimetic hyaluronic acid hydrogels to investigate glioblastoma stem cell behaviors.</a> Biotechnology and Bioengineering. 117 (2), 511-522 (2020).</li>
<li>Xiao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+scaffolds+for+3D+culture+demonstrate+extracellular+matrix-mediated+mechanisms+of+chemotherapy+resistance+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Bioengineered scaffolds for 3D culture demonstrate extracellular matrix-mediated mechanisms of chemotherapy resistance in glioblastoma.</a> Matrix Biology. 85, 128-146 (2020).</li>
<li>Pedron, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronic+acid-functionalized+gelatin+hydrogels+reveal+extracellular+matrix+signals+temper+the+efficacy+of+erlotinib+against+patient-derived+glioblastoma+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Hyaluronic acid-functionalized gelatin hydrogels reveal extracellular matrix signals temper the efficacy of erlotinib against patient-derived glioblastoma specimens.</a> Biomaterials. 219, 119371(2019).</li>
<li>Hill, L., Bruns, J., Zustiak, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+matrix+presence+and+composition+influence+drug+responses+of+encapsulated+glioblastoma+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Hydrogel matrix presence and composition influence drug responses of encapsulated glioblastoma spheroids.</a> Acta Biomaterialia. 132, 437-447 (2021).</li>
<li>Chen, J. -W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+microglia+and+patient-derived+glioblastoma+cells+inhibit+invasion+in+a+three-dimensional+gelatin+hydrogel+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between microglia and patient-derived glioblastoma cells inhibit invasion in a three-dimensional gelatin hydrogel model.</a> Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 346(2020).</li>
<li>Thakuri, P. S., Liu, C., Luker, G. D., Tavana, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials-based+approaches+to+tumor+spheroid+and+organoid+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Biomaterials-based approaches to tumor spheroid and organoid modeling.</a> Advanced Healthcare Materials. 7 (6), 1700980(2018).</li>
<li>Shin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate-marine+collagen-agarose+composite+hydrogels+as+matrices+for+biomimetic+3D+cell+spheroid+formation%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">Alginate-marine collagen-agarose composite hydrogels as matrices for biomimetic 3D cell spheroid formation.</a> RSC Advances. 6 (52), 46952-46965 (2016).</li>
<li>Pradhan, S., Clary, J. M., Seliktar, D., Lipke, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+spheroidal+cancer+model+based+on+PEG-fibrinogen+hydrogel+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional spheroidal cancer model based on PEG-fibrinogen hydrogel microspheres.</a> Biomaterials. 115, 141-154 (2017).</li>
<li>Imaninezhad, M., Hill, L., Kolar, G., Vogt, K., Zustiak, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Templated+macroporous+polyethylene+glycol+hydrogels+for+spheroid+and+aggregate+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Templated macroporous polyethylene glycol hydrogels for spheroid and aggregate cell culture.</a> Bioconjugate Chemistry. 30 (1), 34-46 (2018).</li>
<li>Mirab, F., Kang, Y. J., Majd, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+characterization+of+size-controlled+glioma+spheroids+using+agarose+hydrogel+microwells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Preparation and characterization of size-controlled glioma spheroids using agarose hydrogel microwells.</a> PLoS One. 14 (1), e0211078(2019).</li>
<li>Razian, G., Yu, Y., Ungrin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+large+numbers+of+size-controlled+tumor+spheroids+using+microwell+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Production of large numbers of size-controlled tumor spheroids using microwell plates.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. 81, e50665(2013).</li>
<li>Timmins, N. E., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTimmins%2C+NE+%22Generation+of+Multicellular+Tumor+Spheroids+by+the+Hanging-Drop+Method%22">Generation of Multicellular Tumor Spheroids by the Hanging-Drop Method</a>. Hauser, H., Fussenegger, M. 140, Springer, Humana Press, NJ. (2007).</li>
<li>Zhao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+printed+hanging+drop+dripper+for+tumor+spheroids+analysis+without+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A 3D printed hanging drop dripper for tumor spheroids analysis without recovery.</a> Scientific Reports. 9 (1), 19717(2019).</li>
<li>Amaral, R. L., Miranda, M., Marcato, P. D., Swiech, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+3D+bladder+tumor+spheroids+obtained+by+forced+floating+and+hanging+drop+methods+for+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of 3D bladder tumor spheroids obtained by forced floating and hanging drop methods for drug screening.</a> Frontiers in Physiology. 8, 605(2017).</li>
<li>Gencoglu, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+multicellular+tumor+spheroid+formation+methods+and+implications+for+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Comparative study of multicellular tumor spheroid formation methods and implications for drug screening.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (2), 410-420 (2018).</li>
<li>Zhang, C., Liu, C., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+brain+tissue+based+on+microstructure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Mechanical+Behavior+of+Biomedical+Materials%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of brain tissue based on microstructure.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 126, 104924(2021).</li>
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<li>Zustiak, S. P., Leach, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrolytically+degradable+poly+%28ethylene+glycol%29+hydrogel+scaffolds+with+tunable+degradation+and+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Hydrolytically degradable poly (ethylene glycol) hydrogel scaffolds with tunable degradation and mechanical properties.</a> Biomacromolecules. 11 (5), 1348-1357 (2010).</li>
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<li>Raeber, G., Lutolf, M., Hubbell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecularly+engineered+PEG+hydrogels%3A+a+novel+model+system+for+proteolytically+mediated+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Molecularly engineered PEG hydrogels: a novel model system for proteolytically mediated cell migration.</a> Biophysical Journal. 89 (2), 1374-1388 (2005).</li>
<li>Bruns, J., Egan, T., Mercier, P., Zustiak, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+spheroid+growth+and+chemotherapeutic+responses+in+single+and+dual-stiffness+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma spheroid growth and chemotherapeutic responses in single and dual-stiffness hydrogels.</a> Acta Biomaterialia. 163, 400-414 (2023).</li>
<li>Kuwajima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClearT%3A+a+detergent-and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">ClearT: a detergent-and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).</li>
<li>Holt, S. E., Ward, E. S., Ober, R. J., Alge, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shooting+for+the+moon%3A+using+tissue-mimetic+hydrogels+to+gain+new+insight+on+cancer+biology+and+screen+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22MRS+Communications%22%5BJournal%5D)">Shooting for the moon: using tissue-mimetic hydrogels to gain new insight on cancer biology and screen therapeutics.</a> MRS Communications. 7 (3), 427-441 (2017).</li>
<li>Jain, E., Scott, K. M., Zustiak, S. P., Sell, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+polyethylene+glycol-based+hydrogel+microspheres+through+electrospraying%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Materials+and+Engineering%22%5BJournal%5D)">Fabrication of polyethylene glycol-based hydrogel microspheres through electrospraying.</a> Macromolecular Materials and Engineering. 300 (8), 823-835 (2015).</li>
<li>Raghavan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+tumor+spheroid+generation+techniques+for+differential+in+vitro+drug+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of tumor spheroid generation techniques for differential in vitro drug toxicity.</a> Oncotarget. 7 (13), 16948(2016).</li>
<li>Lee, K. -H., Kim, T. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+multicellular+tumor+spheroid+generation+for+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors%22%5BJournal%5D)">Recent advances in multicellular tumor spheroid generation for drug screening.</a> Biosensors. 11 (11), 445(2021).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los modelos de esferoides tumorales multicelulares basados en hidrogel se están desarrollando cada vez más para avanzar en los descubrimientos terapéuticos del cáncer 11,13,29. Son beneficiosos porque emulan parámetros clave del microambiente tumoral de forma controlada y, a pesar de su complejidad, son más sencillos y baratos de usar que los modelos in vivo, y muchos son compatibles con las tecnologías de cribado de alto rendim...

Los esferoides tumorales han surgido como herramientas útiles in vitro en el estudio de la etiología, la patología y la respuesta a los fármacosdel cáncer 1. Tradicionalmente, los esferoides se han cultivado en condiciones tales como placas de baja adherencia o biorreactores, donde la adhesión célula-célula se ve favorecida sobre la adhesión célula-superficie2. Sin embargo, ahora se reconoce que para recapitular el microambiente tumoral de manera más fiel, los modelos esferoides in vitro deben capturar tanto las interacciones célula-célula como las célula-matriz. Esto ha llevado a múltiples grupos a diseñar andamios, como los hidrogeles, donde los esferoides pueden ser encapsulados 3,4. Estos modelos esferoides basados en hidrogeles permiten la elucidación de las interacciones célula-célula y célula-matriz en diversos comportamientos celulares, como la viabilidad, la proliferación, la madre o la capacidad de respuesta a la terapia3.
En este trabajo se describe un protocolo para la encapsulación de esferoides de glioblastoma en hidrogeles de polietilenglicol (PEG). Existen múltiples informes bibliográficos sobre la encapsulación de esferoides de células de glioblastoma en hidrogeles. Por ejemplo, los esferoides se formaron encapsulando células U87 en hidrogeles PEG decorados con un ligando adhesivo RGDS y reticulados con un péptido enzimáticamente escindible para determinar el efecto de la rigidez del hidrogel en el comportamiento celular5. Las células U87 también se han formado en otros hidrogeles basados en PEG o en ácido hialurónico para ampliar la población de células madre cancerosas6 o para explorar los mecanismos de resistencia a la quimioterapia mediados por la matriz 7,8,9. Los esferoides de glioblastoma también se han encapsulado en hidrogeles de gelatina para estudiar la diafonía entre la microglía y las células cancerosas y su efecto sobre la invasión celular10. En general, estos estudios han demostrado la utilidad de los modelos in vitro basados en hidrogel para comprender la patología del glioblastoma y diseñar tratamientos.
Además, existen diferentes métodos para la fabricación de esferoides tumorales y la encapsulación de hidrogeles11. Por ejemplo, las células dispersas podrían sembrarse en hidrogeles y dejar que formen esferoides con el tiempo 5,12. Un inconveniente de este método es la polidispersidad de los esferoides formados, lo que podría dar lugar a respuestas celulares diferenciales. Para producir esferoides uniformes, las células podrían encapsularse en microgeles y cultivarse durante períodos prolongados hasta que invadan y remodelen el gel13, o las células podrían depositarse en geles moldeados con "agujeros" esféricos y permitir que se agreguen14. El inconveniente de estos métodos es su relativa complejidad, la necesidad de un generador de gotas u otros medios para formar microgeles o los "agujeros" en el gel, y el tiempo que tardan los esferoides en crecer y madurar. Alternativamente, los esferoides podrían preformarse en micropocillos 9,15,16 o en placas colgantes17,18 y luego encapsularse en un hidrogel, similar a la técnica descrita aquí. Estos métodos son más simples y se pueden realizar de una manera de mayor rendimiento. Curiosamente, se ha demostrado que el método de formación de esferoides puede afectar el comportamiento de las células esferoides, como la expresión génica, la proliferación celular o la respuesta a los fármacos19,20.
Aquí, nos centramos en el glioblastoma, ya que es un tumor sólido cuyo entorno nativo es la matriz cerebral blanda y nanoporosa21, que puede ser imitada por un hidrogel blando y nanoporoso. El glioblastoma es también el cáncer cerebral más mortal para el que no existe cura22. Sin embargo, el protocolo descrito aquí se puede utilizar para la encapsulación de esferoides que representen cualquier tumor sólido. Elegimos utilizar hidrogeles PEG que se forman a través de una reacción de adición de tipo Michael23. El PEG es un hidrogel sintético, no degradable y biocompatible que es inerte y sirve como andamiaje y soporte físico de las células, pero no soporta la unión celular23. La adhesividad celular se puede agregar por separado mediante el anclaje de proteínas enteras o ligandos adhesivos24, y la degradabilidad se puede agregar a través de modificaciones químicas de la cadena polimérica PEG o reticulantes degradables hidrolítica o enzimáticamente25,26. Esto permite ajustar las propiedades bioquímicas independientemente de las propiedades mecánicas o físicas del hidrogel, lo que podría ser ventajoso en el estudio de las interacciones célula-matriz. La química de gelificación tipo Michael es selectiva y ocurre en condiciones fisiológicas; Por lo tanto, permite la encapsulación de esferoides simplemente mezclando los esferoides con la solución precursora de hidrogel.
En general, la metodología que aquí se presenta tiene varias características notables. En primer lugar, la fabricación de esferoides tumorales en un conjunto de pocillos múltiples es eficiente, rápida y el costo de los materiales necesarios es bajo. En segundo lugar, los esferoides se producen en grandes lotes en una variedad de tamaños con baja polidispersidad. Por último, solo se requieren materiales disponibles en el mercado. La utilidad de la metodología se ilustra explorando el efecto de las propiedades del sustrato en la viabilidad de las células esferoides, la circularidad y la madre celular.

<table><tbody><tr><td>70% Etanol</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>LC22210-4</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Cónicos</td><td>FALCON</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 24 pocillos Placas de fijación ultra bajas</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-602</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de 35 mm</td><td>Amazon</td><td>706011</td><td></td></tr> 4 <tr><td>brazos de poli(etilenglicol)-acrilato (4 brazos PEG-Ac; 10 kDa)</td><td>Laysan Bio</td><td>ACRL-PEG-ACRL-10K-5g</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Cónicos</td><td>Fisher Scinetific</td><td></td><td></td>3181345107</tr><tr><td>AggreWell 400 de 6 pocillos&nbsp;</td><td>StemCell Technologies, Vancouver, Canadá</td><td>34421</td><td>Micropozos piramidales cuadrados&nbsp;</td></tr><tr><td>solución de enjuague antiadherente</td><td>StemCell Technologies, Vancouver, Canadá</td><td>Gato #: 07010</td><td></td></tr><tr><td>Ácido aspártico-Arginina-Cisteína-Glicina-Valina-Prolina-Metionina-Serina-Metionina-Arginina-Glicina-Cisteína-Arginina-Ácido aspártico (DRCG-VPMSMR-GCRD) péptido</td><td>Genic Bio, Shanghai, China</td><td>n/a</td><td>Síntesis personalizada</td></tr><tr><td>Campana de humo químico</td><td>KEWAUNEE</td><td>99151</td><td></td></tr><tr><td>Matriz de membrana basal Corning Matrigel , libre de LDEV &nbsp;</td><td>Corning</td><td>356234</td><td>Detergente de matriz de membrana basal</td></tr><tr><td>- Triton-X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td>Tensioactivo no iónico</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas desechables (1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL)</td><td>Fisher Scinetific</td><td>1 mL: 13-678-11B, 2mL: 05214038, 5mL (FALCON): 357529, 10mL: 13-678-11E, 25mL: 13-678-11, 50mL: 13-678-11F</td><td></td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino</td><td>HyClone</td><td>SH30073-03</td><td></td></tr><tr><td>Solución de formaldehído al 37% Sigma</td><td>Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>Placas de vidrio</td><td>Slumpys</td><td>GBS4100SFSL</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de transferencia de vidrio</td><td>Fisher Scinetific</td><td>5 3/4": 1367820A, 9":136786B</td><td></td></tr><tr><td>Glicina-Arginina-Cisteína-Ácido aspártico-Arginina-Glicina-Ácido aspártico-Serina (GRCD-RGDS) péptido</td><td>Genic Bio, Shanghai, China</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Hemacitómetro</td> de síntesis personalizada <td>Bright-Line</td><td>383684</td><td></td></tr><tr><td>Solución hidrofóbica - Repeler Silane&nbsp;</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences</td><td>17-1332-01</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>NUAIRE</td><td>NU-8500</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertido (Axiovert 25)</td><td>Zeiss</td><td>663526</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen DiOC16(3) (3,3'-Dihexadecyloxacarbocianine Perclorato)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>D1125</td><td></td></tr><tr><td>Leica Confocal SP8</td><td>Leica Microsystems Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio óptico y fluorescente (Axiovert 200M)</td>Tubos de microcentrífuga <td>Zeiss</td><td>3820005619</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific</td><td>2 mL: 02681258</td><td></td>Software de<td>microscopio</td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td>AxioVision Rel. 4.8.2</td><td></td></tr><tr><td>Nestin Alexa Fluor 594&nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-23927</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>PARAFILM&nbsp;</td><td>PM992</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x), pH 7.4</td><td>HyClone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>MP Biomedicals</td><td>1670046</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Aid</td><td>Drummond Scientific Co.</td><td>P-76864</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta (1&ndash; 200 y micro; L, 101&ndash; 1000 y micro; L)</td> Pipetas de transferencia desechables estándar de plástico <td>Fisher Scinetific</td><td>2707509</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-9D</td><td></td><td>Botes</td> de</tr><tr><td>pesaje de plástico (100 mL)</td><td>Amazon&nbsp;</td><td>mdo-azoc-1030</td><td></td></tr><tr><td>poli(etilenglicol)-ditiol (PEG-diSH; 3.4 kDa)</td><td>Laysan Bio</td><td>SH-PEG-SH-3400-5g</td><td></td></tr><tr><td>Polidimehilsiloxano (PDMS) [Slygard 182 Kit de elastómero]</td><td>Elsworth Adhesives</td><td>3097358-1004 Guantes de</td> examen sin polvo de <td>polidimetilsiloxano</td></tr><tr><td></td><td>Quest</td><td>92897</td><td></td></tr><tr><td>Yoduro de propidio, 1 mg/mL de soln acuoso.&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>AAJ66584AB</tr><tr><td>RPMI-1640 Medium (1x)</td><td>HyClone</td><td>SH30027-02</td><td></td></tr><tr><td>Espaciadores de silicona - Lámina de silicona, 0,5 mm de grosor/13 cm x 18 cm</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>JTR-S-0.5</td><td></td></tr><tr><td>SOX2 Alexa Fluor 488&nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-365823</td><td></td></tr><tr><td>Campana de cultivo de tejidos</td><td>NUAIRE</td><td>NU-425-600</td><td></td></tr><tr><td>Trietanolamina, &ge; 99.0% (GC)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>90279</td><td></td></tr><tr><td>U-87 MG células de glioblastoma humano</td><td>Colección de cultivo tipo americano&nbsp;</td><td>HTB-14</td><td></td></tr></tbody></table>

fabricación y encapsulación de esferoides tumorales en hidrogeles de polietilenglicol para el estudio de las interacciones esferoide-matriz

Tumor Spheroid Fabrication and Encapsulation in Polyethylene Glycol Hydrogels for Studying Spheroid-Matrix Interactions

La encapsulación tridimensional (3D) de esferoides es crucial para replicar adecuadamente el microambiente tumoral para un crecimiento celular óptimo. Aquí, diseñamos un modelo de glioblastoma 3D in vitro para la encapsulación de esferoides para imitar el microambiente extracelular del tumor. Primero, formamos moldes de micropocillos piramidales cuadrados utilizando polidimetilsiloxano. Estos moldes de micropocillos se utilizaron para fabricar esferoides tumorales con tamaños estrictamente controlados de 50 a 500 μm. Una vez formados los esferoides, se cosecharon y encapsularon en hidrogeles a base de polietilenglicol (PEG). Los hidrogeles PEG son una plataforma versátil para la encapsulación de esferoides, ya que las propiedades del hidrogel, como la rigidez, la degradabilidad y la adhesividad celular, se pueden ajustar de forma independiente. En este caso, utilizamos un hidrogel blando representativo (~8 kPa) para encapsular los esferoides de glioblastoma. Por último, se desarrolló un método para teñir e obtener imágenes de esferoides para obtener imágenes de alta calidad mediante microscopía confocal. Debido al núcleo esferoide denso y a la periferia relativamente escasa, la obtención de imágenes puede ser difícil, pero el uso de una solución de limpieza y el corte óptico confocal ayuda a aliviar estas dificultades de obtención de imágenes. En resumen, mostramos un método para fabricar esferoides uniformes, encapsularlos en hidrogeles PEG y realizar microscopía confocal sobre los esferoides encapsulados para estudiar el crecimiento de esferoides y diversas interacciones célula-matriz.

Las plataformas de cribado de fármacos basadas en esferoides para estudiar los efectos quimioterapéuticos son cada vez más buscadas debido al énfasis en la modulación del microambiente tumoral tras la encapsulación de esferoides en biomateriales que replican tejido nativo. Aquí desarrollamos un método para la preparación de esferoides tumorales multicelulares y su posterior encapsulación e imagen en un hidrogel 3D. Los esferoides se preparan en moldes de micropocillos (Figura 3A,B), que dan ...

Aquí, presentamos un protocolo que permite la fabricación rápida, robusta y barata de esferoides tumorales seguida de encapsulación de hidrogel. Es ampliamente aplicable ya que no requiere equipo especializado. Sería particularmente útil para explorar las interacciones esferoides-matrices y construir modelos de fisiología tisular o patología in vitro .

Fabricación y encapsulación de esferoides tumorales en hidrogeles de polietilenglicol para el estudio de las interacciones esferoide-matriz

Three-dimensional (3D) encapsulation of spheroids is crucial to adequately replicate the tumor microenvironment for optimal cell growth.  Here, we ...

Nuestro laboratorio se centra en el diseño de modelos de hidrogel in vitro para la encapsulación de esteroides de glioblastoma para imitar el microambiente extracelular del tumor. Con estos modelos se investigan las propiedades efectivas del sustrato, las propiedades mecánicas y bioquímicas sobre la viabilidad de las células esteroideas, la circularidad, la talla y la diseminación. Los desafíos experimentales actuales en el desarrollo de módulos tumorales giran en torno al deseo de complejidad para imitar todos los aspectos del microambiente tumoral para su relevancia fisiológica, y también un deseo de simplicidad para hacer que el modelo sea accesible, robusto, de bajo costo y fácil de usar, y compatible con los enfoques de detección múltiple.Presentamos un protocolo que permite la fabricación rápida, robusta y de bajo costo de esteroides tumorales y su encapsulación en hidrogeles hechos para imitar el microambiente tumoral. El modelo no requiere ningún equipo especializado. Será particularmente útil para explorar las interacciones de la matriz de esteroides en la construcción de modelos de fisiología o patología de tejidos in vitro.Comprender las interacciones entre las células cancerosas del glioblastoma y su microambiente puede alentar el desarrollo de nuevas terapias para tratar mejor este cáncer. Además, el desarrollo de un modelo in vitro para el cáncer de glioblastoma puede mejorar el desarrollo de este modelo para otras enfermedades oncológicas.

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Fuente: Guyon, J., et al. Un modelo esferoide 3D para el glioblastoma. J. Vis. Exp. (2020)El video muestra la generación de un modelo esferoide tridimensional de la invasión de células tumorales. Los esferoides se forman a partir de células tumorales cerebrales humanas y se incrustan en una matriz de colágeno. Las células tumorales en la periferia esferoide adoptan un fenotipo invasivo, secretando proteasas para degradar el colágeno y avanzando para invadir la matriz circundante.

Generación de un modelo esferoide tridimensional de invasión de células tumorales

Microrheology de partículas de seguimiento se puede utilizar para cuantificar de forma no destructiva y espacialmente mapa cambios en las propiedades mecánicas de la matriz extracelular en modelos de tumores en 3D.

Medida longitudinal de la matriz extracelular Rigidez en modelos de tumores en 3D utilizando partículas de seguimiento Microrheology

Aquí, describimos un protocolo rápido y flexible para la formación de esferoides celulares 3D a través de la agregación celular. Se adapta fácilmente a múltiples tipos de células y es adecuado para su uso en una variedad de aplicaciones, incluidos los ensayos de migración celular, invasión o anoikis, y para obtener imágenes y cuantificar las interacciones célula-matriz.

Un método de agregación celular eficiente y flexible para esferoide 3D Producción

Este protocolo describe la fabricación de microcryogels elástico macroporoso 3D integrando microfabricación con tecnología cryogelation. A cargar con las células, se generan microtissues 3D, que puede ser fácilmente inyectados en vivo para facilitar la terapia regenerativa o montado en arreglos de discos para en vitro screening de drogas de alto rendimiento.

Microtissues 3D para la terapia regenerativa inyectable y drogas de alto rendimiento

Hemos desarrollado un modelo de cáncer de mama heterogéneos consistiendo en las células fibroblastos y tumor inmortalizadas encajadas un bioink de alginato/gelatina de bioprintable. El modelo recoge el microambiente tumoral de en vivo y facilita la formación de esferoides multicelulares tumor, dando la penetración en los mecanismos de conducción tumorigenesis.

Hidrogel Bioprintable alginato/gelatina 3D In Vitro modelo sistemas inducen formación de glóbulo esferoide

El microambiente tumoral es una parte esencial del crecimiento del cáncer y la invasión. Para imitar la progresión del carcinoma, se necesita una matriz humana biológicamente relevante. Este Protocolo introduce una mejora para el ensayo de invasión de esferoide tridimensional in vitro aplicando una matriz basada en Leiomioma humana. El protocolo también introduce un análisis de invasión celular basado en computadora.

Matriz basada en tumores completamente humana en ensayo de invasión de esferoide tridimensional

Aquí, describimos un ensayo de invasión fácil de usar para el glioblastoma. Este ensayo es adecuado para células similares al glioblastoma similares a un tallo. También se describe una macro de Fiji para cuantificar fácilmente la invasión, la migración y la proliferación.

Un modelo de esferoides 3D para Glioblastoma

El enfoque presentado evalúa simultáneamente la invasión de células cancerosas en ensayos esferoides 3D y citotoxicidad de células T. Los esferoides se generan en un molde multimicropopo sin andamios. El cocultivo y la incrustación en la matriz de colágeno tipo I se realizan dentro del mismo dispositivo que permite monitorear la invasión de células cancerosas y la citotoxicidad mediada de las células T.

Monitoreo de la invasión de células cancerosas y la citotoxicidad de células T en el cultivo 3D

Faltan modelos integrales in vitro que recapitulen fielmente la enfermedad humana relevante. El presente estudio presenta la creación y cultivo de esferoides tumorales tridimensionales (3D), una herramienta in vitro fiable para estudiar la interacción tumor-estroma en el carcinoma hepatocelular humano.

Un modelo esferoide tridimensional para investigar la interacción tumor-estroma en el carcinoma hepatocelular

El presente estudio describe metodologías para cultivar, congelar, descongelar, procesar, teñir, etiquetar y examinar esferoides y organoides completos bajo varios microscopios, mientras permanecen intactos en un hidrogel dentro de un dispositivo multipropósito.

Cultivo, congelación, procesamiento e imágenes de organoides y esferoides completos mientras aún están en un hidrogel

Este artículo demuestra un método estandarizado para construir esferoides tumorales tridimensionales. También se describe una estrategia para la observación de esferoides y el análisis de aprendizaje profundo basado en imágenes utilizando un sistema automatizado de imágenes.

Generación de esferoides tumorales 3D para estudios de evaluación de fármacos

Aprende a fabricar y encapsular esferoides tumorales en hidrogeles de polietilenglicol para estudiar interacciones esferoide-matriz. Este método rápido y económico imita el microambiente tumoral sin equipo especializado.

Fabricación y encapsulación de esferoides tumorales en hidrogeles de polietilenglicol para el estudio de las interacciones esferoide-matriz (Video) | JoVE Journal

Fabricación y encapsulación de esferoides tumorales en hidrogeles de polietilenglicol para el estudio de las interacciones esferoide-matriz

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