Name: Puntuación de la inflamación del sistema nervioso central, la desmielinización y la lesión axonal en la encefalomielitis autoinmune experimental (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T14:35:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Aprende a evaluar inflamación, desmielinización y daño axonal en la encefalomielitis autoinmune experimental usando histología y niveles de neurofilamento ligero en suero. Este protocolo mejora la caracterización de la patología de la EM.

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Agradecemos al Dr. Raymond Sobel (Universidad de Stanford) por mostrarnos su método de macroscopía y fijación de secciones cerebrales y de médula espinal. Agradecemos a Kyle Roberton y Milan Ganguly, del Centro de Fenogenómica de Toronto, por aprender el método de inclusión y por cortar muchas de nuestras secciones cerebrales y de la médula espinal. Agradecemos al Dr. Matthew Cussick y al Dr. Robert Fujinami (Universidad de Utah) por compartir sus protocolos para calificar la inflamación submeníngea y perivascular en la médula espinal. Agradecemos a Shalina Ousman por compartir el clon del anticuerpo CD45. Agradecemos a Xiofang Lu por la capacitación en el procesador de tejidos y la estación de inclusión de tejidos y por el mantenimiento de este equipo en el Centro de Investigación Keenan de Investigación Biomédica en el Hospital St. Michael. Este trabajo fue apoyado por una beca biomédica de MS Canadá (a SED). Carmen Ucciferri cuenta con el apoyo de una beca del Gobierno de Canadá. Nuria Álvarez-Sánchez cuenta con el apoyo de una beca postdoctoral Keenan.

Tinción histológica de la médula espinal para evaluar la gravedad de la enfermedad EAE

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Shannon Dunn es consultora de FSD Lucid Psycheceuticals.

La tinción histológica de la médula espinal es una herramienta importante para evaluar la gravedad de la enfermedad EAE, especialmente en los casos en los que existen diferencias entre los grupos de tratamiento en el grado de recuperación de la enfermedad en la fase postaguda de la enfermedad. La tinción para la infiltración de células inmunitarias (CD45), la mielina (LFB) y la lesión axonal (SMI-32) ayuda a caracterizar la causa subyacente de las puntuaciones clínicas alteradas en ratones. El protocolo de tinción histológica descrito aquí proporciona una perspectiva de la inflamación, así como de la extensión de la mielina y la lesión axonal. Además, los resultados mostrados validan la medición de sNF-L como método para evaluar la extensión del daño neuronal global en EAE.
Los parámetros críticos para este análisis son garantizar que los investigadores no conozcan la identidad de las secciones y que haya un muestreo equivalente en cada nivel de la médula espinal en los diferentes ratones. Esto se debe a que la gravedad de la inflamación puede ser mayor en los niveles más bajos del cordón. Otro parámetro crítico es el tamaño de los grupos experimentales. Por lo general, la médula espinal y el cerebro se extraen de 6 a 8 ratones por grupo en el punto final para ver diferencias significativas entre los grupos con tratamientos o genotipos que tienen tamaños de efecto modestos. También es importante asegurarse de que los ratones seleccionados, cuando se promedian, tengan puntuaciones medias representativas de todo el grupo. Con respecto a la resolución de problemas, un problema común que encuentran aquellos que no tienen experiencia con el protocolo es que la médula espinal se fija durante un período de tiempo insuficiente y no se extruye fácilmente de la columna vertebral. Si este es el caso, la médula espinal se puede diseccionar manualmente de la columna recortando a lo largo de las apófisis espinosas con unas tijeras finas y abriendo la columna para revelar la médula espinal. Alternativamente, los tejidos se pueden fijar durante unos días más sin interferir con el éxito de la tinción de anticuerpos. Los clones de anticuerpos que aquí se describen actúan en tejido fijado hasta 2 semanas en formol.
La incrustación de las piezas de la médula espinal requiere habilidad y práctica. Se recomienda que se usen lupas para los ojos y que se dirija una lámpara sobre la estación de inclusión para visualizar mejor si las secciones caen en sección transversal o en sección longitudinal. Mantener las longitudes de las piezas de la médula espinal a menos de 2 mm durante la macrofosa ayudará a que caigan en sección transversal. Otro problema común que se encuentra para los usuarios menos experimentados es que el LFB se evapora durante la incubación durante la noche, dejando la mitad del portaobjetos teñido y la otra mitad sin teñir. Para evitar la evaporación, la placa de tinción de vidrio debe sellarse con una película termoplástica y luego con una envoltura de plástico. Si se produce evaporación y las secciones se tiñen de manera desigual, se recomienda desazular completamente los portaobjetos con carbonato de litio y volver a teñirlos en LFB durante la noche. Otro problema común es que los usuarios no eliminan completamente la materia gris después de LFB. Es fundamental examinar secciones individuales bajo el microscopio para asegurarse de que se ha alcanzado una cantidad suficiente de deazulado antes de continuar con otros pasos del protocolo. Además, aunque las tinciones IHC CD45 y SMI-32 tienen un rendimiento sólido, sigue siendo importante solucionar problemas de concentraciones de anticuerpos en experimentos preliminares para cada nuevo lote de anticuerpos recibido. Esto se puede hacer mediante la prueba de una variedad de concentraciones del anticuerpo en una sección de control positivo (EAE médula espinal). La tinción por primera vez también debe incluir un control negativo que consista en un anticuerpo secundario solo sin la adición de anticuerpos primarios. Por último, es fundamental en el análisis de imágenes establecer umbrales de imágenes individuales, ya que la tinción puede ser desigual entre diapositivas o secciones.
Este protocolo utiliza software de libre acceso. Si uno no tiene acceso a un procesador, un embebridor o un micrótomo, estos pasos pueden obtenerse en un núcleo de patología hospitalario que ofrezca estos servicios. Además, si no se tiene acceso a un escáner de diapositivas, se puede utilizar un microscopio óptico equipado con una cámara de vídeo para guardar imágenes TIFF de la médula espinal o de las regiones cerebrales. Para un flujo de trabajo basado en microscopio, capture secciones de LFB o LFB/H&E a baja potencia (aumento de 40x) y para tinción de CD45 y SMI-32, obtenga imágenes de al menos cuatro ventanas centradas en las partes ventral, dorsal y lateral de la médula espinal (aumento de 200x para CD45 y aumento de 400x para SMI-32). Se puede realizar un análisis de imágenes en estas imágenes para cuantificar la tinción de una manera similar a la descrita.
La decisión de qué abordaje histológico adoptar para puntuar la EAE depende de cuánto difieren las puntuaciones clínicas entre los grupos. Por ejemplo, si hay diferencias drásticas en la puntuación clínica de EAE (un grupo recibió EAE y otro no), esto generalmente se relaciona con diferencias en la inflamación mediada por periférica. En este caso, la puntuación de la presencia de lesiones desmielinizantes en los cortes teñidos con LFB/H&E es suficiente y revelará diferencias entre los grupos. Si los grupos son más similares en la puntuación clínica al inicio y, en cambio, hay diferencias en el grado de recuperación clínica (por ejemplo, el experimento de la Figura 5A), es mejor aplicar el flujo de trabajo histológico completo que se describe aquí, incluida la puntuación de la inflamación cerebral en el tronco encefálico y el cerebelo, para distinguir si las diferencias en la cronicidad de la enfermedad se relacionan con diferencias en la inflamación o el daño tisular.  Si se encuentran diferencias en la inflamación evaluadas por el recuento de CD45, se pueden realizar más estudios de IHQ para teñir las células T (anti-CD3), los monocitos/macrófagos infiltrantes (Mac3) y la microglía (Iba-1/TMEM119) (los clones de anticuerpos recomendados se encuentran en la Tabla Suplementaria 3). La activación de la microglía se refleja en un aumento en la intensidad de la tinción de Iba-1 en la microglía de doble marcado Iba-1+TMEM-19+ y un aumento de la retracción de los procesos de microglía que se pueden evaluar mediante el análisis de Sholl en las secciones32. Además, se pueden aplicar técnicas como la citometría de flujo o la secuenciación de ARN unicelular para realizar una caracterización más profunda de la frecuencia y el fenotipo de las poblaciones inmunitarias en el cerebro y la médula espinal.
El recuento de axones SMI-32+ es un método sensible para detectar lesiones axónicas en EAE32,33 y en MS34. SMI-32, que detecta la forma no fosforilada de neurofilamento pesado o medio que se acumula en los bulbos finales de las neuronas seccionadas. Una alternativa para detectar axones lesionados es la tinción con proteína precursora amiloide (APP) que puede acumularse en los axones como resultado de la interrupción del transporte de axones33. El patrón de tinción para SMI-32 y APP, aunque ambos reflejan una lesión axonal, no suelen superponerse, lo que indica que están detectando diferentes patologías33. También se pueden complementar las medidas histológicas de la lesión axonal midiendo el sNF-L, que es una medida rápida y sensible de la lesión axonal en curso tanto en la médula espinal como en el cerebro. Ofrece la ventaja de que se puede hacer en medio día en ratones vivos. Un inconveniente de este método es que los kits son caros y la máquina está muy especializada. La empresa que vende el kit sNF-L ofrece una tarifa por servicio para aquellos que no tienen acceso a una máquina SIMOA. Una alternativa a la evaluación de la lesión axonal es puntuar la pérdida de axones contando los axones en las secciones de la médula espinal teñidas con azul de toluidina12 o contando los haces de neurofilamentos detectados por SMI-31 en áreas de la sustancia blanca de la médula espinal32. Ambos son enfoques más laboriosos que la medición SMI-32 o sNF-L.
Si las puntuaciones clínicas de EAE difieren entre los grupos, pero las puntuaciones de inflamación, desmielinización y lesión axonal no revelan diferencias entre los grupos, puede ser útil teñir la activación de los astrocitos mediante GFAP (ver Tabla suplementaria 3 para el clon de anticuerpos recomendado). La activación de los astrocitos se asocia con un aumento de la tinción de GFAP y se ha demostrado que esto se correlaciona con la progresión de la EAE en algunos modelos de EAE, incluida la EAE crónica en la rata DA35.
En conclusión, este protocolo describe métodos y proporciona un flujo de trabajo de análisis para realizar la puntuación histológica de EAE.

La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es el modelo murino más común para la enfermedad desmielinizante humana, la Esclerosis Múltiple (EM)1. La patología inflamatoria clásica de la EM, que incluye la infiltración de IFN-γ (gamma) y células T auxiliares productoras de IL-172, la infiltración de monocitos inflamatorios3, la formación de lesiones desmielinizantes inflamatorias perivasculares y submeníngeas4 y la aparición de lesión axonal4 en el sistema nervioso central (SNC), también se observa en EAE 5,6,7,8,9 . La similitud en los mecanismos inmunitarios entre la EAE y la EM ha convertido a la EAE en un modelo preclínico adecuado para probar la eficacia y los mecanismos de acción de una serie de terapias inmunológicas aprobadas para la EM, como el natalizumab, el fingolimod, el dimetilfumarato y el acetato de glatirámero (revisado en 1,5). Ciertos regímenes EAE modelan otros aspectos de la patología progresiva de la EM más allá de la lesión axonal, incluido el desarrollo de inflamación submeníngea en el cerebro, la desmielinización crónica, la atrofia de la médula espinal, la sinapsis y la pérdida de neuronas 6,10,11,12. Por lo tanto, EAE tiene utilidad para evaluar la eficacia de las terapias neuroprotectoras para la EM.
La EAE se induce en roedores de varias maneras. La inmunización activa es el método de inducción más común e implica la inmunización de roedores con antígenos de mielina (proteínas enteras o péptidos) emulsionados en CFA suplementados con Mycobacterium tuberculosis muerto por calor 13. Dependiendo de la cepa de ratón, la toxina de la tos ferina (PTX) también se administra el día 0 y el día 2 de la inmunización para aumentar la penetrancia de la enfermedad13. La EAE también puede ser inducida mediante la transferencia adoptiva de células T específicas de mielina obtenidas de ratones cebados con mielina/CFA a ratones sanos14 o puede desarrollarse espontáneamente en ratones que sobreexpresan receptores de células T específicos para los principales antígenos de mielina5.
La gravedad y la progresión de la enfermedad EAE se puntúan comúnmente mediante una escala clínica discreta de 5 puntos: 1 - flacidez de la cola, 2 - debilidad de las extremidades posteriores o del pie, 3 - parálisis completa en una o ambas extremidades posteriores, 4 - debilidad de las extremidades anteriores, 5 - moribundo o muerto13. Este sistema de puntuación clínica es sólido para documentar la progresión de la parálisis ascendente que se produce al inicio de la enfermedad, pero es menos sensible para captar el grado de recuperación de los ataques inflamatorios del SNC. Por ejemplo, tanto a los ratones que deambulan con dificultad como a los ratones que deambulan con facilidad pero que presentan debilidad para agarrar los pies se les asigna una puntuación de 2 en la escala EAE. Las puntuaciones pueden permanecer elevadas en la fase post-aguda de la EAE debido a la presencia de lesión o pérdida permanente de axones, incluso a pesar de la resolución de la respuesta inflamatoria9. Ha habido una variedad de intentos de desarrollar sistemas de puntuación más refinados, pruebas conductuales, medidas de las extremidades posteriores y la fuerza de agarre, y sistemas de monitorización infrarroja para capturar mejor las diferencias en los déficits clínicos en EAE 9,16,17,18; Sin embargo, estas medidas de puntuación más complejas no distinguen la contribución de la inflamación frente a la lesión tisular a los déficits neurológicos subyacentes. Por lo tanto, el enfoque de referencia para puntuar la gravedad de la EAE es realizar una puntuación tanto clínica como histológica.
Aquí, se describe un protocolo sobre cómo diseccionar e incrustar muestras de médula espinal y cerebro de ratón en parafina de una manera que capture el proceso estocástico de formación de lesiones que ocurre en EAE. También se presenta un protocolo de cómo teñir secciones con azul rápido de Luxol (LFB), creado originalmente por Kluver y Barrera19, que detecta mielina en el SNC. Las secciones se tiñen con LFB solo (para el análisis de desmielinización) o se contratiñen con hematoxilina y eosina (H&E) para ayudar a visualizar y puntuar las lesiones inflamatorias. También se proporcionan protocolos para cuantificar la presencia de leucocitos totales (CD45), la pérdida de mielina y el número de axones lesionados (SMI-32) en la médula espinal utilizando anticuerpos disponibles comercialmente, técnicas inmunohistoquímicas (IHQ) y software de acceso público. El protocolo utilizado para cuantificar los leucocitos en la médula espinal también se puede aplicar para cuantificar los leucocitos en el cerebro.
La evaluación histológica de la pérdida y lesión axonal en el cerebro es comparativamente más difícil que en la médula espinal, ya que los tractos de sustancia blanca del cerebro no corren paralelos entre sí. La medición de la luz de neurofilamentos séricos (sNF-L) se ha convertido en un biomarcador prometedor para la lesión neuronal en la EM20,21. Estudios recientes han extendido esta tecnología a EAE 22,23,24. Aquí, se presenta un método para medir la luz de neurofilamentos séricos (sNF-L) en ratones vivos utilizando un ensayo de molécula pequeña (SIMOA). Este método requiere solo una pequeña cantidad de suero y se puede realizar en ratones vivos en solo medio día, lo que proporciona una retroalimentación rápida sobre cómo una terapia probada está afectando la lesión general del SNC. Todos los métodos descritos aquí se pueden aplicar a ratones de cualquier sexo o cepa.

<table><tbody><tr><td>10% Formalina tamponada neutra</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td>Se utiliza para fijar muestras de médula espinal y cerebro</td></tr><tr><td>1000 mL Vaso de precipitados de vidrio</td><td>Pyrex</td><td>1000</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Falcon Tube</td><td>Starstedt</td><td>62.554.100</td><td>Fijación y almacenamiento de la médula espinal y el cerebro</td></tr><tr><td>250 mL Matraz Erlenmeyer</td><td>Pyrex</td><td>4980</td><td></td></tr><tr><td>500 mL Vaso de vidrio</td><td>Pyrex</td><td>1003</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri de 92 mm x 16 mm</td><td>Starstedt</td><td>82-1473-001</td><td>Utilizado en el procedimiento de macroscopía de tejidos</td></tr><tr><td>Alcohol etílico al 95%</td><td>Alcoholes comerciales P016EA95</td><td></td><td>Pasos de deshidratación y rehidratación</td></tr><tr><td>ABC Elite Kit</td><td>Vector Labratories</td><td>PK6100</td><td>Utilizado para el etiquetado de inmunohistoquímica</td></tr><tr><td>Pluma Aqua Hold 2 PAP Cole</td><td>Parmer</td><td>UZ-75955-53</td><td>Se utiliza para dibujar alrededor de secciones de tejido en Tinción inmunohistoquímica</td></tr><tr><td>Kit de bloqueo de avidina/biotina</td><td>Laboratorios de vectores</td><td>SP-2001</td><td></td></tr><tr><td>Gabinete de bioseguridad</td><td>Cualquier</td><td></td><td></td>Laboratorio</tr><tr>de <td>vectores</td><td>IgG anti-ratas de conejo biotinilado</td><td>BA-4000</td><td>Utilizado para la tinción de CD45</td></tr><tr><td>C57BL6/J</td><td>Ratones Jackson Laboratory</td><td>Stock # 664</td><td>Estos ratones se utilizaron en experimentos se muestra en papel.</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Sorvall ST Plus</td><td></td></tr><tr><td>CitriSolv</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-121</td><td>Se utiliza para el desparafinado. Es una alternativa al xileno</td></tr><tr><td>DAB Kit</td><td>Vector Labratories</td><td>SK-4100</td><td>Se utiliza para desarrollar en inmunohistoquímica</td></tr><tr><td>ddH2O</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Bisturí desechable</td><td>Magna</td><td>M92-10</td><td>Se utiliza para macroscópica la médula espinal y el cerebro</td></tr><tr><td>DWK Life Sciences (Wheaton) placa de tinción de vidrio</td><td>Cole Parmer</td><td>UZ-48585-60</td><td>Se utiliza para tinción histoquímica y lavados</td></tr><tr><td>DWK Life Sciences (Wheaton) gradilla de tinción de vidrio</td><td>Cole Parmer</td><td>10061392</td><td>Utilizado para inmunohistoquímica e histoquímica</td></tr><tr><td>Eosina Y</td><td>Bioshop</td><td>173772-87-1</td><td>Tiñe el citoplasma</td></tr><tr><td>Hojas de micrótomo de plumas</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-634-1C</td><td>Se utiliza para seccionar parafina</td></tr><tr><td>Papel de filtro</td><td>Whatman</td><td>1001110</td><td>Se utiliza para filtrar la formalina (durante la macroscopia) y el luxol fast blue</td></tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas finas</td><td>Fine Science Tools</td><td>14160-10</td><td>Se utiliza para cortar el cerebro y el cráneo</td></tr><tr><td>Fumehood</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gibco DPBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>14190944</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>BioShop</td><td>ACE333.4</td><td>Utilizado en el procedimiento de tinción luxol fast blue</td></tr><tr><td>Histoplex Contenedores de histología</td><td>Starplex Scientific</td><td>565-060-26</td> Fijación de la <td>médula espinal y el cerebro</td></tr><tr><td>Peróxido de hidrógeno</td><td>Fisher Chemicals</td><td>H325-500</td><td>Se utiliza para eliminar la peroxidasa endógena en el tejido</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>Kimtech Science Kimwipes</td><td>Kimberly Clark Professional</td><td>34155</td><td>Se utiliza para inmunohistoquímica</td></tr><tr><td>Papel para lentes</td><td>VWR</td><td>52846-001</td><td>Se utiliza para atrapar especies de médula espinal en casete durante el procesamiento</td></tr><tr><td>Microscopio</td> óptico <td>Cualquier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>carbonato de litio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>554-13-3</td><td>Desazulado después de la tinción con azul rápido</td>de</tr><tr><td>luxol Azul de luxol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1328-51-4</td><td>Tinciones de mielina del SNC</td></tr><tr><td>M.O.M Kit de inmunodetección</td><td>Laboratorios de vectores</td><td>BMK-2202</td><td>Utilizado para tinción SMI-32</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Chemicals</td><td>A454.2</td><td>Utilizado para la fijación</td></tr><tr><td>Hematoxilina de Mayer</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>26381-02</td><td>Tiñe los núcleos</td></tr><tr><td>Micro-Adson Pinzas con dientes</td><td>Fine Science Tools</td><td>11027-12</td><td>Utilizado para reflejar el cráneo durante las disecciones</td></tr><tr><td>Microcentrífuga&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>Modelo 5417R</td><td></td></tr><tr><td>Microvette Tubos Capilares CB 300 Z</td><td>Starstedt</td><td>16.440.100</td><td>Utilizado para la extracción de sangre</td></tr><tr><td>Micrscope Cover Glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12545A</td><td>Utilizado para el deslizamiento de cubreobjetos</td></tr><tr><td>Mini Shaker</td><td>VWR</td><td>12620-938</td><td>Utilizado para la fabricación de tampones</td></tr><tr><td>NF Light kit</td><td>Quanterix 103186</td><td></td><td>Este kit se puede utilizar para la detección de neurofilamentos solubles en suero o en humanos</td></tr><tr><td>Guantes de nitrilo</td><td>VWR</td><td>76307-462</td><td>Seguridad</td></tr><tr><td>Suero normal</td><td>de cabra Vectores Labratories</td><td>S-1000</td><td>Reactivo bloqueante</td></tr><tr><td>Suero de conejo normal</td><td>Labratories vectoriales</td><td>S-5000</td><td>Reactivo bloqueador</td></tr><tr><td>OmniSette Casetes de tejido</td><td>Fisher Scientific</td><td>M4935FS</td><td>Se utiliza para incrustar la médula espinal y el cerebro</td></tr><tr><td>Pipeta y puntas p1000</td><td>varios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta p200 y puntas</td><td>varias</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Estación de inclusión de parafina</td><td>Leica Biosystems</td><td>modelo EG1160</td><td></td></tr> Medio <tr><td>de infiltración/inclusión de tejido Paraplast</td><td>Leica Biosystems 39601006</td><td></td><td>Se utiliza para incrustar la médula espinal y el cerebro</td></tr><tr><td>Montaje Permount Medio</td><td>Fisher Chemicals</td><td>SP15-100</td><td>Se utiliza para montar cubreobjetos en portaobjetos</td></tr><tr><td>Medidor de pH</td><td>Fisher Scientific</td><td>13636AB315B</td><td>Se utiliza para tampones de</td></tr> pH <tr><td>Pipetas de transferencia de plástico</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-20</td><td>Se utiliza para tampones</td></tr><tr><td>de pH Cloruro de potasio</td><td>BioShop</td><td>7447-40-7</td><td>Se utiliza para fabricar PBS</td></tr><tr><td>Fosfato de potasio monobásico</td><td>BioShop</td><td>7778-77-0</td><td>Se utiliza para hacer PBS</td></tr><tr><td>Olla a presión</td><td>Nordic Ware</td><td>Tender Cooker</td><td></td></tr><tr><td>Rata purificada anti-ratón CD45</td><td>Vector Labratories</td><td>553076</td><td>Detecta leucocitos</td></tr><tr><td>Alcohol de grado reactivo 100%</td><td>VWR</td><td>89370-084 Pasos de</td><td>deshidratación y rehidratación</td></tr><tr><td>Alcohol de grado reactivo 70%</td><td>VWR</td><td>64-17-5</td><td>Deshidratación y Pasos de rehidratación</td></tr><tr><td>Microtomo rotativo</td><td>Leica Biosystems</td><td>Modelo RM2235</td><td></td></tr><tr><td>Máquina Simoa</td> Escáner de diapositivas <td>Quanterix</td><td>HD-X</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td>AxioScan.Z1</td><td></td></tr><tr><td>SMI-32 anticuerpo IgG1 de ratón</td><td>Biolegend</td><td>801701</td><td>Detecta axones dañados</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>BioShop</td><td>7647-14-5</td><td>Se utiliza para fabricar PBS</td></tr><tr><td>Fosfato de sodio Dibásico&nbsp;</td><td>Bioshop</td><td>7558-79-4</td><td>Se utiliza para fabricar</td></tr><tr><td>pinzas de Adson estándar</td> PBS <td>Herramientas de ciencia fina</td><td>11150-10</td><td>Se utiliza para pasos de disección</td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio Superfrost Plus</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>Se utiliza para recoger secciones</td></tr><tr><td>Cortes quirúrgicos</td> difíciles <td>Herramientas de ciencia fina</td><td>14110-15</td><td>Se utiliza para cortar la columna vertebral, la pared corporal y la piel</td></tr><tr><td>Procesador de tejidos</td><td>Leica Biosystems</td><td>Modelo TP1020</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de tri-soldium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>03-04-6132</td><td>Utilizado para la recuperación de antígenos</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>BioBasic</td><td>9005-64-5</td><td>Utilizado para el lavado de secciones</td></tr><tr><td>X-P Pierce XP-100</td> junta de placa <td>Excel Scientific</td><td>12-140</td><td>Utilizado para el ensayo sNF-L</td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Fisher Chemicals</td><td>1330-20-7</td><td>Se utiliza para desparafinar y limpiar secciones</td></tr><tr><td>Embudo</td><td>Cole Parmer</td><td>RK-63100-64</td><td>Se utiliza para filtrar la formalina antes de macroscopiar el tejido</td></tr><tr><td>Placa de agitación</td><td>Cualquiera</td><td></td><td>Se utiliza para hacer soluciones</td></tr><tr><td>Horno</td><td>Cualquiera</td><td></td><td>Se utiliza para hornear secciones de papel tisú después de cortar</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>13-374-10</td><td>Se utiliza para sellar el plato de tinción LFB</td></tr><tr><td>Microondas</td><td>Cualquiera</td><td></td><td>El tiempo puede variar según el modelo de microondas</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9048-46-8</td><td>Se utiliza para hacer tampón de bloqueo</td></tr><tr><td>1,5 mL Tubos de microcentrífuga</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408--129</td><td>Se utiliza para almacenar muestras de suero de ratón</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Cualquiera</td><td></td><td>Se utiliza para preparar muestras para el ensayo sNF-L</td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>Cualquiera</td><td></td><td>Se utiliza para calentar el sustrato enzimático para el ensayo sNF-L</td></tr></tbody></table>

puntuación de la inflamación del sistema nervioso central, la desmielinización y la lesión axonal en la encefalomielitis autoinmune experimental

Scoring Central Nervous System Inflammation, Demyelination, and Axon Injury in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es un modelo común de esclerosis múltiple (EM) basado en el sistema inmunitario. Esta enfermedad puede ser inducida en roedores por inmunización activa con componentes proteicos de la vaina de mielina y adyuvante de Freund completo (CFA) o por la transferencia de células T efectoras específicas de mielina de roedores cebados con proteína de mielina/CFA a roedores naïf. La gravedad de la EAE se suele puntuar en una escala clínica de 5 puntos que mide el grado de parálisis ascendente, pero esta escala no es óptima para evaluar el grado de recuperación de la EAE. Por ejemplo, las puntuaciones clínicas siguen siendo altas en algunos modelos de EAE (p. ej., modelo de EAE inducido por péptidos de glicoproteína de oligodendrocitos de mielina [MOG]) a pesar de la resolución de la inflamación. Por lo tanto, es importante complementar el scoring clínico con el scoring histológico de EAE, que también proporciona un medio para estudiar los mecanismos subyacentes de la lesión celular en el sistema nervioso central (SNC).
Aquí, se presenta un protocolo simple para preparar y teñir secciones de la médula espinal y el cerebro de ratones y para puntuar la inflamación, la desmielinización y la lesión axonal en la médula espinal. El método de puntuación de la infiltración leucocitaria en la médula espinal también se puede aplicar para puntuar la inflamación cerebral en la EAE. También se describe un protocolo para medir la luz de neurofilamentos solubles (sNF-L) en el suero de ratones utilizando un ensayo de molécula pequeña (SIMOA), que proporciona información sobre el alcance de la lesión general del SNC en ratones vivos.

La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) sirve como modelo animal de esclerosis múltiple. En este artículo se describe un enfoque para la puntuación de la inflamación, desmielinización y lesión axonal de la médula espinal en EAE. Además, se presenta un método para cuantificar los niveles de luz de neurofilamentos solubles en el suero de ratones, lo que facilita la evaluación de la lesión axonal en ratones vivos.

Puntuación de la inflamación del sistema nervioso central, la desmielinización y la lesión axonal en la encefalomielitis autoinmune experimental

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a common immune-based model of multiple sclerosis (MS). This disease can be induced in rodents by ...

Estamos interesados en entender cómo se inicia la autoinmunidad y la esclerosis múltiple o EM. Esta investigación utiliza una variedad de enfoques para estudiar cómo los factores de riesgo asociados con la EM. Conducen al desarrollo de autoinmunidad. La encefalomielitis autoinmune experimental o EAE es un modelo murino de EM que se puede utilizar para examinar el efecto de varios factores de riesgo sobre la autoinmunidad.Recientemente hemos descubierto la vía biológica de cómo un factor de riesgo de la EM, la obesidad, conduce a una mayor inflamación autoinmune en ratones. Los estudios en el modelo EAE fueron fundamentales para desentrañar estos mecanismos. La gravedad de la enfermedad EAE a menudo se puntúa en una escala clínica de cinco puntos.Sin embargo, esta escala tiene una sensibilidad limitada y no puede distinguir si los déficits clínicos son impulsados por la inflamación o por el daño tisular. La histología de la médula espinal y el cerebro es el método de referencia para evaluar la inflamación y el daño tisular en la EAE. Este protocolo proporciona un método sencillo para medir la inflamación y el daño tisular en la médula espinal y el cerebro durante la EAE.Nuestro protocolo se puede utilizar junto con la escala clínica para caracterizar mejor la gravedad de la EAE. Nuestro protocolo mide las características histológicas clave de la EAE, incluyendo la infiltración inmunitaria, la desmielinización, el daño axonal en la médula espinal y la inflamación cerebral. También incluye la medición de la luz del neurofilamento en el suero de ratón, que indica el alcance de la lesión del SNC.Este protocolo completo proporciona una caracterización más detallada de la EAE, que utilizando un solo marcador.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video muestra la puntuación de inducción y clínicas de un modelo animal de esclerosis múltiple: las enfermedades crónico-recidivante la encefalomielitis autoinmune experimental en ratas DA. La enfermedad, inducida por la inmunización de ratas con una emulsión que contiene la médula espinal de ratas y toda adyuvante completo de Freund, presenta un cuadro clínico parecido a la enfermedad humana.

La inducción y la puntuación clínica de enfermedades crónico-recurrente encefalomielitis autoinmune experimental

Este video muestra el método para inducir encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) inyectando péptidos derivados de mielina con un adyuvante para activar las células T autorreactivas, que migran al cerebro. La toxina de la tos ferina se administra para aumentar la permeabilidad de la barrera hematoencefálica, lo que permite que estas células T y otras células inmunitarias ingresen al cerebro. Estas células inmunitarias causan desmielinización, lo que conduce a una transmisión nerviosa...

Generación de encefalomielitis autoinmune experimental en un modelo de ratón

En este video, se establece un modelo de ratón de esclerosis múltiple utilizando encefalomielitis autoinmune experimental (EAE). Al ratón se le inyecta una emulsión que contiene un péptido neuronal y un adyuvante, lo que desencadena una respuesta inmunitaria que activa las células T autorreactivas. A esto le sigue una inyección de toxina pertussis (PTX) para aumentar la permeabilidad de la barrera hematoencefálica, lo que permite que las células T autorreactivas se infiltren en el cerebro. Esta...

Inducción de encefalomielitis autoinmune experimental en un modelo de ratón

La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es un modelo animal establecido de la esclerosis múltiple. C57BL / 6 ratones se inmunizan con mielina de oligodendrocitos glicoproteína (MOG) péptido 35-55 (MOG 35-55), dando como resultado una parálisis flácida ascendente causada por las células inmunes autorreactivas en el sistema nervioso central. Se discutirán Protocolos para la inducción de la enfermedad y el seguimiento.

La mielina glicoproteína del oligodendrocito (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) Inducida por la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) en ratones C57BL / 6 ratones

Este manuscrito describe los métodos para la inducción y puntuación del modelo experimental de encefalomielitis autoinmune (EAE), junto con la evaluación de la distribución de células inmunitarias y los niveles de citocinas de ARNm en ganglios linfáticos, bazo, sangre y médula espinal mediante citometría de flujo y PCR cuantitativa, respectivamente, en varias fases de la enfermedad.

La inducción de la encefalomielitis autoinmune experimental en ratones y evaluación de la distribución de la enfermedad dependiente de las células inmunes en diversos tejidos

Aquí, presentamos los protocolos para investigar el deterioro de la unidad neurovascular durante la encefalomielitis autoinmune experimental en vivo. Específicamente abordamos cómo determinar permeabilidad de la barrera blood - brain y gelatinasa actividad involucrada en la migración de leucocitos a través de la glía INCURVATA4.

Visualizar el deterioro de las barreras endoteliales y Glial de la unidad Neurovascular durante la encefalomielitis Autoinmune Experimental In Vivo

Este manuscrito presenta un protocolo para inducir la encefalomielitis autoinmune experimental activa (EAE) en ratones. También se presenta un método para el aislamiento y caracterización de los linfocitos infiltrados en el sistema nervioso central (SNC) para mostrar cómo los linfocitos participan en el desarrollo de la enfermedad autoinmune del SNC.

Análisis citométrico de flujo de infiltración de linfocitos en el sistema nervioso central durante la encefalomielitis autoinmune experimental

El presente protocolo describe la inducción de encefalomielitis autoinmune experimental en un modelo de ratón utilizando glicoproteína oligodendrocitos de mielina y monitoreando el proceso de la enfermedad utilizando un sistema de puntuación clínica. Los síntomas experimentales relacionados con la encefalomielitis autoinmune se analizan mediante análisis de tomografía microcomputarizada de fémur de ratón y prueba de campo abierto para evaluar el proceso de la enfermedad de manera integral.

Inducción y diversos indicadores de evaluación de la encefalomielitis autoinmune experimental

Hasta la fecha, los protocolos para el aislamiento simultáneo de todos los principales tipos de células residentes en el sistema nervioso central del mismo ratón son una demanda insatisfecha. El protocolo muestra un procedimiento aplicable en ratones con encefalomielitis autoinmune naïve y experimental para investigar redes celulares complejas durante la neuroinflamación y, al mismo tiempo, reducir el número de ratones requerido.

Aislamiento simultáneo de los principales tipos de células residentes en el sistema nervioso central de ratones adultos con encefalomielitis autoinmune

La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es un modelo animal de esclerosis múltiple (EM), que comparte con la enfermedad humana una respuesta autoinmune humoral robusta. En este trabajo presentamos un protocolo ELISA sencillo y flexible para cuantificar autoanticuerpos en el suero de ratones inmunizados con EAE.

Cuantificación de anticuerpos autorreactivos en ratones tras encefalomielitis autoinmune experimental

Aprende a evaluar inflamación, desmielinización y daño axonal en la encefalomielitis autoinmune experimental usando histología y niveles de neurofilamento ligero en suero. Este protocolo mejora la caracterización de la patología de la EM.

Puntuación de la inflamación del sistema nervioso central, la desmielinización y la lesión axonal en la encefalomielitis autoinmune experimental (Video) | JoVE Journal

Puntuación de la inflamación del sistema nervioso central, la desmielinización y la lesión axonal en la encefalomielitis autoinmune experimental

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