Fabricación de rejillas monocapa recubiertas de grafeno para criomicroscopía electrónica
8 de septiembre de 2023
Aquí, describimos un protocolo para aplicar una sola monocapa de grafeno a rejillas de microscopía electrónica y cómo prepararlas para su uso en la determinación de la estructura crioEM.
En la actualidad, la conservación óptima de las muestras biológicas es un reto importante en la obtención de estructuras CryoEM de alta resolución. Durante el proceso de preparación de la muestra, las muestras se exponen a la interfaz hidrofóbica aire-agua, que tiene efectos desnaturalizantes en las muestras y puede hacer que las muestras estables adopten una orientación preferencial en el hielo, lo que impide la determinación de la estructura de alta resolución. El recubrimiento de las rejillas CryoEM con una fina capa de carbono similar al óxido de grafeno blando se ha utilizado comúnmente para abordar problemas relacionados con las interacciones con la interfaz aire-agua.
Sin embargo, estas capas a menudo aumentan el ruido de fondo en nuestras imágenes, lo que compromete las resoluciones de nuestra estructura. El recubrimiento de la rejilla con una monocapa de grafeno logra una protección similar sin introducir un ruido de fondo significativo. El uso de rejillas CryoEM recubiertas de grafeno puede ayudar a superar los problemas relacionados con las interacciones con la interfaz aire-agua, sin embargo, las rejillas de grafeno comerciales son costosas y muchos laboratorios consideran que las rejillas de grafeno son demasiado complicadas de preparar internamente.
Los investigadores en el campo de CryoEM ahora pueden usar este protocolo paso a paso para reproducir docenas de grafenos de alta calidad completamente producidos en un día.
Descripción general
Este estudio aborda el desafío de preservar de manera óptima muestras biológicas para microscopía electrónica criogénica (cryo-EM) de alta resolución. Los autores presentan un protocolo para recubrir rejillas de microscopía electrónica con una única monocapa de grafeno con el fin de minimizar el ruido de fondo y mejorar la integridad de la muestra durante la obtención de imágenes.
Componentes Principales del Estudio
Área de Investigación
- Microscopía electrónica criogénica
- Conservación de muestras en imágenes biológicas
- Aplicaciones del grafeno en microscopía
Antecedentes
- La preservación de muestras biológicas es crucial para obtener estructuras de alta resolución mediante microscopía crioelectrónica.
- Los recubrimientos tradicionales de carbono pueden aumentar el ruido de fondo en la imagen.
- El grafeno proporciona una capa protectora sin comprometer la calidad de la imagen.
Métodos Utilizados
- Aplicación de una monocapa de grafeno a rejillas de microscopía electrónica
- Técnicas de imagenología criomicroscópica de transmisión
- Uso de centrifugadoras caseras y diversos agentes de limpieza
Resultados Principales
- Las rejillas recubiertas con grafeno muestran un ruido de fondo reducido en la imagen.
- El método permite la producción masiva de grafeno de alta calidad en un solo día.
- Las rejillas de ME demuestran una preservación y concentración efectivas de muestras biológicas.
Conclusiones
- El protocolo proporciona un enfoque sencillo para que los laboratorios produzcan rejillas de ME recubiertas con grafeno.
- Este avance aumenta el potencial de obtener imágenes mejoradas por ME criogénica en la investigación biológica.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La criomicroscopía electrónica de alta resolución es fundamental para la biología estructural y el descubrimiento de fármacos, pero la desnaturalización de la muestra y el sesgo de orientación en la interfase aire-agua limitan la calidad y el rendimiento de los datos. Las rejillas recubiertas con monocapa de grafeno abordan estos cuellos de botella al preservar la integridad de las macromoléculas y reducir el ruido de fondo, impactando directamente en el descubrimiento temprano y la validación de dianas. La fabricación interna escalable de rejillas de grafeno posibilita una adopción más amplia, apoyando estudios estructurales en toda la cartera y acelerando la desviación mecanicista de riesgos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la interrogación estructural de alta fidelidad de complejos macromoleculares para la validación de objetivos.
- Reduce la desnaturalización y la agregación, favoreciendo la reducción de riesgos mecanicistas en las fases iniciales del descubrimiento.
- Mejora la diversidad de orientación, aumentando la confianza predictiva en los modelos estructurales.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Facilita la preparación de rejillas de microscopía crioelectrónica reproducibles y de bajo fondo para el cribado posterior.
- Apoya la obtención de imágenes cuantitativas al minimizar el ruido y los artefactos de concentración.
- Permite una evaluación confiable de complejos proteicos a concentraciones de muestra más bajas.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Mejora la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al facilitar la generación de datos estructurales robustos.
- Se alinea con el desarrollo de biomarcadores traslacionales mediante una resolución estructural mejorada.
- Reduce el riesgo de fracasos en fases avanzadas debido a datos estructurales ambiguos o comprometidos.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Las rejillas recubiertas con grafeno en monocapa se integran en el flujo de trabajo de microscopía crioelectrónica desde el descubrimiento inicial hasta la identificación de compuestos prometedores y la investigación preclínica, apoyando estudios estructurales basados en hipótesis y permitiendo imágenes reproducibles y de alta calidad.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al preservar las conformaciones nativas de macromoléculas.
- Cribado: Proporciona cuadrículas estandarizadas y reproducibles para ensayos cuantitativos de criomicroscopía electrónica.
- Análisis: Ofrece imágenes de alta resolución y bajo ruido para análisis comparativos robustos.
- Investigación Traducional: Mejora la continuidad preclínica al permitir la caracterización estructural fiable de candidatos terapéuticos.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma escalable y rentable para estudios estructurales repetidos en diversos programas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en biología estructural.
- Valor operativo: Estandariza la preparación de rejillas, mejora la reproducibilidad y permite la escalabilidad por lotes.
- Valor estratégico: Acelera las decisiones de avance o interrupción y reduce el riesgo biológico en fases avanzadas mediante datos de mayor calidad.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización y el avance ajustados al riesgo de objetivos validados estructuralmente.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de rejillas de criomicroscopía electrónica y manipulación de grafeno.
- Necesita acceso a centrifugadoras de recubrimiento, campanas extractoras y la infraestructura estándar para la preparación de rejillas de microscopía electrónica.
- Exige estandarización entre equipos para obtener calidad reproducible de las rejillas y resultados de imágenes.
- Puede ser necesaria una adaptación para diferentes clases de proteínas o tipos de muestras.
- Las limitaciones potenciales incluyen la sensibilidad en el manejo y la formación inicial para los pasos de transferencia de grafeno.
