Name: Purificación por afinidad de una enzima fibrinolítica de Sipunculus nudus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T12:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Aprende a purificar enzimas fibrinolíticas de Sipunculus nudus mediante cromatografía de afinidad con arginina o lisina. Este método simple y eficiente mejora la obtención de enzimas para aplicaciones biotecnológicas.

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Esta investigación fue financiada por la Oficina de Ciencia y Tecnología de la ciudad de Xiamen (3502Z20227197) y la Oficina de Ciencia y Tecnología de la Provincia de Fujian (No. 2019J01070, No.2021Y0027).

1. Preparación
<ol><li>Tratamiento de la muestra<ol><li>Diseccionar cuidadosamente S. nudus fresco (100 g) y recoger el intestino y su líquido interno.</li>
		<li>Añadir 300 ml de tampón Tris-HCl (0,02 M, pH 7,4) para homogeneización (1.000 rpm, 60 s).</li>
		<li>Congelar-descongelar el homogeneizado 3x.</li>
		<li>Centrifugar la muestra (10.956 × g, 0,5 h, 4 °C) y recoger el sobrenadante. Conservar la muestra a 4 °C hasta su uso posterior.</li>
	</ol></li>
	<li>Precipitación de proteínas<ol><li>Mezclar el sobrenadante con una solución saturada de sulfato de amonio (nueve volúmenes) y dejar reposar la mezcla durante 12 h a 4 °C. NOTA: El protocolo se puede pausar aquí y continuar más tarde.</li>
		<li>Centrífuga (10.956 × g, 0,5 h, 4 °C) para obtener el precipitado proteico; Almacénelo a 4 °C para su uso posterior.</li>
	</ol></li>
	<li>Resuspensión proteica<ol><li>Resuspender el precipitado proteico con 30 mL de tampón Tris-HCl (0,02 M, pH 7,4). Conservar esta solución de proteína cruda a 4 °C para su uso posterior.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Cromatografía de afinidad
<ol><li>Filtración de soluciones<ol><li>Filtrar la solución de proteína cruda a través de una membrana filtrante de 0,22 μm. Conservar esta muestra a 4 °C para su uso posterior.</li>
	</ol></li>
	<li>Embalaje de columnas<ol><li>Empaque la columna de cromatografía de afinidad de matriz de arginina-agarosa y la columna de cromatografía de afinidad de matriz de lisina-agarosa cargando una cantidad adecuada de medio de matriz de lisina-agarosa y medio de matriz de arginina-agarosa en columnas de cromatografía vacías de 5 ml. NOTA: La columna se puede almacenar a 2-8 °C, con la matriz sumergida en tampón de almacenamiento (20% de etanol).</li>
	</ol></li>
	<li>Purificación de afinidad<ol><li>Equilibrar la columna de cromatografía de afinidad con ddH2O primero (1 mL/min, 10 volúmenes de columna), seguido de tampón Tris-HCl (0,02 M, pH 8,0, 1 mL/min, 5 volúmenes de columna).</li>
		<li>Cargue la muestra de solución de proteína en la columna preequilibrada (1 ml/min, volumen de 1/3 columna). NOTA: El volumen de carga de la muestra depende de la concentración de sFE.</li>
		<li>Lave la columna con tampón Tris-HCl (0,02 M, pH 8,0, volúmenes de cinco columnas).</li>
		<li>Eluya la columna con 0,15 M, 0,25 M, 0,35 M, 0,45 M, 0,55 M y 0,65 M NaCl (1 ml/min, cinco volúmenes de columna) sucesivamente.</li>
		<li>Busque el pico de elución que debe aparecer en la elución de NaCl 0.15 M y luego recoja las fracciones en tubos de 5 ml.</li>
		<li>Concentrar la muestra de elución utilizando un filtro ultracentrífugo de 3 kD (3.944 × g, 1,5 h, 4 °C). Conservar esta muestra a -80 °C para su uso posterior.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Evaluación de la pureza
<ol><li>Preparación en gel de electroforesis en gel de poliacrilamida dodecil-sulfato de sodio (SDS-PAGE)<ol><li>Preparar el gel SDS-PAGE según el método de Laemmli utilizando gel concentrado al 5% y gel de separación al 12%13.</li>
	</ol></li>
	<li>Electroforesis<ol><li>Mezclar la muestra (15 μL) con 5 tampón de carga de proteínas SDS-PAGE (1/4 volumen), calentar en agua hirviendo durante 5 min, cargar en el gel SDS-PAGE y hacer correr el gel a 80 V, 60 mA durante 1,5 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Análisis<ol><li>Después de la electroforesis, tiñe el gel con un kit de tinción de plata, de acuerdo con el protocolo del fabricante, y observe el gel teñido utilizando un sistema de imágenes quimioluminiscentes.</li>
		<li>Analice la pureza de la proteína diana utilizando la siguiente fórmula: pureza de la proteína diana = valor de intensidad de la proteína diana/valor de intensidad de la proteína total.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Evaluación de la actividad fibrinolítica
<ol><li>Preparación de la placa de fibrina<ol><li>Preparar la solución de fibrinógeno mezclando 25 mg de fibrinógeno con 1,25 ml de solución salina fisiológica.</li>
		<li>Prepare la solución de trombina mezclando completamente 100 U de trombina con 1,05 ml de solución salina fisiológica.</li>
		<li>Preparar la solución de agarosa añadiendo 0,5 g de agarosa a 22,5 ml de tampón Tris-HCl (0,02 mol/L, pH 7,4). Mezclar y calentar la solución de agarosa a 100 °C hasta que se disuelva completamente.</li>
		<li>Enfriar la solución de agarosa hasta unos 50 °C y añadir la solución de fibrinógeno. Luego, agregue inmediatamente la solución de trombina, mézclelos rápidamente y viértalos en una fuente de cultivo de 60 mm.</li>
	</ol></li>
	<li>Carga<ol><li>Perforar pocillos de 3 mm en las placas de fibrina preparadas utilizando un barrenador estéril y llenar los pocillos con muestras de 10 μL.</li>
	</ol></li>
	<li>Análisis<ol><li>Después de 18 h de incubación a 37 °C, medir la actividad fibrinolítica calculando el tamaño de sus zonas degradantes. Actividad fibrinolítica = (tamaño de zona de la muestra/tamaño de zona de la uroquinasa) x 100 U. Tamaño de zona = diámetro x diámetro. NOTA: Para el control blanco, el control negativo y el control positivo se utilizaron tampón salino fisiológico, proteína cruda (muestra obtenida en el paso 1.3.1 del protocolo) y uroquinasa. En comparación con la uroquinasa, encontramos que la actividad fibrinolítica de la sFE purificada fue ~ 19,200 U / ml.</li>
	</ol></li>
</ol>

Purificación de una enzima fibrinolítica de Sipunculus nudus mediante cromatografía de afinidad

<ol><li>Rosell, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patients+with+COVID-19+have+elevated+levels+of+circulating+extracellular+vesicle+tissue+factor+activity+that+is+associated+with+severity+and+mortality-brief+report%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-brief report.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).</li>
<li>Schultz, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombosis+and+thrombocytopenia+after+ChAdOx1+nCoV-19+vaccination.+The+New+England%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Thrombosis and thrombocytopenia after ChAdOx1 nCoV-19 vaccination. The New England.</a> Journal of Medicine. 384 (22), 2124-2130 (2021).</li>
<li>von Kaulla, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urokinase-induced+fibrinolysis+of+human+standard+clots%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Urokinase-induced fibrinolysis of human standard clots.</a> Nature. 184 (4695), 1320-1321 (1959).</li>
<li>Van de Werf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+thrombolysis+with+tissue-type+plasminogen+activator+in+patients+with+evolving+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Coronary thrombolysis with tissue-type plasminogen activator in patients with evolving myocardial infarction.</a> The New England Journal of Medicine. 310 (10), 609-613 (1984).</li>
<li>Schaller, J., Gerber, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plasmin-antiplasmin+system%3A+structural+and+functional+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">The plasmin-antiplasmin system: structural and functional aspects.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (5), 785-801 (2011).</li>
<li>Ge, Y. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+antithrombotic+protease+from+marine+worm+Sipunculus+nudus%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">A novel antithrombotic protease from marine worm Sipunculus nudus.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 3023(2018).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+a+novel+fibrinolytic+enzyme+from+culture+supernatant+of+Pleurotus+ostreatus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from culture supernatant of Pleurotus ostreatus.</a> Journal of Microbiology and Biotechnology. 24 (2), 245-253 (2014).</li>
<li>Choi, J. -H., Sapkota, K., Kim, S., Kim, S. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Starase%3A+A+bi-functional+fibrinolytic+protease+from+hepatic+caeca+of+Asterina+pectinifera+displays+antithrombotic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Starase: A bi-functional fibrinolytic protease from hepatic caeca of Asterina pectinifera displays antithrombotic potential.</a> Biochimie. 105, 45-57 (2014).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+fibrinolytic+protein+From+Pheretima+vulgaris%3A+purification%2C+identification%2C+antithrombotic+evaluation%2C+and+mechanisms+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">A novel fibrinolytic protein From Pheretima vulgaris: purification, identification, antithrombotic evaluation, and mechanisms investigation.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 772419(2022).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antioxidant%2C+hypolipidemic+and+hepatic+protective+activities+of+polysaccharides+from+Phascolosoma+esculenta%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Drugs%22%5BJournal%5D)">Antioxidant, hypolipidemic and hepatic protective activities of polysaccharides from Phascolosoma esculenta.</a> Marine Drugs. 18 (3), 158(2020).</li>
<li>Xu, R., Ma, G., Chen, L., Cui, X. Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en">https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en</a> (2019).</li>
<li>Li, W., Yuan, M., Wu, Y., Xu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+expressed+differentially+in+female+and+male+gametes+of+Sipunculus+nudus%5BTitle%5D)+AND+%22Aquaculture+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of genes expressed differentially in female and male gametes of Sipunculus nudus.</a> Aquaculture Research. 51 (9), 3780-3789 (2020).</li>
<li>Ossipow, V., Laemmlii, U. K., Schibler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+to+renature+DNA-binding+proteins+separated+by+SDS-polyacrylamide+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A simple method to renature DNA-binding proteins separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Nucleic Acids Research. 21 (25), 6040-6041 (1993).</li>
<li>Hsu, T., Ning, Y., Gwo, J., Zeng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+barcoding+reveals+cryptic+diversity+in+the+peanut+worm+Sipunculus+nudus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology+Resources%22%5BJournal%5D)">DNA barcoding reveals cryptic diversity in the peanut worm Sipunculus nudus.</a> Molecular Ecology Resources. 13 (4), 596-606 (2013).</li>
<li>Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasminogen-plasmin+system.+I.+Purification+and+properties+of+human+plasminogen%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Plasminogen-plasmin system. I. Purification and properties of human plasminogen.</a> The Journal of Biochemistry. 64 (6), 743-750 (1968).</li>
<li>Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasminogen-plasmin+system.+II.+Purification+and+properties+of+human+plasmin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Plasminogen-plasmin system. II. Purification and properties of human plasmin.</a> The Journal of Biochemistry. 64 (6), 751-757 (1968).</li>
<li>Wiman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity-chromatographic+purification+of+human+%CE%B12-antiplasmin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Affinity-chromatographic purification of human α2-antiplasmin.</a> The Biochemical Journal. 191 (1), 229-232 (1980).</li>
<li>Sandbjerg Hansen, M., Clemmensen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+purification+and+characterization+of+a+new+fast-acting+plasmin+inhibitor+from+human+platelets.+Evidence+for+non-identity+with+the+known+plasma+proteinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Partial purification and characterization of a new fast-acting plasmin inhibitor from human platelets. Evidence for non-identity with the known plasma proteinase inhibitors.</a> The Biochemical Journal. 187 (1), 173-180 (1980).</li>
<li>Pietrocola, G., Rindi, S., Nobile, G., Speziale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+human+plasma%2Fcellular+fibronectin+and+fibronectin+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Fibrosis%22%5BJournal%5D)">Purification of human plasma/cellular fibronectin and fibronectin fragments.</a> Fibrosis. 1627, 309-324 (2017).</li>
<li>Nabiabad, H. S., Yaghoobi, M. M., Javaran, M. J., Hosseinkhani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+analysis+and+purification+of+human+recombinant+tissue+type+plasminogen+activator+%28rt-PA%29+from+transgenic+tobacco+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Preparative+Biochemistry+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Expression analysis and purification of human recombinant tissue type plasminogen activator (rt-PA) from transgenic tobacco plants.</a> Preparative Biochemistry and Biotechnology. 41 (2), 175-186 (2011).</li>
<li>Shearin, T. V., Pizzo, S. V., Gonzalez-Gronow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+abnormalities+of+human+plasminogen+isolated+from+synovial+fluid+of+rheumatoid+arthritis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Molecular abnormalities of human plasminogen isolated from synovial fluid of rheumatoid arthritis patients.</a> Journal of Molecular Medicine. 75 (5), 378-385 (1997).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Debido a la falta de disponibilidad de la secuencia génica exacta de sFE, la sFE utilizada actualmente se extrajo de S. nudus14 fresco. Además, los procedimientos de purificación de sFE descritos en la literatura fueron complicados y costosos, ya que se basaron en algunas características generales de sFE, como el peso molecular, el punto isoeléctrico, la fuerza iónica y la polaridad15,16. Hasta la fecha no se ha informado de ningú...

La trombosis es una amenaza importante para la salud pública, especialmente después de la pandemia mundial de Covid-19 1,2. Clínicamente, muchos activadores del plasminógeno (AP), como el activador del plasminógeno de tipo tisular (tPA) y la uroquinasa (Reino Unido), se han utilizado ampliamente como fármacos trombolíticos. Los PA pueden activar el plasminógeno de los pacientes en plasmina activa para degradar la fibrina. Así, su eficiencia trombolítica está fuertemente restringida por el estado plasminógeno de los pacientes 3,4. Los agentes fibrinolíticos, como la metaloproteinasa plasmina y la serina plasmina, son otro tipo de fármaco trombolítico clínico que también incluye enzimas fibrinolíticas (FE) como la plasmina, que pueden disolver los coágulos directamente, pero son rápidamente inactivados por varios inhibidores de la plasmina5. Posteriormente, se ha informado de un nuevo tipo de agente fibrinolítico que puede disolver el trombo no solo activando el plasminógeno en plasmina, sino también degradando la fibrina directamente 6-la enzima fibrinolítica del antiguo gusano del maní Sipunculus nudus (sFE)6. Esta bifunción otorga a sFE otras ventajas sobre los fármacos trombolíticos tradicionales, especialmente en términos de estado anormal del plasminógeno. En comparación con otros agentes fibrinolíticos bifuncionales 7,8,9, la sFE muestra varias ventajas, incluida la seguridad, sobre los agentes no derivados de alimentos para el desarrollo de fármacos, especialmente para medicamentos orales. Esto se debe a que la bioseguridad y biocompatibilidad de Sipunculus nudus han sido bien establecidas10.
Al igual que los otros agentes fibrinolíticos naturales aislados de microorganismos, lombrices de tierra y hongos, la purificación de sFE de S. nudus es muy complicada e incluye múltiples etapas, como homogeneización tisular, precipitación de sulfato de amonio, desalinización, cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de interacción hidrofóbica y tamizado molecular10,11,12. Tal sistema de purificación no solo depende de habilidades competentes y materiales costosos, sino que también requiere varios días para completar todo el procedimiento. Por lo tanto, un programa simple de purificación de sFE es de gran importancia para el desarrollo posterior de sFE. Afortunadamente, dos cristales de sFE (PDB: 8HZP; PDB: 8HZO) se han obtenido con éxito (ver Archivo Suplementario 1 y Archivo Suplementario 2). A través del análisis estructural y los experimentos de acoplamiento molecular, encontramos que el núcleo catalítico de sFE podría unirse específicamente a objetivos que contienen residuos de arginina o lisina.
Aquí, se propuso por primera vez un sistema de purificación de afinidad, basado en la estructura cristalina de sFE. Siguiendo este protocolo, la sFE altamente pura y altamente activa podría purificarse a partir de los extractos crudos en una sola etapa de purificación de afinidad. El protocolo desarrollado aquí no solo es importante para la preparación a gran escala de sFE, sino que también se puede aplicar para la purificación de otros agentes fibrinolíticos.

<table><tbody><tr><td>30% Acrilamida-Bisacrilamida (29:1)</td><td>Biosharp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Solarbio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarosa G-10</td><td>Biowest</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amonio</td><td>SINOPHARM</td> Sulfato de amonio SINOPHARM <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arginina-Sepharose 4B</td><td>Solarbio</td><td>Matriz de arginina-agarosa</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromoxilenol (BPB)</td><td>Solarbio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fast Silver Stain Kit</td><td>Beyotime</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogen</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Solarbio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico</td><td>SINOPHARM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kinasa</td><td>RHAWN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lisina-Sepharose 4B</td><td>Solarbio</td> Matriz <td></td><td>de lisina-agarosa</td></tr><tr><td>N,N,N',N'-Tetrametilemilendiamina (TEMED)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Marcador de proteínas de color preteñido (10-170 kD)</td><td>Beyotime</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>SINOPHARM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfonato de sodio (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de</td> <td>sodioSINOPHARM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trombina</td><td>Meilunbio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris (Hidroximetil) Aminometano</td><td>Solarbio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris (Hidroximetil) Clorhidrato de aminometano</td><td>Solarbio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AKT Aprotein Pura Sistema de purificación GE puro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Esterilizador automático de vapor de presión vertical MLS-3750</td><td>Sistema</td> de imágenes de quimioluminiscencia SANYO <td></td><td></td></tr><tr><td>Bomba de flujo constante GE</td><td></td> BT-100 QITE <td></td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de temperatura constante</td> Centrífuga refrigerada de escritorio <td>JINGHONG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-30KS</td><td>SIGMA</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> DHG Series Horno de calentamiento y secado <td></td><td></td></tr><tr><td> DGG-9140AD</td><td>SENXIN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador de vidrio eléctrico DY89-II</td><td>SCIENTZ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Balanza analítica electrónica</td><td>DENVER</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua electrotermostático DK-S12</td><td>SENXIN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agitador de decoloración horizontal</td><td>Kylin-Bell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Máquina de hielo AF 103</td><td>Scotsman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KQ-500E Limpiador ultrasónico</td><td>ShuMei</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agitador magnético</td><td>Zhi wei</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro Centrífuga Refrigerada H1650-W</td><td>Cence</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Horno de microondas</td><td>Galanz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q Referencia</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medidor de pH de escritorio</td><td>de</td> precisión Oscilador de vórtice sartorio <td></td><td></td></tr><tr><td>de tamaño pequeño</td> Sistema de electroforesis vertical <td>Kylin-Bell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Material consumible&nbsp; </fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 y micro; Tubo de PCR L (200 y micro; L)</td>Tubo de centrífuga <td>Axygene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(1,5 mL)</td>Tubo de centrífuga <td>Biosharp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(5 mL)</td>Tubo de centrífuga <td>Biosharp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(50 mL)</td><td></td>Tubo de centrífuga NEST <td></td><td></td></tr><tr><td>(7 mL)</td>Placa de cultivo <td>Biosharp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(60 mm)</td><td></td>Membrana de filtro NEST <td></td><td></td></tr><tr><td>(0,22 y micro; m)</td>Punta de pipeta <td>Millex GP</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Parafilm Bemis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(1 mL)</td> Punta de pipeta <td>KIRGEN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(10 &micro; L)</td> Punta de pipeta <td>Axygene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(200 y micro; L)</td>Papel indicador especial <td>Axygene</td><td></td><td></td></tr> Unidad de <tr><td>filtro ultracentrífugo TZAKZY</td><td></td> (15 mL 3 KDa)Unidad de filtro ultracentrífugo Millipore <td></td><td></td></tr><tr><td>(4 mL 3 KDa)</td><td>Reactivo</td> SSS indicador de pH universal Millipore <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

purificación por afinidad de una enzima fibrinolítica de sipunculus nudus

Affinity Purification of a Fibrinolytic Enzyme from Sipunculus nudus

La enzima fibrinolítica de Sipunculus nudus (sFE) es un nuevo agente fibrinolítico que puede activar el plasminógeno en plasmina y degradar la fibrina directamente, mostrando grandes ventajas sobre los agentes trombolíticos tradicionales. Sin embargo, debido a la falta de información estructural, todos los programas de purificación para sFE se basan en purificaciones por cromatografía de varios pasos, que son demasiado complicadas y costosas. Aquí, se desarrolla por primera vez un protocolo de purificación de afinidad de sFE basado en una estructura cristalina de sFE; incluye la preparación de la muestra cruda y la columna de cromatografía de afinidad de la matriz lisina/arginina-agarosa, la purificación de afinidad y la caracterización del sFE purificado. Siguiendo este protocolo, un lote de sFE se puede purificar en 1 día. Además, la pureza y la actividad del sFE purificado aumentan a 92% y 19,200 U/mL, respectivamente. Por lo tanto, este es un enfoque simple, económico y eficiente para la purificación de sFE. El desarrollo de este protocolo es de gran importancia para la utilización posterior de sFE y otros agentes similares.

Siguiendo este protocolo, se extrajeron lisados tisulares crudos, se construyeron columnas de cromatografía de afinidad de matriz de arginina-agarosa y matriz de lisina-agarosa, se obtuvo sFE purificado y se midió la pureza y actividad fibrinolítica del sFE purificado mediante placas SDS-PAGE y fibrina, respectivamente.
Después de la centrifugación, el sobrenadante recogido era un líquido viscoso de color canela transparente. La precipitación comenzó cuando este sobrenadante se mezcló con una ...

Aquí, presentamos un método de purificación de afinidad de una enzima fibrinolítica de Sipunculus nudus que es simple, económico y eficiente.

Purificación por afinidad de una enzima fibrinolítica de Sipunculus nudus

The fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus (sFE) is a novel fibrinolytic agent that can both activate plasminogen into plasmin and degrade fibrin ...

Nuestra investigación se centra principalmente en la purificación de la enzima fibrinolítica. Este trabajo trata de establecer un método simple de purificación para la enzima fibrinolítica. En este trabajo, reportamos un sistema de purificación de mejor afinidad de arginina o lisina de la enzima fibrinolítica por primera vez.En comparación con los métodos de purificación convencionales, este es un enfoque simple, económico y eficiente para la purificación de enzimas fibrinolíticas de Sipunculus nudus. El desarrollo de este protocolo es de mayor importancia para la utilización posterior de enzimas fibrinolíticas de Sipunculus nudus y otros agentes similares.

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Mamá es una única proteína magnetosomas asociados, que ha demostrado ser involucrados en la activación de magnetosomas. Aquí se presenta el protocolo de purificación de Mama supresión mutante (MamAΔ41)...

La purificación de la M. magneticum Tensión AMB-1 magnetosomas proteína asociada MamAΔ41

Tandem purificación de afinidad es un enfoque sólido para la identificación de socios de la unión a proteínas. Como prueba de concepto, esta metodología se aplicó a la traducción factor eIF4E bien caracterizado iniciación a co-precipitado los factores implicados en la célula huésped iniciación de la traducción. Este método se adapta fácilmente a cualquier proteína celular o viral.

Identificación de los socios interacción de proteínas en tándem de purificación de afinidad

Proteína de integrasa prototipo recombinante virus espumoso está a menudo contaminada con una nucleasa bacteriana durante la purificación. Este método identifica la contaminación nucleasa y lo quita de la preparación final de la enzima.

Detección y eliminación de nucleasa contaminación durante la purificación de prototipo recombinante Virus Espumoso integrasa

Este protocolo describe cómo extraer la proteína 1 que contiene el dominio fumarilacetato hidrolasa (FAHD1) del riñón porcino y el hígado de ratón. Los métodos enumerados pueden adaptarse a otras proteínas de interés y modificarse para otros tejidos.

Extracción y purificación de la proteína FAHD1 del riñón porcino y el hígado de ratón

Este artículo proporciona un procedimiento para la purificación por afinidad de una proteína recombinante humana, la endonucleasa flap 1 (FEN1), que ha sido marcada con una etiqueta de histidina 6X. El protocolo implica la utilización de dos columnas de iones metálicos inmovilizadas distintas para la purificación de la proteína marcada.

Purificación por afinidad de una proteína marcada con 6X His utilizando un sistema de cromatografía líquida rápida de proteínas 

Aquí, presentamos un protocolo de electroforesis en gel de fibrinógeno-poliacrilamida (PAGE) para separar y mostrar rápidamente los agentes fibrinogenolíticos de Sipunculus nudus.

Separación rápida y visualización de agentes fibrinogenolíticos activos en Sipunculus nudus mediante electroforesis en gel de fibrinógeno-poliacrilamida

Este artículo describe una metodología para sobreexpresar Nsp15 recombinante, una nucleasa tóxica, en un sistema de expresión C41 (DE3), seguida de la purificación de la proteína marcada utilizando cromatografía de afinidad y exclusión de tamaño. Estos protocolos se pueden adaptar para otras proteínas tóxicas desafiantes.

Sobreexpresión y purificación de una nucleasa tóxica de Escherichia coli

Se presenta un protocolo para la producción, purificación y uso de vesículas de membrana externa (OMV) empaquetadas en enzimas que proporcionan una mayor estabilidad enzimática para su implementación en diversas aplicaciones.

Dirigida Packaging de proteínas dentro de la membrana externa de vesículas de<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Diseño, Producción y Purificación

Aquí se describe protocolos para romper las células de mamíferos por molienda en estado sólido a una temperatura criogénica, producir un extracto celular a partir del polvo de células resultante, y aislar los complejos de proteínas de interés por captura de afinidad sobre perlas paramagnéticas a escala micrométrica de anticuerpos acoplados.

Complejo de proteínas de captura por afinidad a partir de células de mamífero Cryomilled

Describimos aquí un novedoso, robusto y eficiente método de purificación de afinidad en tándem (TAP) para la expresión, aislamiento y caracterización de complejos de proteínas de células eucariotas. Este protocolo podría utilizarse para la caracterización bioquímica de complejos discretos, así como para la identificación de nuevos interactores y modificaciones postraduccionales que regulen su función.

Tandem Affinity purificación de complejos de proteínas a partir de células eucariotas

Aprende a purificar enzimas fibrinolíticas de Sipunculus nudus mediante cromatografía de afinidad con arginina o lisina. Este método simple y eficiente mejora la obtención de enzimas para aplicaciones biotecnológicas.

Purificación por afinidad de una enzima fibrinolítica de Sipunculus nudus

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