Name: Cromatografía de gases-Espectrometría de masas basada en metabolómica dirigida de muestras de coral duro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Aprenda a realizar cromatografía de gases-espectrometría de masas para analizar metabolitos polares en holobiontes de coral duro. Este método permite separar tejido del hospedero y células de Symbiodiniaceae para estudiar interacciones metabólicas y su impacto en la resiliencia del arrecife.

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J.L.M. recibió el apoyo de una beca de investigación del rector de UTS.

Perfil de metabolitos de muestras de corales duros utilizando GC-MS

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que revelar.

La separación del huésped y el simbionte se puede lograr fácil y rápidamente a través de una simple centrifugación, y los resultados aquí muestran que la separación de las fracciones puede proporcionar información valiosa indicativa de contribuciones específicas de miembros holobiontes, que pueden contribuir al análisis funcional de la salud de los corales. En los corales adultos, la síntesis de lípidos es realizada principalmente por el simbionte de algas residente 40, que suministra lípidos (por ejemplo, triac...

Los metabolitos representan los productos finales de los procesos celulares, y la metabolómica -el estudio del conjunto de metabolitos producidos por un organismo o ecosistema determinado- puede proporcionar una medida directa del funcionamiento del organismo. Esto es particularmente crítico para explorar los ecosistemas, las interacciones simbióticas y las herramientas de restauración, ya que el objetivo de la mayoría de las estrategias de manejo es preservar (o restaurar) funciones específicas de los servicios ecosistémicos2. Los arrecifes de coral son un ecosistema acuático que demuestra el valor potencial de la metabolómica para dilucidar las interacciones simbióticas y vincular las respuestas fisiológicas de los corales con los impactos a nivel de la comunidad y del ecosistema3. La aplicación de la cromatografía de gases-espectrometría de masas de alto rendimiento (GC-MS) es especialmente valorada debido a su capacidad para analizar rápidamente una amplia gama de clases de metabolitos simultáneamente con alta selectividad y sensibilidad, proporcionar una rápida identificación de compuestos cuando se dispone de bibliotecas espectrales y proporcionar un alto nivel de reproducibilidad y precisión, con un coste por muestra relativamente bajo.
Los corales son holobiontes formados por el animal coralino, endosimbiontes dinoflagelados fotosintéticos (familia: Symbiodiniaceae4) y un microbioma complejo 5,6. En general, la aptitud del holobionte se mantiene principalmente a través del intercambio de pequeñas moléculas y elementos para apoyar el funcionamiento metabólico de cada miembro 7,8,9,10. Los enfoques metabolómicos han demostrado ser especialmente poderosos para dilucidar la base metabólica de la especificidad de la simbiosis 9,11, la respuesta de blanqueamiento al estrés térmico 7,8,12,13, las respuestas a enfermedades 14, las respuestas a la exposición a la contaminación 15, la fotoaclimatación 16 y la señalización química 17 en corales, así como para ayudar en el descubrimiento de biomarcadores 18,19. Además, la metabolómica puede proporcionar una valiosa confirmación de las conclusiones inferidas a partir de técnicas basadas en ADN y ARN 9,20. Por lo tanto, existe un potencial considerable para el uso de la metabolómica para evaluar la salud de los arrecifes y desarrollar herramientas para la conservación de los arrecifes3, por ejemplo, mediante la detección de biomarcadores metabólicos de estrés18,19 y para examinar el potencial de las estrategias de gestión activa, como los subsidios nutricionales21.
Separar las células huésped y simbionte y analizar sus perfiles de metabolitos de forma independiente, en lugar de juntas como el holobionte, puede proporcionar más información sobre las interacciones de la pareja, los estados fisiológicos y metabólicos independientes y los posibles mecanismos moleculares de adaptación 11,12,22,23,24. Sin separar el coral y las Symbiodiniaceae, es casi imposible dilucidar la contribución y el metabolismo de los corales y/o Symbiodiniaceae de forma independiente, excepto con la reconstrucción compleja del genoma y el modelado metabólico25, pero esto aún no se ha aplicado a la simbiosis coral-dinoflagelado. Además, intentar extraer información sobre el metabolismo individual del huésped o del simbionte de algas a partir del perfil de metabolitos del holobionte puede dar lugar a interpretaciones erróneas.
Por ejemplo, hasta hace poco, se pensaba que la presencia de ácidos grasos poliinsaturados C18:3n-6, C18:4n-3 y C16 en extractos de tejidos de corales y holobiontes se derivaba del simbionte de las algas, ya que se suponía que los corales no poseían las ωx desaturasas esenciales para la producción de ácidos grasos omega-3 (ω3); sin embargo, la evidencia genómica reciente sugiere que múltiples cnidarios tienen la capacidad de producir AGPI ω3 de novo y biosintetizar aún más AGPI26 de cadena larga ω3. La combinación de GC-MS con marcaje isotópico estable (p. ej., 13 C-bicarbonato, NaH 13CO 3) se puede utilizar para rastrear el destino del carbono fijado fotosintéticamente a través de las redes metabólicas de holobiontes de coral tanto en condiciones de control como en respuesta a factores estresantes externos27,28. Sin embargo, un paso crítico en el seguimiento del destino de 13 C es la separación del tejido de coral de las células de algas, solo entonces se puede asignar inequívocamente la presencia de un compuesto marcado con 13C en la fracción huésped del coral como un metabolito derivado de Symbiodiniaceae translocado al coral o un producto aguas abajo de un compuesto marcado translocado. Esta técnica ha demostrado su poder al desafiar la suposición sostenida durante mucho tiempo de que el glicerol es la forma primaria en la que el fotosintato se transloca del simbionte al huésped29, así como al dilucidar cómo cambia el flujo nutricional entre socios durante el blanqueamiento27,28 y en respuesta a especies de Symbiodiniaceae incompatibles11.
Si bien la decisión de separar los tejidos depende principalmente de la pregunta de investigación, es importante tener en cuenta la practicidad, la confiabilidad y los posibles impactos metabólicos de este enfoque. Aquí, proporcionamos métodos detallados y demostrados para la extracción de metabolitos del holobionte, así como de las fracciones separadas del huésped y del simbionte. Comparamos los perfiles de metabolitos del huésped y del simbionte de forma independiente y cómo se comparan estos perfiles con el perfil de metabolitos del holobionte.

<table><tbody><tr><td>100% metanol de grado LC</td><td>Merck</td><td>439193</td><td>tubos</td></tr> de <tr><td>microcentrífuga esenciales de 2 mL, PP</td><td>Eppendorf</td><td>30121880</td><td>polipropileno proporciona una alta resistencia a los productos químicos, al estrés mecánico y a las temperaturas extremas</td></tr><tr><td>2030 Cromatógrafo de gases Shimadzu Shimadzu</td><td>GC-2030</td><td></td><td></td></tr><tr><td>710-1180 &micro; m perlas de vidrio lavadas con ácido</td><td>Merck</td><td> G1152</td><td>Este tamaño es óptimo para romper las células Symbiodiniaceae</td></tr><tr><td>AOC-6000 Plus Automuestreador multifuncional</td><td>Shimadzu</td><td>AOC6000</td><td></td></tr><tr><td>Bradford reactivo</td><td>Merck</td><td>B6916</td><td>Cualquier reactivo colorimétrico de proteína es aceptable</td></tr><tr><td>Pistola de aire comprimido</td><td>Ozito</td><td>6270636</td><td>Diseño similar aceptable. Tener un accesorio para colocar una punta de 1 mL es fundamental.</td></tr><tr><td>&nbsp; Columna DB-5 con columna de 0,25 mm de diámetro interno y 1 &micro; m espesor de película</td><td>Agilent</td><td>122-5013</td><td></td></tr><tr><td>DMF</td><td>Merck</td><td>RTC000098</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbitol-6-13C y/o 13C5&ndash; 15N Valina</td><td>Merck</td><td>605514/ 600148</td><td>Al metanol se le pueden añadir uno o ambos patrones internos.</td></tr><tr><td>Placa de fondo plano de 96 pocillos</td><td>Merck</td><td>CLS3614</td><td></td></tr><tr><td>Viales de centelleo de vidrio</td><td>Merck</td><td>V7130</td><td>de 20 mL, con junta no plástica</td></tr><tr><td>Immunoglogin G</td><td>Merck</td><td>56834</td><td>si no está disponible, la albúmina sérica bovina es aceptable</td></tr><tr><td>Primer</td><td></td><td>v4</td><td></td></tr><tr><td>R</td><td></td><td>v4.1.2</td><td></td></tr><tr><td>Shimadzu LabSolutions Software</td> <td>Insight</td><td>v3.6</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Merck</td><td>S5881</td><td>Pellets para hacer 1 M solución</td></tr><tr><td>tidyverse</td><td>v1.3.1</td><td>R paquete</td>TissueLyser <td></td></tr><tr><td>LT</td><td>Qiagen</td><td>85600</td><td>O similar</td></tr><tr><td>TQ8050NX espectrómetro de masas de triple cuadrupolo</td><td>Shimadzu</td><td>GCMS-TQ8050 NX</td><td></td></tr><tr><td>UV-96 placa de pocillos</td><td>Greiner</td><td>M3812</td><td></td></tr><tr><td>Bolsa de muestras Whirl-Pak</td><td>Merck</td><td>WPB01018WA</td><td>Bolsa de recogida de muestras; Tamaño: lo suficientemente grande como para albergar un fragmento de coral de ~5 cm, pero no demasiado grande como para que el agua esté demasiado dispersa</td></tr></tbody></table>

cromatografía de gases-espectrometría de masas basada en metabolómica dirigida de muestras de coral duro

Gas Chromatography-Mass Spectrometry-Based Targeted Metabolomics of Hard Coral Samples

Los enfoques basados en cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) han demostrado ser poderosos para dilucidar la base metabólica de la simbiosis cnidario-dinoflagelada y cómo responde el coral al estrés (es decir, durante el blanqueamiento inducido por la temperatura). El perfil de metabolitos en estado estacionario del holobionte de coral, que comprende el huésped cnidario y sus microbios asociados (Symbiodiniaceae y otros protistas, bacterias, arqueas, hongos y virus), se ha aplicado con éxito en condiciones ambientales y de estrés para caracterizar el estado metabólico holístico del coral.
Sin embargo, para responder a las preguntas que rodean las interacciones simbióticas, es necesario analizar los perfiles de metabolitos del coral huésped y sus simbiontes de algas de forma independiente, lo que solo puede lograrse mediante la separación física y el aislamiento de los tejidos, seguidos de una extracción y análisis independientes. Si bien la aplicación de la metabolómica es relativamente nueva en el campo de los corales, los esfuerzos sostenidos de los grupos de investigación han dado como resultado el desarrollo de métodos robustos para analizar los metabolitos en los corales, incluida la separación del tejido huésped de coral y los simbiontes de algas.
Este artículo presenta una guía paso a paso para la separación de holobiontes y la extracción de metabolitos para el análisis de GC-MS, incluidos los pasos clave de optimización para su consideración. Demostramos cómo, una vez analizado de forma independiente, el perfil de metabolitos combinados de las dos fracciones (coral y Symbiodiniaceae) es similar al perfil del conjunto (holobionte), pero al separar los tejidos, también podemos obtener información clave sobre el metabolismo y las interacciones entre los dos socios que no se puede obtener del todo por sí solo.

Todos los datos producidos durante este trabajo están disponibles en la información complementaria.
Separación huésped-simbionte
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65628/65628fig01.jpg"> Figura 1: Configuración y validación de la separación de los tejidos del huésped de coral y las células de Symbiodiniaceae. (A) La c...

Aquí, presentamos la extracción y preparación de metabolitos polares y semipolares de un holobionte de coral, así como tejido huésped de coral separado y fracciones celulares de Symbiodiniaceae, para el análisis de cromatografía de gases-espectrometría de masas.

Cromatografía de gases-Espectrometría de masas basada en metabolómica dirigida de muestras de coral duro

Gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)-based approaches have proven to be powerful for elucidating the metabolic basis of the ...

Al igual que con todos los organismos, los corales dependen de una nutrición superlativa para crecer y construir arrecifes para la inmunidad y la reproducción y para soportar las condiciones ambientales cambiantes. Pero sabemos muy poco sobre la nutrición óptima de los corales en condiciones normales o cambiantes, y cómo cada miembro del holobionte de coral contribuye a este estado nutricional. Los corales son holobiontes compuestos por el huésped y varios microorganismos simbióticos.Estos incluyen Symbiodiniaceae, protistas, bacterias, virus y hongos. La aptitud del holobionte depende de las interacciones metabólicas entre estos miembros. Por ejemplo, las simbiodiáceas proporcionan fotosintato para apoyar el metabolismo del huésped y ayudarlo a adaptarse a las condiciones cambiantes.Para entender esta asociación crucial, necesitamos estudiar la composición química y metabólica de cada socio por separado. Estos hallazgos demostraron que se podía obtener más información separando las fracciones del huésped y del simbionte para el análisis metabólico. Sin embargo, la decisión de analizar fracciones separadas frente al holobionte se rige en última instancia por la pregunta de investigación.Por lo tanto, en los casos en los que es preferible el análisis del holobionte, proporcionamos una metodología para las extracciones de metabolitos del holobionte y sugerencias para obtener la mayor cantidad de información posible durante el análisis. Los métodos utilizados en este estudio abren nuevas vías de investigación. Estos incluyen la revelación de biomarcadores potenciales, la identificación de metabolitos clave durante etapas específicas de la vida o condiciones de estrés, la comprensión de las ventajas de asociarse con ciertas especies y la exploración de interacciones dentro del holobionte.La investigación futura se centrará en la aplicación de los protocolos aquí establecidos a varias áreas de investigación, incluida la detección de biomarcadores con aplicaciones en la conservación y restauración de arrecifes de coral. Esta metodología también se puede aplicar cuando la separación de fracciones no es posible para otras medidas fisiológicas. Por ejemplo, cuando se analizan las emisiones de metabolitos volátiles de las colonias de coral.

gas-chromatography-mass-spectrometry-based-targeted-metabolomics-hard

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

El perfil de metabolitos no dirigido mediante cromatografía líquida de ultra rendimiento junto con espectrometría de masas (UPLC-MS) es una técnica poderosa para investigar el metabolismo.  Este artículo describe un flujo de trabajo típico utilizado para la elaboración de perfiles de metabolitos no dirigidos en suero, incluida la organización y preparación de muestras, la adquisición de datos, el análisis de datos, el control de calidad y la identificación de metabolitos.

A gran escala que no son objeto de perfiles metabolómicos de Serum Ultra Performance Liquid Chromatography-espectrometría de masas (UPLC-MS)

Untargeted metabolómica ofrece una hipótesis de generación instantánea de un perfil metabólico. Este protocolo se demostrará la extracción y el análisis de los metabolitos de las células, suero, o tejidos. Una gama de metabolitos se examinó utilizando extracción en fase líquido-líquido, microflujo UltraPerformance cromatografía líquida / de alta resolución de la espectrometría de masas (UPLC-HRMS) acoplado al software de análisis diferencial.

Metabolómica no focalizados de fuentes biológicas Uso UltraPerformance cromatografía líquida-espectrometría de masas de alta resolución (UPLC-HRMS)

Metabolito de perfiles ha sido un valioso activo en el estudio del metabolismo en la salud y la enfermedad. La utilización de la cromatografía en fase normal líquida acoplada a espectrometría de masas de alta resolución con el cambio de polaridad y un ciclo de trabajo rápido, se describe un protocolo para analizar la composición metabólica polar de material biológico con una alta sensibilidad, precisión y resolución.

Una estrategia para sensibles, grande escala cuantitativa Metabolómica

Este protocolo es para la extracción y concentración de proteínas y ADN de la biomasa microbiana recogida del agua de mar, seguida de la generación de péptidos trípticos adecuados para el análisis proteómico basado en espectrometría de masas en tándem.

Un Aquatic Microbial metaproteomics Flujo de trabajo: a partir de células a tríptico péptidos adecuados para el análisis basado en la espectrometría de masas en tándem

Se describe un método de espectrometría de masas bidimensional de cromatografía de gases en tiempo de vuelo para la caracterización de la fracción acuosa de biocrudo producida a partir de la licuefacción hidrotermal de algas. Este protocolo también se puede emplear para analizar la fracción acuosa de productos líquidos de pirólisis rápida, pirólisis rápida catalítica, desoxigenación catalítica e hidrotratamiento.

Caracterización cualitativa de la fracción acuosa de hidrotérmico Licuefacción de algas mediante 2D cromatografía de gases con espectrometría de masas de tiempo de vuelo

Se describe un método de longitud de los fragmentos de restricción polimórficos-reacción en cadena de polimerasa mejorado para el genotipado de especies pufferfish por espectrometría de cromatografía / masa líquida. Una columna monolito de sílice de fase inversa se emplea para la separación de amplicones digeridos. Este método puede dilucidar las masas monoisotópicas de oligonucleótidos, que es útil para la identificación de la composición base.

Mejora de la reacción en cadena de polimerasa-polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción Genotipado de Pez globo Tóxico por cromatografía líquida / espectrometría de masas

Este protocolo describe cómo preparar larvas de Drosophila para análisis metabolómicos basadas en GC-MS.

Preparación de muestras de larvas de Drosophila para cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS)-base metabolómica

Este protocolo describe un rendimiento único para técnicas complementarias analíticas y ómicas que culmina en una caracterización totalmente emparejado de materia orgánica natural y proteómica microbiana en diferentes ecosistemas. Este enfoque permite comparaciones robustas para la identificación de rutas metabólicas y transformaciones importantes para describir la producción de gas de efecto invernadero y predecir las respuestas al cambio ambiental.

Técnicas analíticas de alta resolución complementarias solo rendimiento para caracterizar mezclas complejas de materia orgánica Natural

Se presenta un método para el análisis no focalizado de metabolitos y lípidos de grano de trigo. El protocolo incluye un método de extracción de metabolito de acetonitrilo y una metodología de espectrometría de masas de cromatografía líquida de fase inversa, con adquisición en modos de ionización de electrospray positivo según lo negativo y negativo.

Análisis de metabolómica basada en cromatografía líquida no dirigida de grano de trigo

El manuscrito presenta muestras in situ de tumores cerebrales humanos con microextracción de fase sólida seguida de su perfil bioquímico hacia el descubrimiento de biomarcadores.

Muestreo y extracción in situ de tumores cerebrales para el análisis de metabolómica y lipidómica

Se presenta un método para el análisis metabolómico de la cebada. El método implica el fraccionamiento y derivatización de metabolitos y el análisis de los mismos mediante cromatografía de gases/espectrometría de masas (GC/MS). El análisis metabolómico se puede utilizar para determinar el efecto del cultivo intercalado y el estrés por sequía en el grano.

Análisis metabolómico de cebada por cromatografía de gases/espectrometría de masas

Aprenda a realizar cromatografía de gases-espectrometría de masas para analizar metabolitos polares en holobiontes de coral duro. Este método permite separar tejido del hospedero y células de Symbiodiniaceae para estudiar interacciones metabólicas y su impacto en la resiliencia del arrecife.

Cromatografía de gases-Espectrometría de masas basada en metabolómica dirigida de muestras de coral duro

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