Name: Fabricación de rejillas monocapa recubiertas de grafeno para criomicroscopía electrónica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Aprende a fabricar rejillas de microscopía electrónica recubiertas con grafeno monocapa para criomicroscopía. Este protocolo reduce el ruido de fondo y preserva muestras biológicas con alta resolución.

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Agradecemos al Dr. Xiao Fan por sus útiles discusiones al establecer estos métodos en Scripps Research. B.B. recibió el apoyo de una beca de investigación postdoctoral de la Fundación Hewitt para la Investigación Médica. W.C. cuenta con el apoyo de una beca predoctoral de la Fundación Nacional de Ciencias. D.E.P cuenta con el apoyo de la subvención de los Institutos Nacionales de Salud (NIH, por sus siglas en inglés) NS095892 a G.C.L. Este proyecto también contó con el apoyo de subvenciones de los NIH GM142196, GM143805 y S10OD032467 a G.C.L.

Recubrimiento de rejillas TEM con una monocapa de grafeno

<ol><li>Li, X., Zheng, S. Q., Egami, K., Agard, D. A., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+electron+dose+rate+on+electron+counting+images+recorded+with+the+K2+camera%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Influence of electron dose rate on electron counting images recorded with the K2 camera.</a> Journal of Structural Biology. 184 (2), 251-260 (2013).</li>
<li>Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMAN2%3A+An+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li>
<li>Zivanov, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+automated+high-resolution+cryo-EM+structure+determination+in+RELION-3%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3.</a> eLife. 7, 1-22 (2018).</li>
<li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CryoSPARC%3A+Algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li>
<li>Grigorieff, N., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-atomic+resolution+reconstructions+of+icosahedral+viruses+from+electron+cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Near-atomic resolution reconstructions of icosahedral viruses from electron cryo-microscopy.</a> Current Opinion in Structural Biology. 21 (2), 265-273 (2011).</li>
<li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+cryo-EM+at+atomic+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-particle cryo-EM at atomic resolution.</a> Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).</li>
<li>Zhang, K., Pintilie, G. D., Li, S., Schmid, M. F., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+individual+atoms+of+protein+complex+by+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Resolving individual atoms of protein complex by cryo-electron microscopy.</a> Cell Research. 30 (12), 1136-1139 (2020).</li>
<li>Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic-resolution+protein+structure+determination+by+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM.</a> Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).</li>
<li>Schultz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy of vitrified specimens.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 21 (2), 129-228 (1988).</li>
<li>Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L., Cook, B. D., Herzik, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+blot-and-plunge+freezing+of+biological+specimens+for+single-particle+cryogenic+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. 2022 (180), 1-16 (2022).</li>
<li>Glaeser, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteins%2C+interfaces%2C+and+cryo-em+grids%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Colloid+%26+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Proteins, interfaces, and cryo-em grids.</a> Current Opinion in Colloid & Interface Science. 25 (3), 289-313 (2016).</li>
<li>Glaeser, R. M., Han, B. -G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opinion%3A+hazards+faced+by+macromolecules+when+confined+to+thin+aqueous+films%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysics+Reports%22%5BJournal%5D)">Opinion: hazards faced by macromolecules when confined to thin aqueous films.</a> Biophysics Reports. 3 (1-3), 1-7 (2017).</li>
<li>Han, B. G., Watson, Z., Cate, J. H. D., Glaeser, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer-crystal+streptavidin+support+films+provide+an+internal+standard+of+cryo-EM+image+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Monolayer-crystal streptavidin support films provide an internal standard of cryo-EM image quality.</a> Journal of Structural Biology. 200 (3), 307-313 (2017).</li>
<li>Noble, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+single+particle+CryoEM+sample+and+grid+characterization+by+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography.</a> eLife. 7, 1-42 (2018).</li>
<li>Drulyte, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+to+altering+particle+distributions+in+cryo-electron+microscopy+sample+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74 (6), 560-571 (2018).</li>
<li>Liu, N., Wang, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Better+cryo-EM+specimen+preparation%3A+how+to+deal+with+the+air-water+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Better cryo-EM specimen preparation: how to deal with the air-water interface.</a> Journal of Molecular Biology. 435 (9), 167926(2022).</li>
<li>Noble, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+effects+of+particle+adsorption+to+the+air-water+interface+in+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM.</a> Nature Methods. 15 (10), 793-795 (2018).</li>
<li>Palovcak, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+robust+procedure+for+preparing+graphene-oxide+cryo-EM+grids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">A simple and robust procedure for preparing graphene-oxide cryo-EM grids.</a> Journal of Structural Biology. 204 (1), 80-84 (2018).</li>
<li>Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+graphene+oxide+coating+improves+cryo-EM+sample+preparation+and+data+collection+from+tilted+grids%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Marr, C. R., Benlekbir, S., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+carbon+films+with+%7E500nm+holes+for+cryo-EM+with+a+direct+detector+device%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Fabrication of carbon films with ~500nm holes for cryo-EM with a direct detector device.</a> Journal of Structural Biology. 185 (1), 42-47 (2014).</li>
<li>Pantelic, R. S., Meyer, J. C., Kaiser, U., Baumeister, W., Plitzko, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graphene+oxide%3A+A+substrate+for+optimizing+preparations+of+frozen-hydrated+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples.</a> Journal of Structural Biology. 170 (1), 152-156 (2010).</li>
<li>Pantelic, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graphene%3A+substrate+preparation+and+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Graphene: substrate preparation and introduction.</a> Journal of Structural Biology. 174 (1), 234-238 (2011).</li>
<li>Russo, C. J., Passmore, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+towards+an+optimal+specimen+support+for+electron+cryomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Progress towards an optimal specimen support for electron cryomicroscopy.</a> Current Opinion in Structural Biology. 37, 81-89 (2016).</li>
<li>Passmore, L. A., Russo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specimen+preparation+for+high-resolution+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Specimen preparation for high-resolution cryo-EM.</a> Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).</li>
<li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-yield+monolayer+graphene+grids+for+near-atomic+resolution+cryoelectron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">High-yield monolayer graphene grids for near-atomic resolution cryoelectron microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (2), 1009-1014 (2020).</li>
<li>Zheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+ultraclean+atomically+thin+membranes+for+atomic-resolution+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Robust ultraclean atomically thin membranes for atomic-resolution electron microscopy.</a> Nature Communications. 11 (1), 541(2020).</li>
<li>Ahn, E., Kim, B., Cho, U. -S. Batch production of high-quality graphene grids for cryo-EM: cryo-EM structure of Methylococcus capsulatus soluble methane monooxygenase hydroxylase. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAhn%2C+E+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. (Cvd), (2021).</li>
<li>Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+graphene+supports+for+electron+cryomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (24), 11718-11724 (2019).</li>
<li>Fan, H., Sun, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+graphene+grids+for+cryoelectron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Developing graphene grids for cryoelectron microscopy.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 937253(2022).</li>
<li>D'Imprima, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+denaturation+at+the+air-water+interface+and+how+to+prevent+it%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it.</a> eLife. 8, e42747(2019).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+copper+step+beams+during+graphene+growth+by+CVD+method%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Surface+Science%22%5BJournal%5D)">Evolution of copper step beams during graphene growth by CVD method.</a> Applied Surface Science. 610, 155518(2023).</li>
<li>Zheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uniform+thin+ice+on+ultraflat+graphene+for+high-resolution+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Uniform thin ice on ultraflat graphene for high-resolution cryo-EM.</a> Nature Methods. 20 (1), 123-130 (2023).</li>
<li>Fujita, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epoxidized+graphene+grid+for+highly+efficient+high-resolution+cryoEM+structural+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Epoxidized graphene grid for highly efficient high-resolution cryoEM structural analysis.</a> Scientific Reports. 13, 2279(2023).</li>
<li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionalized+graphene+grids+with+various+charges+for+single-particle+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Functionalized graphene grids with various charges for single-particle cryo-EM.</a> Nature Communications. 13, 6718(2022).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

La conservación de muestras biológicas en una fina capa de hielo vítreo es un paso de importancia crítica para la determinación de la estructura crioEM de alta resolución. Sin embargo, los investigadores a menudo se encuentran con problemas derivados de las interacciones con el AWI, que introduce la orientación preferida, el desmontaje complejo, la desnaturalización y la agregación. Además, las muestras no siempre pueden concentrarse lo suficiente como para poblar el hielo delgado suspendido a través de los agujeros de una película fenestrada. Varios grupos de investigación han desarrollado métodos para recubrir las rejillas EM con una monocapa de grafeno para ayudar a superar algunas de estas limitaciones 24,25,26,27,28,29,30, y las rejillas de grafeno se han utilizado con gran éxito. Aquí, proporcionamos instrucciones paso a paso para preparar de manera efectiva lotes de rejillas de grafeno internamente y examinar la calidad de las rejillas de grafeno por TEM. Hacemos hincapié en que se debe tener especial cuidado durante algunos de los pasos críticos, que describimos a continuación.
El grafeno tiene una fuerte tendencia a atraer contaminantes en el aire. Por lo tanto, durante el proceso de fabricación de la rejilla de grafeno, es importante asegurarse de que todas las herramientas que entran en contacto con la lámina de grafeno/Cu o las rejillas estén limpias y libres de polvo. Los cubreobjetos de vidrio utilizados para transferir grafeno se pueden limpiar enjuagándolos con etanol y agua desionizada o usando un plumero de aire. También se recomienda trabajar bajo una campana extractora y mantener las láminas y rejillas de grafeno cubiertas con papel de aluminio o una placa de vidrio limpia en todo momento. El polvo o los contaminantes en las rejillas pueden impedir que el grafeno se adhiera completamente a las rejillas EM. Cuando se manipulan rejillas de grafeno o recubiertas de grafeno, es importante estar conectado a tierra eléctricamente para evitar daños a la película de grafeno por descarga estática. La descarga estática puede evitarse utilizando una correa de conexión a tierra para la muñeca, tocando un objeto metálico conectado a tierra cada vez que se manipulan grafeno o rejillas de grafeno y/o no usando un guante en la mano que sostiene las pinzas24.
Dado que una monocapa de grafeno es muy delgada (del ancho de un átomo de carbono), es importante apoyar el grafeno con una capa orgánica como MMA o poli-MMA (PMMA) durante la transferencia de grafeno a las rejillas. El PMMA es el material más utilizado para la transferencia de grafeno. Sin embargo, el PMMA tiene una fuerte afinidad con el grafeno y, a menudo, puede provocar la contaminación del polímero en la película de grafeno. En este protocolo se utiliza MMA, ya que deja menos contaminación residual25. Sin embargo, tanto el PMMA como el MMA tienen la desventaja de formar arrugas y grietas que se pueden observar en algunas áreas de la película de grafeno (Figura 3B). Puede ser un desafío evitar estas arrugas, ya que ocurren comúnmente durante el crecimiento del grafeno por el método CVD31. Recientemente se ha desarrollado un método para cultivar grafeno ultraplano sin arrugas, en el que la lámina de cobre se sustituye por una oblea de Cu(111)/zafiro como sustrato de crecimiento32.
Según nuestra experiencia, es mejor comprar láminas de grafeno/Cu y respaldar el grafeno con MMA internamente que comprar láminas de Cu-grafeno cubiertas de polímero de los fabricantes, que se vuelven quebradizas después del grabado de cobre y son difíciles de manejar en los pasos posteriores. El barnizador giratorio que utilizamos para el recubrimiento de MMA se puede construir de forma económica utilizando piezas de una tienda local de computadoras/hardware, como se describió anteriormente25.
Durante el paso del recubrimiento de MMA, es importante cubrir la totalidad de la superficie de grafeno en la lámina de Cu-grafeno con MMA. Después de que el Cu haya sido grabado, el grafeno MMA se volverá semitransparente, y las áreas que carecen de cobertura MMA se verán como agujeros vacíos. Para evitar el recubrimiento de MMA en el lado de cobre, es importante colocar un pequeño trozo de papel secante debajo de él durante el recubrimiento para que absorba cualquier exceso de MMA que salga de la película CVD.
Después del grabado y el enjuague, la lámina de MMA/grafeno está lista para ser transferida a las rejillas EM mediante el uso de un sistema de canal comercial o casero con una jeringa o bomba peristáltica para controlar el nivel del agua. Antes del paso de transferencia, es importante enjuagar bien las rejillas en baños sucesivos de cloroformo, acetona e IPA. Hornear rejillas recubiertas de grafeno a 65 °C ayuda a preservar la integridad del grafeno y promueve la adsorción de grafeno a las rejillas. Por último, para evitar la contaminación por MMA en las rejillas, es importante eliminar completamente la MMA en un baño de acetona y limpiar las rejillas en IPA. Cualquier residuo de MMA sin lavar se observará en las rejillas EM y disminuirá la relación señal-ruido de las imágenes (Figura 3C). El proceso de lavado con acetona-IPA se puede repetir para limpiar aún más las superficies de grafeno.
Para hacer que las cuadrículas de grafeno sean hidrófilas, expusimos las cuadrículas a UV/Ozono. Los diferentes modelos de limpiadores UV/ozono pueden requerir optimización para oxigenar suficientemente la capa de grafeno para la preparación de muestras crioEM sin dañar el grafeno. Independientemente del sistema, es fundamental utilizar estas rejillas para la aplicación de muestras crioEM inmediatamente después del tratamiento UV/Ozono. En otros estudios se describen métodos alternativos para hacer hidrofílicas las mallas de grafeno33,34.

La microscopía electrónica criogénica de una sola partícula (crioEM) es una tecnología cada vez más aplicable que se utiliza para investigar las estructuras 3D de las biomacromoléculas. Los avances tecnológicos en la óptica del microscopio electrónico, la detección directa de electrones1 y los algoritmos informáticos 2,3,4 durante la última década han permitido a los usuarios de crioEM determinar las estructuras de complejos macromoleculares bioquímicamente estables con una resolución casi atómica 5,6,7,8 . A pesar de estos avances, siguen existiendo barreras notables para la preservación de muestras para la obtención de imágenes crioEM, que impiden que la mayoría de las muestras biológicas se resuelvan a resoluciones tan altas.
La preparación de muestras para el análisis crioEM de alta resolución implica atrapar macromoléculas que se distribuyen uniformemente en una amplia gama de orientaciones dentro de una fina capa de hielo vitrificado. Los métodos de congelación "blot and plunge" son los métodos más utilizados para generar películas delgadas de muestras biológicas en cuadrículas para estudios de crioEM 9,10. Estos métodos consisten en aplicar unos pocos microlitros de solución de muestra a una rejilla EM que contiene una película fenestrada que se ha hecho hidrófila y, posteriormente, borrar la mayor parte de la muestra con papel de filtro antes de sumergir rápidamente la rejilla en un criógeno de etano líquido o mezcla de etano y propano9.
Si bien este método se ha utilizado con éxito para determinar las estructuras de una amplia gama de especímenes biológicos, todos los métodos de preparación de especímenes crioEM comúnmente utilizados exponen los especímenes a la interfaz hidrofóbica aire-agua (AWI), que a menudo presenta problemas que limitan la determinación de estructuras de alta resolución. Se ha establecido que los especímenes biológicos tienen una alta propensión a la desnaturalización cuando se exponen al AWI, lo que puede conducir a una agregación y desensamblaje complejos11,12,13,14. Además, los parches hidrofóbicos en las superficies de los especímenes biológicos hacen que las partículas adopten las orientaciones preferidas en el hielo12. En muchos escenarios, una sola región hidrofóbica de la muestra obliga a todas las partículas a adoptar una orientación singular en el hielo, aboliendo así la capacidad de generar una reconstrucción fiable. Además de los problemas con el AWI, los especímenes pueden demostrar una afinidad por la superficie de la capa de película fenestrada, lo que limita el número de partículas suspendidas en el hielo dentro de los agujeros15.
Se han desarrollado varias soluciones metodológicas y tecnológicas para disminuir estos problemas que surgen de las interacciones con el AWI o las películas16,17. Un enfoque popular es recubrir la película fenestrada de las rejillas EM con una capa delgada (decenas de nanómetros) de carbono amorfo. Este recubrimiento proporciona una superficie continua a través de los orificios a la que las partículas pueden adsorberse, con el beneficio de proteger parcialmente la muestra de las interacciones con el AWI15,18,19,20. Sin embargo, la capa adicional de carbono eleva la cantidad de señal de fondo en las regiones fotografiadas, introduciendo ruido que puede comprometer la resolución alcanzable, particularmente para muestras pequeñas (<150 kDa). En los últimos años, se ha demostrado que el uso de escamas de óxido de grafeno (GO) para producir películas de soporte en rejillas crioEM tiene ventajas sobre el carbono amorfo tradicional. Las escamas de GO se producen a través de la oxidación de las capas de grafito, lo que da como resultado láminas pseudocristalinas de grafito monocapa que son hidrófilas debido a su contenido sustancial de oxígeno en forma de grupos carboxilo, hidroxilo y epoxi en las superficies y bordes. Las escamas comerciales de GO en suspensiones acuosas son baratas, y existen numerosos métodos publicados para aplicar escamas de GO a las rejillas EM18,21. Sin embargo, estos métodos a menudo dan como resultado cuadrículas que solo están parcialmente cubiertas con copos de GO, así como regiones que contienen varias capas de copos de GO. Además, las escamas de GO contribuyen con una señal de fondo notable a las imágenes crioEM que es cercana a la observada con el carbono amorfo delgado22,23.
El grafeno monocapa prístino, que consiste en una sola matriz cristalina 2D de átomos de carbono, se distingue del GO en que no produce contraste de fase en el microscopio electrónico. Por lo tanto, el grafeno monocapa se puede utilizar para generar una capa de soporte invisible para obtener imágenes de muestras biológicas. El grafeno monocapa también es más fuerte que el GO y se puede aplicar como una sola monocapa en una rejilla EM, y los avances recientes en la fabricación de rejillas EM recubiertas de grafeno han hecho posible preparar rejillas de grafeno monocapa de alta cobertura internamente 24,25,26,27,28,29,30 . Sin embargo, a pesar de los beneficios del uso de rejillas recubiertas de grafeno para la determinación de la estructura crioEM, no se utilizan ampliamente debido al costo prohibitivo de las opciones comerciales y la complejidad de la producción interna. Aquí, describimos una guía paso a paso para producir de manera efectiva rejillas EM cubiertas con una monocapa de grafeno para la determinación de la estructura crioEM de muestras biológicas (Figura 1). Siguiendo este protocolo detallado, los investigadores de cryoEM pueden preparar de forma reproducible docenas de rejillas de soporte de grafeno de alta calidad en un solo día. La calidad de las rejillas recubiertas de grafeno se puede examinar fácilmente utilizando un microscopio electrónico de transmisión (TEM) de gama baja equipado con un filamento LaB6.

<table><tbody><tr><td>70% EtOH</td><td>Pharmco (190 pf EtOH)</td><td>241000190CSGL</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Sigma Aldrich</td><td>650501-4L</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amonio (APS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>215589-500g</td><td>Peligroso; tenga mucho cuidado</td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2432-1L</td><td></td></tr><tr><td>Abrazadera TEM Bloque de soporte de rejilla para 45 rejillas</td><td>PELCO</td><td>16830-45</td><td></td></tr><tr><td>Ventilador de ordenador</td><td>Amazon (Noctua)</td><td>B07CG2PGY6</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>Bellco Glass</td><td>1203J71</td><td>Cubreobjetos estándar</td></tr><tr><td>Plato de cristalización</td><td>Pyrex</td><td>3140-100</td><td></td></tr><tr><td>Plumero electrónico</td><td>Falcon Safety Products</td><td>75-37-6</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Dust-off Air Duster</td><td>Staples</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Papeles de filtro</td><td>Whatman</td><td>1001-055</td><td></td></tr><tr><td>Pinza de punta fina</td><td>Dumont</td><td>0508-L4-PO</td><td></td></tr><tr><td>Matraz</td><td>Pyrex</td><td>4980-500</td><td></td></tr><tr><td>Tenedor</td><td>Supermercado</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta pasteur de vidrio</td><td>VWR</td><td>14672-608</td><td></td></tr><tr><td>Grafeno/Cu</td><td>Graphenea N</td><td>/A</td><td>CVD Grafeno monocapa Cu</td></tr><tr><td>Comedero</td> <td>de recubrimiento de rejillaLadd Research Industries</td><td>10840</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td> frágil <td>Fisher Scientific</td><td>67-63-0</td><td></td></tr><tr><td>Cinta Kapton Amazon</td><td>(MYJOR)</td><td>MY-RZY001</td><td>Cinta de poliimida</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>Long twzeer</td><td>Cole Parmer Essentials</td><td>UX-07387-15</td><td></td></tr><tr><td>Soporte de rejilla metálica</td><td>Ted Pella</td><td>16820-81</td><td></td></tr><tr><td>MMA (8.5) MMA EL 6</td><td>KAYAKU Materiales avanzados</td><td>M31006 0500L 1GL</td><td>Inflamable</td></tr><tr><td>Modelo 10 Horno de laboratorio</td><td>Quincy Lab, Inc.</td><td></td><td></td>FO19013</tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Pyrex</td><td>3610-102</td><td></td></tr><tr><td>Limpiador de plasma (Solarus 950)</td><td>Gatan, Inc.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras</td><td>Fiskars</td><td>194813-1010</td><td></td></tr><tr><td>Agitador orbital analógico estándar</td><td>VWR</td><td>89032-088</td><td></td></tr><tr><td>UltrAuFoil R1.2/1.3 - Au300</td><td>Quantifoil</td><td>N/A</td><td>Rejillas de oro Holey</td></tr><tr><td>Sistemas de limpieza con ozono ultravioleta</td><td>UVOCS</td><td>modelo T10X10/OES</td><td></td></tr></tbody></table>

fabricación de rejillas monocapa recubiertas de grafeno para criomicroscopía electrónica

Fabrication of Monolayer Graphene-Coated Grids for Cryoelectron Microscopy

La microscopía electrónica criogénica (crioEM) se ha convertido en una técnica poderosa para sondear la estructura atómica de los complejos macromoleculares. La preparación de muestras para crioEM requiere la conservación de las muestras en una capa delgada de hielo vítreo, generalmente suspendida dentro de los orificios de una película de soporte fenestrada. Sin embargo, todos los enfoques de preparación de muestras comúnmente utilizados para los estudios de crioEM exponen la muestra a la interfaz aire-agua, lo que introduce un fuerte efecto hidrofóbico en la muestra que a menudo resulta en desnaturalización, agregación y disociación compleja. Además, las interacciones hidrofóbicas preferidas entre las regiones de la muestra y la interfaz aire-agua afectan a las orientaciones adoptadas por las macromoléculas, lo que da lugar a reconstrucciones 3D con resolución direccional anisotrópica. 
Se ha demostrado que la adsorción de muestras crioEM a una monocapa de grafeno ayuda a mitigar las interacciones con la interfaz aire-agua, al tiempo que minimiza la introducción de ruido de fondo. Los soportes de grafeno también ofrecen la ventaja de reducir sustancialmente la concentración requerida de proteínas requeridas para la obtención de imágenes crioEM. A pesar de las ventajas de estos soportes, las rejillas recubiertas de grafeno no son ampliamente utilizadas por la comunidad crioEM debido al costo prohibitivo de las opciones comerciales y los desafíos asociados con la producción interna a gran escala. Este artículo describe un método eficiente para preparar lotes de rejillas crioEM que tienen una cobertura casi total de grafeno monocapa.

La ejecución exitosa del protocolo de fabricación de rejillas de grafeno descrito aquí dará como resultado rejillas EM que están completamente recubiertas con una sola monocapa de grafeno. La cobertura de grafeno de las rejillas se puede comprobar utilizando cualquier TEM. Dado que una monocapa de grafeno limpio es casi invisible en el TEM, se debe examinar utilizando el modo de difracción del microscopio y observar los puntos de Bragg correspondientes a la organización hexagonal de los átomos de carbono que componen el grafeno (Figura 3A). Es normal observar ocasionalmente algunas arrugas de grafeno monocapa, que se introducen durante el recubrimiento de MMA (Figura 3B). También se puede comprobar el nivel de contaminación presente en el grafeno adquiriendo una imagen de gran aumento en el centro de uno de los agujeros cubiertos de grafeno (Figura 3C). Si se adquiere con un detector de alta resolución, una transformada de Fourier de esta imagen debería contener manchas de Bragg correspondientes al espaciamiento carbono-carbono a 2,14 Å (Figura 4C). Una monocapa de átomos de carbono no produce suficiente dispersión de electrones para generar contraste de fase y, por lo tanto, una imagen de grafeno limpio no presentará anillos de Thon asociados con la función de transferencia de contraste en una transformada de Fourier de la imagen. Sin embargo, es muy difícil prevenir la contaminación de las rejillas de grafeno después de su producción, y el lavado insuficiente de las rejillas EM o la eliminación de MMA después del recubrimiento de grafeno darán como resultado contaminantes notables en las rejillas que son visibles en las imágenes del espacio real (Figura 3C). Como se muestra en la Figura 4, las rejillas de grafeno tienen un efecto concentrador en una muestra, como se observa cuando se comparan 0,5 mg/mL de apoferritina aplicada a rejillas de oro agujereadas con (Figura 4A) y sin el soporte de grafeno (Figura 4B). Previamente se han descrito protocolos similares de fabricación de grafeno para resolver estructuras crioEM de proteínas como la apoferritina a alta resolución25,27.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65702/65702fig01.jpg"> Figura 1: Esquema para la preparación de rejillas crioEM recubiertas de grafeno. Se ilustran los pasos clave en el proceso de fabricación de rejillas de grafeno. Abreviaturas: cryoEM = microscopía electrónica criogénica; MMA = metacrilato de metilo; APS = persulfato de amonio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65702/65702fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65702/65702fig02.jpg"> Figura 2: Materiales necesarios para la fabricación de rejillas de grafeno . (A) Los materiales necesarios para recubrir las rejillas crio-EM se etiquetan en consecuencia. (B) Vista de primer plano de la recubridora con una lámina de grafeno/Cu pegada con cinta adhesiva en un papel secante en un portaobjetos de vidrio. La máquina de recubrimiento giratorio se puede ensamblar comprando piezas en una tienda local de computadoras/hardware. (C) Vista de cerca del canal de recubrimiento de rejilla conectado a una jeringa que se puede usar para controlar el nivel del agua. Las cuadrículas se colocan encima de un papel secante sobre una malla de acero inoxidable. El papel secante ayuda a maniobrar la ubicación de las cuadrículas para que la hoja de grafeno pueda coincidir con ella. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65702/65702fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65702/65702fig03.jpg"> Figura 3: Una imagen representativa del patrón de difracción e imágenes de campo claro de una cuadrícula de grafeno que muestra arrugas o contaminación por MMA . (A) Las rejillas EM cubiertas con una monocapa de grafeno mostrarán picos de Bragg correspondientes a la red hexagonal del grafeno cuando se visualicen en un TEM en modo de difracción. El pico de Bragg correspondiente al espaciado carbono-carbono de 2,14 Å está encerrado en un círculo y se indica con una flecha. (B) Una imagen de campo claro de una cuadrícula de grafeno monocapa con algunas arrugas (marcadas con una flecha) en la monocapa de grafeno. (C) Una imagen de campo claro de grafeno monocapa con contaminación por MMA (indicada con una flecha). Barras de escala = 100 nm (B,C). Abreviaturas: EM = microscopía electrónica; MMA = metacrilato de metilo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65702/65702fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65702/65702fig04.jpg"> Figura 4: Apoferritina en rejillas de oro cubiertas de grafeno: (A) Micrografía crioEM de 0,5 mg/ml de apoferritina en rejillas de oro recubiertas de grafeno. (B) La apoferritina obtenida a la misma concentración es visible a una concentración sustancialmente más baja cuando se prepara utilizando rejillas de oro agujereadas sin grafeno. (C) FFT de la micrografía crioEM de 0,5 mg/mL de apoferritina en rejillas de oro recubiertas de grafeno, con los picos de Bragg correspondientes a la red hexagonal de grafeno denotada. Barras de escala = 100 nm (A,B). Abreviaturas: cryoEM = microscopía electrónica criogénica; FFT = transformada rápida de Fourier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65702/65702fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Aquí, describimos un protocolo para aplicar una sola monocapa de grafeno a rejillas de microscopía electrónica y cómo prepararlas para su uso en la determinación de la estructura crioEM.

Fabricación de rejillas monocapa recubiertas de grafeno para criomicroscopía electrónica

Cryogenic electron microscopy (cryoEM) has emerged as a powerful technique for probing the atomic structure of macromolecular complexes. Sample ...

En la actualidad, la conservación óptima de las muestras biológicas es un reto importante en la obtención de estructuras CryoEM de alta resolución. Durante el proceso de preparación de la muestra, las muestras se exponen a la interfaz hidrofóbica aire-agua, que tiene efectos desnaturalizantes en las muestras y puede hacer que las muestras estables adopten una orientación preferencial en el hielo, lo que impide la determinación de la estructura de alta resolución. El recubrimiento de las rejillas CryoEM con una fina capa de carbono similar al óxido de grafeno blando se ha utilizado comúnmente para abordar problemas relacionados con las interacciones con la interfaz aire-agua.Sin embargo, estas capas a menudo aumentan el ruido de fondo en nuestras imágenes, lo que compromete las resoluciones de nuestra estructura. El recubrimiento de la rejilla con una monocapa de grafeno logra una protección similar sin introducir un ruido de fondo significativo. El uso de rejillas CryoEM recubiertas de grafeno puede ayudar a superar los problemas relacionados con las interacciones con la interfaz aire-agua, sin embargo, las rejillas de grafeno comerciales son costosas y muchos laboratorios consideran que las rejillas de grafeno son demasiado complicadas de preparar internamente.Los investigadores en el campo de CryoEM ahora pueden usar este protocolo paso a paso para reproducir docenas de grafenos de alta calidad completamente producidos en un día.

fabrication-monolayer-graphene-coated-grids-for-cryoelectron

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

La aplicación de capas de soporte a rejillas de microscopía electrónica criogénica (crioEM) puede aumentar la densidad de partículas, limitar las interacciones con la interfaz aire-agua, reducir el movimiento inducido por el haz y mejorar la distribución de las orientaciones de las partículas. Este artículo describe un protocolo robusto para recubrir rejillas crioEM con una monocapa de grafeno para mejorar la preparación de muestras criogénicas.

Aplicación de grafeno monocapa a rejillas de criomicroscopía electrónica para la determinación de estructuras de alta resolución

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En Vivo Tracking 4-Dimensional de madre hematopoyéticas y células progenitoras en ratones adultos de calota de Médula Ósea

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Tandem congelación de alta presión y la rápida congelación de sustitución de tejidos vegetales para Microscopía Electrónica de Transmisión

Aquí presentamos un protocolo para la combinación de dos técnicas de procesamiento de muestra, alta presión de congelación y procesamiento de las muestras asistida por microondas, seguido por la resina mínima inclusión para la adquisición de datos con un ion enfocado viga microscopio electrónico (FIB-SEM). Así lo demuestran con una muestra de nervio tibial de ratón y elegans de Caenorhabditis.

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Aquí, describimos la preparación de monocapas epiteliales intestinales derivadas de organoides humanos para estudiar la función de barrera intestinal, la permeabilidad y el transporte. Como los organoides representan la respuesta original del tejido epitelial a los estímulos externos, estos modelos combinan las ventajas de la capacidad de expansión de las líneas celulares y la relevancia y complejidad del tejido primario.

Monocapa epitelial derivada de organoides: un modelo in vitro clínicamente relevante para la función de barrera intestinal

El protocolo presentado aquí describe el uso de Spotiton, un novedoso sistema robótico, para entregar dos muestras de interés en una rejilla de nanocables auto-absorbentes que se mezclan durante un mínimo de 90 ms antes de la vitrificación en criógeno líquido.

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La creciente demanda de recopilación de datos a gran escala en la tomografía electrónica criogénica requiere rutinas de adquisición de imágenes de alto rendimiento. Aquí se describe un protocolo que implementa los desarrollos recientes de estrategias de adquisición avanzadas destinadas a maximizar la eficiencia del tiempo y el rendimiento de la recopilación de datos tomográficos.

Estrategias para la optimización de la adquisición de datos de tomografía electrónica criogénica

Aprende a fabricar rejillas de microscopía electrónica recubiertas con grafeno monocapa para criomicroscopía. Este protocolo reduce el ruido de fondo y preserva muestras biológicas con alta resolución.

Fabricación de rejillas monocapa recubiertas de grafeno para criomicroscopía electrónica

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