Name: Análisis inmunohistoquímico multiplex del paisaje espacial de células inmunitarias del microambiente tumoral (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-18T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Aprende a caracterizar células inmunes en el microambiente tumoral mediante inmunohistoquímica multiplex. Este método permite visualizar múltiples marcadores simultáneamente para comprender la respuesta inmunitaria.

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El PhenoImager HT fue adquirido a través de fondos proporcionados por el Centro Médico de la Universidad de Radboud y el Centro de Tecnología de Microscopía de Radboud. La FQ cuenta con el apoyo financiero de una subvención de la Sociedad Holandesa contra el Cáncer (10673) y una subvención ARTimmune (834618) del Consejo Europeo de Defensa. JT cuenta con el apoyo financiero de una subvención de NMO VIDI (VI.Vidi.192.084). Los autores desean agradecer a Eric van Dinther y Ankur Ankan por su ayuda en la creación de flujos de trabajo para almacenar datos IHC multiplex y se agradece a Bengt Phung por las instrucciones sobre cómo implementar datos IHC multiplex en QuPath para el dibujo de ROI.

Mapeo del panorama inmunitario tumoral: un protocolo de análisis de IHQ multiplex en profundidad

<ol><li>Dunn, G. P., Bruce, A. T., Ikeda, H., Old, L. J., Schreiber, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+immunoediting%3A+from+immunosurveillance+to+tumor+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cancer immunoediting: from immunosurveillance to tumor escape.</a> Nature Immunology. 3 (11), 991-998 (2002).</li>
<li>van der Woude, L. L., Gorris, M. A. J., Halilovic, A., Figdor, C. G., de Vries, I. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migrating+into+the+tumor%3A+a+roadmap+for+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Migrating into the tumor: a roadmap for T cells.</a> Trends in Cancer. 3 (11), 797-808 (2017).</li>
<li>Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+contexture+in+human+tumours%3A+impact+on+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome.</a> Nature Reviews. Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).</li>
<li>Fridman, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+microenvironment+of+human+tumors%3A+general+significance+and+clinical+impact%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Microenvironment%22%5BJournal%5D)">The immune microenvironment of human tumors: general significance and clinical impact.</a> Cancer Microenvironment. 6 (2), 117-122 (2013).</li>
<li>Pages, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+validation+of+the+consensus+Immunoscore+for+the+classification+of+colon+cancer%3A+a+prognostic+and+accuracy+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">International validation of the consensus Immunoscore for the classification of colon cancer: a prognostic and accuracy study.</a> Lancet. 391 (10135), 2128-2139 (2018).</li>
<li>Angell, H. K., Bruni, D., Barrett, J. C., Herbst, R., Galon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Immunoscore%3A+colon+cancer+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The Immunoscore: colon cancer and beyond.</a> Clinical Cancer Research. 26 (2), 332-339 (2020).</li>
<li>Angell, H., Galon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+the+immune+contexture+to+the+Immunoscore%3A+the+role+of+prognostic+and+predictive+immune+markers+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">From the immune contexture to the Immunoscore: the role of prognostic and predictive immune markers in cancer.</a> Current Opinion in Immunology. 25 (2), 261-267 (2013).</li>
<li>Galon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+classification+using+the+Immunoscore%3A+a+worldwide+task+force%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cancer classification using the Immunoscore: a worldwide task force.</a> Journal of Translational Medicine. 10, 205(2012).</li>
<li>Galon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((World-wide+Immunoscore+Task+Force%3A+meeting+report+from+the+34%3BMelanoma+Bridge%26%2334%2C+Napoli%2C+November+30th-December+3rd%2C+2016%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">World-wide Immunoscore Task Force: meeting report from the 34;Melanoma Bridge&#34, Napoli, November 30th-December 3rd, 2016.</a> Journal of Translational Medicine. 15 (1), 212(2017).</li>
<li>Tumeh, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+blockade+induces+responses+by+inhibiting+adaptive+immune+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PD-1 blockade induces responses by inhibiting adaptive immune resistance.</a> Nature. 515 (7528), 568-571 (2014).</li>
<li>Creemers, J. H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tipping+point+in+cancer-immune+dynamics+leads+to+divergent+immunotherapy+responses+and+hampers+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">A tipping point in cancer-immune dynamics leads to divergent immunotherapy responses and hampers biomarker discovery.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002032(2021).</li>
<li>Blank, C. U., Haanen, J. B., Ribas, A., Schumacher, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CANCER+IMMUNOLOGY.+The+%26%2334%3Bcancer+immunogram%26%2334%3B%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CANCER IMMUNOLOGY. The &#34;cancer immunogram&#34;.</a> Science. 352 (6286), 658-660 (2016).</li>
<li>Teruya-Feldstein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunohistochemistry+laboratory+looking+at+molecules+and+preparing+for+tomorrow%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+%26+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">The immunohistochemistry laboratory looking at molecules and preparing for tomorrow.</a> Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 134 (11), 1659-1665 (2010).</li>
<li>Ramos-Vara, J. A., Miller, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+tissue+antigens+and+antibodies+get+along%3A+revisiting+the+technical+aspects+of+immunohistochemistry--the+red%2C+brown%2C+and+blue+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">When tissue antigens and antibodies get along: revisiting the technical aspects of immunohistochemistry--the red, brown, and blue technique.</a> Veterinary Pathology. 51 (1), 42-87 (2014).</li>
<li>Hegde, P. S., Karanikas, V., Evers, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+where%2C+the+when%2C+and+the+how+of+immune+monitoring+for+cancer+immunotherapies+in+the+era+of+checkpoint+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The where, the when, and the how of immune monitoring for cancer immunotherapies in the era of checkpoint inhibition.</a> Clinical Cancer Research. 22 (8), 1865-1874 (2016).</li>
<li>Parra, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+platforms+of+multiplexed+immunofluorescence+for+study+of+paraffin+tumor+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer+Treatment+and+Diagnosis%22%5BJournal%5D)">Novel platforms of multiplexed immunofluorescence for study of paraffin tumor tissues.</a> Journal of Cancer Treatment and Diagnosis. 2 (1), 43-53 (2018).</li>
<li>Gorris, M. A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eight-color+multiplex+immunohistochemistry+for+simultaneous+detection+of+multiple+immune+checkpoint+molecules+within+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Eight-color multiplex immunohistochemistry for simultaneous detection of multiple immune checkpoint molecules within the tumor microenvironment.</a> Journal of Immunology. 200 (1), 347-354 (2018).</li>
<li>Roelofsen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+regression+of+ovarian+carcinoma+after+septic+peritonitis%3B+a+unique+case+report%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Spontaneous regression of ovarian carcinoma after septic peritonitis; a unique case report.</a> Frontiers in Oncology. 8, 562(2018).</li>
<li>van den Brand, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide-mediated+delivery+of+therapeutic+mRNA+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Peptide-mediated delivery of therapeutic mRNA in ovarian cancer.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 141, 180-190 (2019).</li>
<li>van den Brand, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EpCAM-binding+DARPins+for+targeted+photodynamic+therapy+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">EpCAM-binding DARPins for targeted photodynamic therapy of ovarian cancer.</a> Cancers. 12 (7), 1762(2020).</li>
<li>Di Blasio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumour+microenvironment+shapes+dendritic+cell+plasticity+in+a+human+organotypic+melanoma+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The tumour microenvironment shapes dendritic cell plasticity in a human organotypic melanoma culture.</a> Nature Communications. 11 (1), 2749(2020).</li>
<li>van Beek, J. J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pDCs+are+superior+to+cDC2s+in+attracting+cytolytic+lymphocytes+in+melanoma+patients+receiving+DC+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Human pDCs are superior to cDC2s in attracting cytolytic lymphocytes in melanoma patients receiving DC vaccination.</a> Cell Reports. 30 (4), 1027-1038 (2020).</li>
<li>Rodriguez-Rosales, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+aged+neutrophils+are+augmented+in+blood+and+skin+of+psoriasis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory aged neutrophils are augmented in blood and skin of psoriasis patients.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 148 (4), 1030-1040 (2021).</li>
<li>Hoeijmakers, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+composition+in+the+endometrium+of+patients+with+a+complete+molar+pregnancy%3A+Effects+on+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecologic+Oncology%22%5BJournal%5D)">Immune cell composition in the endometrium of patients with a complete molar pregnancy: Effects on outcome.</a> Gynecologic Oncology. 160 (2), 450-456 (2021).</li>
<li>van Ravensteijn, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+and+genomic+analysis+reveals+clinically+relevant+distinctions+between+angiosarcoma+subgroups%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Immunological and genomic analysis reveals clinically relevant distinctions between angiosarcoma subgroups.</a> Cancers. 14 (23), 5938(2022).</li>
<li>van der Woude, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microenvironment+shows+an+immunological+abscopal+effect+in+patients+with+NSCLC+treated+with+pembrolizumab-radiotherapy+combination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumor microenvironment shows an immunological abscopal effect in patients with NSCLC treated with pembrolizumab-radiotherapy combination.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 10 (10), e005248(2022).</li>
<li>Graham Martinez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+microenvironment+landscape+shows+treatment-specific+differences+in+rectal+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The immune microenvironment landscape shows treatment-specific differences in rectal cancer patients.</a> Frontiers in Immunology. 13, 1011498(2022).</li>
<li>Cortenbach, K. R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topography+of+immune+cell+infiltration+in+different+stages+of+coronary+atherosclerosis+revealed+by+multiplex+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cardiology.+Heart+%26+Vasculature%22%5BJournal%5D)">Topography of immune cell infiltration in different stages of coronary atherosclerosis revealed by multiplex immunohistochemistry.</a> International Journal of Cardiology. Heart & Vasculature. 44, 101111(2023).</li>
<li>van Wilpe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous+recombination+repair+deficient+prostate+cancer+represents+an+immunologically+distinct+subtype%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Homologous recombination repair deficient prostate cancer represents an immunologically distinct subtype.</a> Oncoimmunology. 11 (1), 2094133(2022).</li>
<li>Gorris, M. A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paired+primary+and+metastatic+lesions+of+patients+with+ipilimumab-treated+melanoma%3A+high+variation+in+lymphocyte+infiltration+and+HLA-ABC+expression+whereas+tumor+mutational+load+is+similar+and+correlates+with+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Paired primary and metastatic lesions of patients with ipilimumab-treated melanoma: high variation in lymphocyte infiltration and HLA-ABC expression whereas tumor mutational load is similar and correlates with clinical outcome.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 10 (5), e004329(2022).</li>
<li>van Wilpe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumoral+T+cell+depletion+following+neoadjuvant+chemotherapy+in+patients+with+muscle-invasive+bladder+cancer+is+associated+with+poor+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology%2C+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Intratumoral T cell depletion following neoadjuvant chemotherapy in patients with muscle-invasive bladder cancer is associated with poor clinical outcome.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 72 (1), 137-149 (2023).</li>
<li>Sultan, S., Gorris, M. A. J., Buytenhuijs, F., Lvan de Woude, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Segmentation-free+machine+learning+architecture+for+immune+land-scape+phenotyping+in+solid+tumors+by+multichannel+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">A Segmentation-free machine learning architecture for immune land-scape phenotyping in solid tumors by multichannel imaging.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immuno-profiling+and+cellular+spatial+analysis+using+five+immune+oncology+multiplex+immunofluorescence+panels+for+paraffin+tumor+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Immuno-profiling and cellular spatial analysis using five immune oncology multiplex immunofluorescence panels for paraffin tumor tissue.</a> Scientific Reports. 11 (1), 8511(2021).</li>
<li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+multiplex+immunofluorescence+panels+using+multispectral+microscopy+for+immune-profiling+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+human+tumor+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13380(2017).</li>
<li>Sun, Z., Nyberg, R., Wu, Y., Bernard, B., Redmond, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+an+enhanced+7-color+multiplex+IHC+protocol+to+dissect+immune+infiltration+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Developing an enhanced 7-color multiplex IHC protocol to dissect immune infiltration in human cancers.</a> PLoS One. 16 (2), e0247238(2021).</li>
<li>LeicaBiosystems. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BOND+RX+Fully+Automated+Research+Stainer+Protocols%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">BOND RX Fully Automated Research Stainer Protocols.</a> , https://www.leicabiosystems.com/en-nl/ihc-ish/ihc-ish-instruments/bond-rx/ (2022).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

El análisis espacial de la EMT es una técnica muy solicitada para conocer mejor el compartimento de las células inmunitarias y descubrir nuevos biomarcadores pronósticos y predictivos, especialmente en el campo de la inmunooncología16. Se están desarrollando muchas técnicas diferentes para este propósito, que involucran la detección de proteínas, transcripciones de ARNm o una combinación de ambas, con estimaciones de hasta 100-1.000 objetivos. Sin embargo, una mayor multiplexación se produce a costa de experimentos de menor rendimiento, mayores costos experimentales y desafíos técnicos, y a menudo, solo se puede analizar una pequeña parte del TME. La IHQ multiplex utilizando el método basado en TSA que describimos aquí, detecta seis marcadores diferentes + DAPI simultáneamente, es relativamente menos costoso de realizar y las secciones completas de tejido se obtienen en menos de 20 minutos, listas para ser analizadas por completo. Esta técnica se ha vuelto menos compleja con la automatización del procedimiento de tinción. Las mejoras en el microscopio multiespectral, que incluyen la adición de dos filtros adicionales, han mejorado enormemente los tiempos de desmezcla y escaneo espectral. Es posible detectar hasta ocho marcadores diferentes + DAPI simultáneamente. Sin embargo, al expandir la multiplexación con más marcadores, los beneficios antes mencionados desaparecen a medida que la desmezcla espectral se vuelve más desafiante y los tiempos de escaneo de diapositivas completas aumentan sustancialmente. Se están realizando esfuerzos para normalizar la IHC múltiplex entre diferentes instituciones a fin de facilitar su aplicación en el entorno de diagnóstico. Para esta estandarización de la IHC multiplex, aconsejamos a los usuarios que se adhieran al protocolo más accesible con seis marcadores diferentes + DAPI. Sin embargo, todavía se necesitan bastantes conocimientos técnicos y el análisis posterior puede ser un desafío, para lo cual hemos desarrollado metodologías que se describen en este protocolo.
La estandarización comienza con el desarrollo de paneles IHC multiplex. La importancia de la elección de los anticuerpos primarios que detectan determinadas proteínas diana se ha destacado anteriormente17. Nuestros paneles multiplex de IHQ se desarrollan principalmente con clones de anticuerpos primarios que también se utilizan y validan para IHQ en nuestro departamento de diagnóstico. Sin embargo, en el caso del panel de IHQ múltiplex de células dendríticas, la mayoría de los anticuerpos no se utilizaron en el entorno diagnóstico (van der Hoorn et al., manuscrito en presentación). Para garantizar la especificidad y minimizar las diferencias entre lotes, elegimos usar anticuerpos monoclonales en lugar de anticuerpos policlonales y también hemos validado la mayoría de los anticuerpos utilizando líneas celulares transfectadas y células primarias. A lo largo de los años, se han utilizado diferentes versiones de paneles IHC multiplex en numerosos estudios utilizando el sistema Vectra 3 18,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32 . Para implementar estos paneles IHC multiplex de manera óptima en el sistema PhenoImager HT, se tuvieron que realizar algunos ajustes en las combinaciones de anticuerpos primarios y fluoróforos. Para beneficiarse de una mejor desmezcla espectral y tiempos de escaneo más rápidos de secciones de tejido completo, es necesaria la implementación de los últimos fluoróforos Opal480 y Opal780 y evitar el uso de fluoróforos Opal540 y Opal650 en paneles IHC multiplex de siete colores. Los tiempos de escaneo son ~ 3-10 veces más rápidos dependiendo del tamaño de la sección de tejido. Los ajustes del panel IHC múltiplex fueron bastante fáciles de lograr, pero se deben tener en cuenta algunas consideraciones. El espectro fluorescente de Opal480 se superpone mucho con el espectro de autofluorescencia y, por lo tanto, interfiere con la desmezcla espectral de eritrocitos y otras estructuras autofluorescentes. El uso de una mayor concentración del anticuerpo primario junto con Opal480 resolvió este problema en la mayoría de los casos. La implementación del filtro Sample AF patentado en el PhenoImager HT facilita la desmezcla de Opal480 y la autofluorescencia. Sin embargo, es mejor usar un anticuerpo primario que produzca una señal clara cuando se usa con Opal480 para que su señal sea más alta que la autofluorescencia.
A pesar de que estos paneles IHC multiplex están establecidos, la variación de lote a lote es algo que debe tenerse en cuenta. Al realizar controles de IHQ monoplex antes de comenzar el experimento de IHQ multiplex completo, a veces observamos que los anticuerpos primarios se comportan más fuertes o más débiles de un experimento a otro. Las razones de esto podrían ser errores de pipeteo, condiciones de almacenamiento de reactivos subóptimas y vida útil. Resolvimos esto ajustando la solución de anticuerpos primarios en función de nuestra experiencia. Incluso cuando no se tuvo que realizar ninguno de los ajustes antes mencionados, con cada experimento de lote de IHC múltiple, es importante establecer los tiempos de exposición en función de los portaobjetos de control teñidos con IHC monoplex.
Debido a que nuestra investigación se centró inicialmente en diferentes tipos de carcinomas y melanoma, se requirió que los paneles IHQ multiplex fueran intercambiables entre los tipos de tumores con ajustes mínimos. Por lo tanto, siempre incluimos múltiples tipos de tejido (tumoral) en el proceso de optimización y observamos que las diluciones de los anticuerpos primarios para los marcadores de células inmunitarias pueden mantenerse similares entre los diferentes tipos de tumores. Sin embargo, la detección de tejido tumoral entre carcinomas y melanoma necesita diferentes marcadores tumorales. En consecuencia, el marcador tumoral siempre se optimizó para funcionar al final de cada panel de IHQ multiplex y actualmente siempre se usa junto con Opal780, que casualmente también tiene que estar en el último fluoróforo en un procedimiento de tinción de IHQ multiplex. Al utilizar el marcador tumoral al final de la IHQ multiplex, estos paneles de IHQ multiplex se pueden intercambiar fácilmente por otros tipos de tumores, como el glioblastoma (es decir, GFAP) y el linfoma de Hodgkin (es decir, CD30). Para el angiosarcoma, utilizamos este panel IHQ multiplex de linfocitos con gen relacionado con la transformación específica del eritroblasto (ERG) como marcador tumoral con solo dos experimentos de optimización25. La optimización incluyó la titulación del anticuerpo primario ERG y la prueba del panel IHQ multiplex con ERG al final.
Otros ajustes a estos paneles multiplex de IHQ también se pueden realizar mediante el intercambio de un determinado marcador de células inmunitarias por otro marcador inmunitario o funcional. Cada cambio requiere optimización. Se podría seguir el protocolo de optimización descrito anteriormente17. Ciertos cambios en los paneles IHC multiplex propuestos interferirán con los algoritmos de ImmuNet que hemos creado. Se deben generar suficientes datos y se debe dedicar tiempo a implementar estos cambios en el algoritmo (al menos 750 anotaciones para cada nuevo marcador y/o fenotipos de células, y 150 anotaciones para la validación de marcadores previamente entrenados). Los paneles aquí presentados no contienen marcadores funcionales, aunque la implementación de marcadores de puntos de control inmune como PD-1 y PD-L1 en paneles IHQ multiplex se realiza en nuestro laboratorio. Sin embargo, el análisis de marcadores que son menos binarios en señales negativas y positivas ha demostrado ser más difícil y es un área de investigación activa en nuestro grupo.
El número de marcadores que se pueden evaluar simultáneamente con IHQ multiplex es limitado en comparación con otras técnicas novedosas. Si bien esto se puede eludir analizando diferentes paneles en porciones consecutivas de un bloque FFPE, será difícil comparar estas rebanadas espacialmente. Es probable que la orientación y los artefactos plegados no sean los mismos después de la preparación de la diapositiva. Sin embargo, la IHC múltiple es bastante accesible, lo que la convierte en una herramienta atractiva para más instituciones e investigadores y, por lo tanto, más adecuada para su futura implementación en un entorno de diagnóstico. Con la estandarización de los paneles multiplexados de células inmunitarias IHQ para múltiples tipos de tumores y los canales de análisis posteriores, se podría obtener más conocimiento sobre las diferencias en la EMT entre los pacientes y los tipos de tumores. Esto puede, por ejemplo, conducir a más conocimientos sobre el papel de la TME en la respuesta antitumoral a tratamientos específicos. Esto puede incluso dar lugar a nuevos biomarcadores para predecir factores como la respuesta al tratamiento y la supervivencia esperada. En general, esto puede permitir que la IHQ multiplex se convierta en una herramienta clínica para ayudar en la toma de decisiones clínicas, en un enfoque de medicina personalizada. Es cierto que probablemente se deberían automatizar y estandarizar más pasos del procedimiento de análisis para que sea factible su uso en un entorno de diagnóstico diario, por lo que, hasta ahora, es principalmente una perspectiva futurista.
El análisis de múltiples marcadores en un solo portaobjetos de muestra puede ser una herramienta muy poderosa a pesar de sus desafíos técnicos. Con protocolos experimentales estandarizados y un método de análisis robusto, como describimos aquí utilizando ImmuNet, la cuantificación de múltiples marcadores la hace más informativa que la IHQ clásica, mientras que la IHC múltiple sigue teniendo un rendimiento relativamente alto en comparación con los nuevos métodos experimentales de plex superior.

Las células inmunitarias desempeñan un papel crucial en la protección contra patógenos como virus y bacterias, pero también contra las células cancerosas1. Por lo tanto, el sistema inmunitario dentro del microambiente tumoral (TME) es muy prometedor para descubrir biomarcadores pronósticos y predictivos2. Los infiltrados de células inmunitarias se han correlacionado con el pronóstico en varios tipos de cáncer, aunque esto aún no se ha implementado en la atención clínica 3,4. En la mayoría de los tipos de tumores, un número alto de linfocitos T citotóxicos y linfocitos T auxiliares 1 o un número bajo de linfocitos T reguladores se relacionan con un buen pronóstico. Se están realizando esfuerzos para incorporar el llamado "Immunoscore" en la estadificación TNM del cáncer colorrectal, convirtiéndola en la estadificación TNM-I 5,6. El Immunoscore se deriva del número total de linfocitos T (detectados con CD3) y linfocitos T citotóxicos (detectados con CD8) en dos regiones tumorales diferentes: el núcleo tumoral frente al margen invasivo (MI) de los tumores. También se ha propuesto que el Immunoscore tiene valor pronóstico en otros tipos de cáncer, como el melanoma, el cáncer de pulmón y el cáncer de mama 6,7,8,9. Además, los infiltrados de células inmunitarias también pueden correlacionarse con la respuesta a la inmunoterapia con bloqueo de puntos de control10. Sin embargo, estos biomarcadores predictivos deben ser validados en estudios prospectivos antes de que puedan ser implementados de forma rutinaria en la práctica clínica. Además, también se ha propuesto que un solo biomarcador será insuficiente para una predicción significativa11. Por ello, se ha propuesto la creación de un mapa completo de una muestra de paciente mediante la combinación de diferentes biomarcadores como un biomarcador predictivo más completo en el llamado "inmunograma del cáncer"12.
Entre los métodos para el estudio de las células inmunitarias dentro de la TME, la técnica más antigua y conocida es la inmunohistoquímica (IHQ), utilizada habitualmente para las pruebas diagnósticas de varias enfermedades, especialmente el cáncer13. Esta técnica se limitó al uso de uno o solo unos pocos marcadores14 durante mucho tiempo y, por lo tanto, fue superada en entornos de investigación por otras técnicas como la citometría de flujo y el perfil de expresión génica (GEP). Sin embargo, los tejidos tumorales fijados en formol e incluidos en parafina (FFPE) que se utilizan normalmente en el diagnóstico y la investigación de rutina no son (óptimamente) adecuados para la citometría de flujo y la GEP. Además, aunque la GEP y la citometría de flujo proporcionan mucha información sobre el fenotipo y la función de las células, la falta de información espacial es una gran desventaja. Por lo tanto, la heterogeneidad dentro de una muestra, como las diferencias en las áreas de un tumor infiltradas por células inmunitarias frente a las áreas excluidas por células inmunitarias, podría pasar desapercibida15. Se han desarrollado nuevas plataformas para el análisis multiplex de tejidos FFPE, como la IHQ multiplex, la citometría de masas por imagen y la detección de CO por indEXing (CODEX) que se pueden utilizar para detectar múltiples marcadores simultáneamente dentro de una sección de tejido16. Las células inmunitarias de la EMT se están estudiando ampliamente para encontrar los mejores biomarcadores para la inmunoterapia. Sin embargo, las técnicas multiplex y el análisis automatizado de imágenes plantean sus propios obstáculos.
Nuestro laboratorio tiene una amplia experiencia en la tinción multiplex de IHQ utilizando el método de amplificación de señal de ópalo/tiramida (TSA) y lo ha automatizado en una plataforma de IHQ (ver la Tabla de Materiales)17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28, 29,30,31. Hemos optimizado los paneles de células inmunitarias para la detección de diferentes subconjuntos de linfocitos, células mieloides y células dendríticas (CD). Los tejidos que contienen áreas densas de células inmunitarias (linfocitos o morfologías celulares complejas (es decir, células mieloides y CD) son particularmente difíciles de analizar, con el riesgo de sobreestimar o subestimar el número de células inmunitarias presentes. Para superar este problema, nuestro grupo32 desarrolló el software de análisis ImmuNet, y esta línea de aprendizaje automático mejoró enormemente la calidad de la detección de estos diferentes tipos de células inmunitarias. Aquí se describe un protocolo detallado desde la obtención del material FFPE hasta el análisis de las densidades de células inmunitarias en diferentes compartimentos de tejidos y las distancias entre los tipos de células inmunitarias.
Este protocolo describe cómo se realizan los paneles IHC multiplex en el Centro Médico de la Universidad de Radboud desde la implementación del generador de imágenes de patología digital en 2022. Los paneles IHQ multiplex descritos se pueden usar para diferentes carcinomas (por ejemplo, pulmón, próstata, colorrectal, vejiga, mama) con el uso de un anticuerpo pan-citoqueratina como marcador tumoral o para el melanoma con el uso de anticuerpos asociados a melanocitos como marcadores tumorales. Estos protocolos de IHQ multiplex se han optimizado cuidadosamente en términos de concentración de anticuerpos primarios, combinaciones de fluoróforos y la secuencia del procedimiento de tinción. Nosotros y otros hemos descrito anteriormente la optimización del panel IHC multiplex 17,33,34,35. Los paneles IHC multiplex se pueden adaptar, pero las tuberías de análisis descritas deben evaluarse y, potencialmente, ajustarse o reentrenarse en consecuencia. Los protocolos IHC multiplex de siete colores descritos utilizan los fluoróforos Opal Opal480, Opal520, Opal570, Opal620, Opal690, Opal780 y 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), de modo que se permite una fácil desmezcla y un escaneo rápido en el generador de imágenes con "Multiespectral One Touch ImmunoFluorescence" (MOTiF). La tinción y el escaneo de nueve colores no se describen en este protocolo, ya que esto requiere un ajuste aún más fino de la configuración experimental y otro modo de escaneo en el generador de imágenes que utiliza el filtro sintonizable de cristal líquido.

<table><tbody><tr><td>Célula anti-CD14</td><td>Marque&nbsp;</td><td>114R-16</td><td>sección 3, clon EPR3653</td></tr><tr>célula<td>anti-CD163</td><td>Marque&nbsp;</td><td>163M-15</td><td>sección 3, clon MRQ-26</td></tr><tr><td>anti-CD19</td><td>Abcam</td><td>ab134114</td><td>sección 3, clon EPR5906</td></tr><tr><td>anti-CD1c (BDCA1)</td><td>Thermo Scientific</td><td>TA505411</td><td>sección 3, clon OTI2F4</td></tr><tr><td>anti-CD20</td><td>Thermo Scientific</td><td>MS-340-S</td><td>sección 3, clon L26</td></tr><tr><td>anti-CD3</td><td>Thermo Scientific</td><td>RM-9107</td><td>sección 3, clon sp7</td></tr><tr><td>anti-CD303/ BDCA2</td><td>Dendrtics a través de Enzo Lifesciences/Axxora</td><td>DDX0043</td><td>sección 3, clon 124B3.13</td></tr><tr><td>anti-CD56</td><td>Cell Marque&nbsp;</td><td>156R-94</td><td>sección 3, clon MRQ-42</td></tr><tr><td>anti-CD66b</td><td>BD Biosciences</td><td>555723</td><td>sección 3, clon G10F5</td></tr><tr><td>anti-CD68</td><td>Dako Agilent</td><td></td><td>M087601 sección 3, clon PG-M1</td></tr><tr><td>anti-CD8</td><td>Dako Agilent</td><td>M7103</td><td>sección 3, clon C8/144B</td></tr><tr><td>anti-Foxp3</td><td>Thermo Scientific</td><td>14-4777</td><td>sección 3, clon 236A/E7</td></tr><tr><td>anti-Gp100</td><td>Dako Agilent</td><td>M063401</td><td>sección 3, clon HMB45</td></tr><tr><td>anti-HLA-DR, DP, DQ</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-53302</td><td>sección 3, clon CR3/43</td></tr><tr><td>anti-MART-1</td><td>Thermo Scientific</td><td>MS-799</td><td>sección 3, clon A103</td></tr><tr><td>anti-citoqueratina</td><td>Abcam</td><td>ab86734</td><td>sección 3, clon AE1/AE3 + 5D3</td></tr><tr><td>anti-SOX10</td><td>Sigma Aldrich</td><td>383R</td><td>sección 3, clon EP268</td></tr><tr><td>anti-tirosinasa</td><td>Sanbio</td><td>MONX10591</td><td>sección 3, clon T311</td></tr><tr><td>anti-XCR1</td><td>Cell Signaling Technologies a través de Biok&eacute;</td><td>44665S</td><td>sección 3, clon D2F8T</td></tr><tr><td>diluyente de anticuerpos</td><td>Akoya BioSciences</td><td>SKU&nbsp; ARD1001EA</td><td>sección 3, de Opal 7-Color Automation IHC Kit Portaobjetos 50 (opcionalmente también se puede sustituir por TBST con 10% de BSA)</td></tr><tr><td>Sonda de aspiración de enlace</td><td>Leica Biosciences</td><td>S21.0605</td><td>sección 3</td></tr><tr><td>Limpieza de sonda de aspiración de enlace</td><td>Leica Biosciences</td><td>CS9100</td><td>sección 3</td></tr><tr><td>Solución de desparafinado de unión Leica</td><td>Biosciences</td><td>AR9222</td><td>sección 3</td></tr><tr><td>Etiqueta Bond Objectglas + pelusa de impresión</td><td>Leica Biosciences</td><td>S21.4564.A</td><td>sección 3</td></tr><tr><td>Sistema de detección de investigación Bond 2</td><td>Leica Biosciences</td><td>DS9777</td><td>sección 3</td></tr><tr><td>Bond RX autostainer&nbsp;</td><td>Leica Biosciences-sección</td><td></td> <td>3, plataforma automatizada</td></tr><tr><td>Bond TM Epitope Retrieval 1 - 1 L</td><td>Leica Biosciences</td><td>AR9961</td><td>sección 3</td></tr><tr><td>Bond TM Epitope Retrieval 2 - 1 L</td><td>Leica Biosciences</td><td>AR9640</td><td>sección 3</td></tr><tr><td>Bond TM Wash Solution 10x - 1 L</td><td>Leica Biosciences</td><td>AR9590</td><td>sección 3</td></tr><tr><td>BOND Cobertor universal</td><td>Leica Biosciences</td><td>S21.4611</td><td>sección 3</td></tr><tr><td>Kit de valoración Bond(TM)</td><td>Leica Biosciences</td><td>OPT9049</td><td>sección 3</td></tr><tr><td>cubreobjetos 24 x 32 mm #1 (0,13-0,16 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15717592</td><td>cubreobjetos de la sección 2</td></tr><tr><td>24 x 50 mm</td><td>VWR</td><td>631-0146</td><td>sección 2</td></tr><tr><td>DAPI Fluoromount-G</td><td>VWR</td><td>0100-20</td><td>sección 3, siempre que los portaobjetos monoplex deban revisarse rápidamente, no para análisis oficial, entonces DAPI se tiñe por separado para obtener mejores resultados</td></tr><tr><td>Eosine</td><td></td><td></td><td>sección 2, hecho en casa</td></tr><tr><td>Etanol 99.5%</td><td>VWR</td><td>4099.9005</td><td>sección 2</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>VWR</td><td>0100-01</td><td>sección 3&nbsp;</td></tr><tr><td>hematoxilina-sección</td><td></td><td></td> <td>2, producción casera</td></tr> <tr><td>de</td> <td>detección y fenotipado de células inmunitarias</td><td>ImmuNet</td><td></td></tr> <tr><td>software inForm 2.4.10</td><td>Akoya BioSciences-sección</td><td></td> <td>4 y 6</td></tr><tr><td>OPAL 480 paquete de reactivos</td><td>Akoya BioSciences</td><td>FP1500001KT</td><td>sección 3</td></tr><tr><td>OPAL 520 paquete FP1487001KT</td><td>de reactivos Akoya BioSciences Akoya BioSciences</td><td></td><td>sección 3</td></tr><tr><td>Paquete de reactivos OPAL 570</td><td>FP1488001KT</td> de <td>Akoya BioSciences</td><td>sección 3</td></tr><tr><td>Paquete de reactivos OPAL 620</td><td>Akoya BioSciences</td><td>FP1495001KT</td><td>sección 3</td></tr><tr><td>Paquete de reactivos OPAL 690</td><td>Akoya BioSciences</td><td>FP1497001KT</td> paquete de <td></td></tr><tr><td>reactivos OPAL 780</td> de la sección 3 <td>Akoya BioSciences FP1501001KT</td><td></td><td>la sección 3</td></tr><tr><td>Opal 7-Color Automation IHC Kit 50 diapositiva</td><td>Akoya BioSciences</td><td>NEL821001KT</td><td>sección 3</td></tr><tr><td>PhenoChart 1.1.0</td><td>Akoya BioSciences-sección</td><td></td> <td>5</td></tr><tr><td>PhenoImagerHT</td><td>Akoya BioSciences</td><td></td><td>CLS143455 sección 4, generador de imágenes de patología digital con visor de portaobjetos y software de imagen (anteriormente conocido como Vectra Polaris)</td></tr><tr><td>Medio de montaje Quick-D</td><td>Klinipath</td><td>7280</td><td>sección 2</td></tr><tr><td>QuPath 0.3.2</td><td></td><td></td><td>plataforma de software de análisis de imágenes de portaobjetos</td></tr><tr><td>completos R 4.1.1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cajas de portaobjetos</td><td>VWR</td><td>631-0737</td><td>sección 1</td></tr><tr><td>SuperFrost Plus</td><td>Thermo Scientific a través de VWR</td><td>631-9483</td><td>sección 1</td></tr><tr><td>Software Vectra Polaris 1.0.13</td><td>Akoya BioSciences-sección</td><td></td> <td>4</td></tr><tr><td>Xileno</td><td>VWR</td><td>4055-9005</td><td>Sección 2</td></tr></tbody></table>

análisis inmunohistoquímico multiplex del paisaje espacial de células inmunitarias del microambiente tumoral

Multiplex Immunohistochemical Analysis of the Spatial Immune Cell Landscape of the Tumor Microenvironment

El paisaje de células inmunitarias del microambiente tumoral contiene potencialmente información para el descubrimiento de biomarcadores pronósticos y predictivos. La inmunohistoquímica multiplex es una herramienta valiosa para visualizar e identificar diferentes tipos de células inmunitarias en los tejidos tumorales mientras se conserva su información espacial. Aquí proporcionamos protocolos detallados para analizar poblaciones de linfocitos, mieloides y células dendríticas en secciones de tejido. Desde el corte de secciones fijadas en formol e integradas en parafina, los procedimientos automáticos de tinción multiplex en una plataforma automatizada, el escaneo de los portaobjetos en un microscopio de imágenes multiespectral, hasta el análisis de imágenes mediante un algoritmo de aprendizaje automático desarrollado internamente ImmuNet. Estos protocolos se pueden aplicar a una variedad de muestras tumorales simplemente cambiando los marcadores tumorales para analizar las células inmunitarias en diferentes compartimentos de la muestra (tumor frente a margen invasivo) y aplicar el análisis del vecino más cercano. Este análisis no se limita a muestras tumorales, sino que también se puede aplicar a otros tejidos (no) patógenos. Las mejoras en el equipo y el flujo de trabajo en los últimos años han acortado significativamente los tiempos de producción, lo que facilita la aplicación futura de este procedimiento en el entorno de diagnóstico.

Este protocolo describe en detalle cómo se lleva a cabo la caracterización de las células inmunitarias del microambiente tumoral mediante inmunohistoquímica multiplex.

Análisis inmunohistoquímico multiplex del paisaje espacial de células inmunitarias del microambiente tumoral

The immune cell landscape of the tumor microenvironment potentially contains information for the discovery of prognostic and predictive biomarkers. ...

Nuestro objetivo es identificar la cantidad, el tipo y la ubicación de las células inmunitarias dentro de los microambientes tumorales. En el campo de la inmunoquímica, ha habido grandes avances tecnológicos en los últimos años. Los avances en la tecnología de inmunoquímica multiplex permiten estudiar más marcadores de forma fiable.Los desafíos experimentales actuales son la visualización de tipos específicos de células inmunitarias dentro de muestras tumorales, que se han superado mediante el uso de los métodos de inmunoquímica múltiple. Sin embargo, el análisis automático preciso de estas imágenes sigue siendo un desafío en el que estamos trabajando. Las diferencias entre el panorama de las células inmunitarias entre los tumores primarios y los metastásicos generan preguntas como: ¿qué propiedades intrínsecas del tumor impulsan estas diferencias y qué significan estas diferencias para las terapias dirigidas al sistema inmunitario?Además de nuestro trabajo exploratorio, también nos centraremos en cuestiones clínicamente relevantes, como cómo el paisaje de células inmunitarias del tumor se ve afectado por diferentes tipos de terapias contra el cáncer y si el panorama de células inmunitarias podría predecir el resultado de la terapia.

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Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

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