Name: Reprogramación del adenocarcinoma ductal de páncreas a pluripotencia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Aprende a reprogramar células de adenocarcinoma ductal de páncreas a células madre pluripotentes inducidas usando lentivirus. Este protocolo establece líneas iPSC estables para estudiar la progresión del cáncer pancreático.

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A.S y J.K desean agradecer a Cancer Research UK y OHSU por su financiación (Premio al proyecto CRUK-OHSU C65925/A26986). A.S cuenta con el apoyo de un premio de desarrollo profesional del MRC (MR/N024028/1). A.A está financiado por una beca de doctorado (Beca ref. 1078107040) de la Ciudad Rey Abdulaziz para la Ciencia y la Tecnología. J.K está financiado por la Subvención para Nuevos Investigadores de MRF (GCNCR1042A) y la Subvención Knight CEDAR (68182-933-000, 68182-939-000). Agradecemos al Prof. Keisuke Kaji por proporcionar amablemente el vector de reprogramación pSIN4-EF1a-O2S y pSIN4-CMV-K2M. A los efectos del acceso abierto, el autor ha aplicado una licencia Creative Commons Attribution (CC BY) a cualquier versión del Manuscrito Aceptado por el Autor que surja de esta presentación.

Reprogramación de PDAC y células pancreáticas en células madre pluripotentes inducidas

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Con el fin de facilitar el uso de la reprogramación de iPSC para estudiar la progresión del cáncer, se ha establecido un protocolo sólido para la reprogramación de células de cáncer de páncreas. La reprogramación de las células cancerosas en pluripotencia ha demostrado ser muy difícil hasta ahora, ya que solo unos pocos estudios han generado con éxito iPSC a partir de células cancerosas 32,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46 . La mayoría de estos estudios utilizaron líneas celulares cancerosas inmortalizadas para generar líneas iPSC, no células primarias derivadas del paciente 36,37,38,40,42,43,44,46. Por ejemplo, se intentó reprogramar cuatro líneas celulares diferentes de cáncer de hígado utilizando la introducción retroviral de factores OSKM, pero solo una sola línea celular se reprogramó con éxito41. Sin embargo, la línea iPSC de cáncer de hígado generada mostró una pérdida de stemness después de algunos pasos, destacando la alta resistencia de las células cancerosas a la reprogramación de OSKM41. Anteriormente, se intentó reprogramar las células PDAC utilizando la administración lentiviral de OSKM individualmente; sin embargo, solo se generó una única línea de iPSC, dependiente de la expresión exógena de OSKM y, por lo tanto, no completamente reprogramada37. Otro estudio utilizó vectores episomales para administrar factores OSKM sin integración genómica, pero solo logró generar un único clon de iPSC a partir de PDAC39. El éxito limitado en la reprogramación de células cancerosas se suma a los muchos desafíos que obstaculizan el uso de la tecnología iPSC en la investigación del cáncer.
Aquí, se explica la generación de iPSCs a partir de muestras primarias de PDAC derivadas de dos pacientes diferentes y una línea celular de PDAC establecida (BxPc3). Además, también se han generado iPSCs a partir de H6c7, una línea celular epitelial ductal pancreática. Hasta donde sabemos, este es el primer informe de líneas iPSC estables derivadas con éxito de BxPc3 y H6c7. Siguiendo este protocolo, las iPSC también se han generado con éxito a partir de fibroblastos humanos primarios derivados de individuos sanos, ampliando la aplicabilidad del método más allá de la investigación del cáncer.
Uno de los elementos clave detrás del éxito del protocolo es el uso de vectores lentivirales bicistrónicos para coexpresar los factores de SG y KM. Estos vectores contienen el sitio de entrada interno del ribosoma 2 (IRES2) para expresar OCT4 y SOX2 en un vector y KLF4 y cMYC en el otro. Múltiples estudios que utilizan vectores monocistrónicos en los que cada factor de reprogramación se administró individualmente han demostrado que la captación de cada vector es diferente, lo que afecta a la estequiometría OSKM y a la eficiencia de la reprogramación47. El uso de vectores bicistrónicos puede ayudar a mitigar este problema. Además, el uso de IRES en vectores lentivirales ha mostrado un aumento significativo en la eficiencia de reprogramación48. En este sistema lentivirus, la expresión de SG es impulsada por el promotor EF1a, mientras que la expresión de KM está bajo el control de un promotor de CMV. Se sabe que el promotor del CMV puede ser sometido a un silenciamiento altamente eficiente por metilación del ADN y desacetilación de histonas, a diferencia de EF1a49,50. Por lo tanto, el silenciamiento temprano de la KM antes de la OS durante la reprogramación puede ser un factor clave para el éxito del protocolo. Esto es consistente con estudios previos que muestran la importancia de la dinámica de expresión de OSKM durante la reprogramación 51,52,53,54,55. Por lo tanto, el vector bicistrónico también es más ventajoso que el vector policistrónico, donde todos los factores OSKM se expresan a partir de un solo promotor56. Otros factores que contribuyen al éxito del protocolo son las dosis de infección por lentivirus y el número de células infectadas utilizadas para la reprogramación, que se personalizaron para cada tipo de célula.
En resumen, se presenta un método optimizado para reprogramar células PDAC primarias junto con otras líneas celulares y células normales. Este método ayudará a ampliar el uso de la reprogramación de iPSC para modelar la progresión del cáncer y, en este caso, descubrir biomarcadores tempranos de PDAC.

El adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC, por sus siglas en inglés) es una de las neoplasias malignas más mortales, y el diagnóstico precoz sigue siendo un reto debido a la naturaleza asintomática de la enfermedad. La mayoría de los pacientes con PDAC son diagnosticados en el estadio metastásico avanzado, cuando se dispone de opciones de tratamiento muy limitadas 1,2. Esto se debe principalmente a la falta de biomarcadores fiables para las primeras etapas, como los que podrían detectarse convenientemente como proteínas liberadas en el torrente sanguíneo.
El PDAC puede diseminarse muy temprano durante su progresión, y un mejor pronóstico se ha relacionado con la detección temprana del cáncer cuando el PDAC se localiza en el páncreas3. Sin embargo, menos de una décima parte de los pacientes con PDAC son diagnosticados con un pronóstico favorable, lo que permite la resección quirúrgica. No obstante, los pocos con tumores resecables también son propensos a la recurrencia tumoral dentro de los 12 meses4.
En las últimas cinco décadas, se han logrado mejoras notables en las técnicas quirúrgicas, la atención al paciente y las modalidades de tratamiento 5,6. Sin embargo, la tasa de supervivencia a 5 años en pacientes con PDAC resecados quirúrgicamente apenas ha aumentado al 17%. Sin embargo, sigue siendo mejor que la de los pacientes no resecados, que se ha mantenido casi sin cambios (0,9%)4,7. La quimioterapia es el único otro tratamiento alternativo para el PDAC. Sin embargo, esta opción es muy limitada, ya que la gran mayoría de los pacientes con PDAC presentan una fuerte resistencia a los medicamentos quimioterápicos como la gemcitabina 7,8. Otros fármacos, como el erlotinib, solo están disponibles para un pequeño grupo de pacientes con PDAC con mutaciones específicas, la mayoría de los cuales muestran resistencia al erlotinib9. Los efectos secundarios adversos asociados a la quimioterapia en la mayoría de los pacientes con PDAC son otra desventaja de este tratamiento10. Recientemente, estrategias prometedoras han demostrado que los inhibidores de puntos de control inmunitario (ICI) y los inhibidores de la quinasa de molécula pequeña (SMKI) pueden ser eficaces en el tratamiento de la PDAC, pero las respuestas duraderas a estas terapias dirigidas siguen estando limitadas a una minoría de pacientes11,12. En general, el descubrimiento de biomarcadores tempranos específicos de PDAC puede allanar nuevas vías para el diagnóstico y el tratamiento tempranos.
El PDAC se desarrolla a partir de lesiones precursoras de neoplasias intraepiteliales pancreáticas (PanIN) que resultan de proliferaciones epiteliales no invasivas del conducto pancreático13,14. Si bien la formación de PanIN se inicia por mutaciones oncogénicas como KRAS, se requieren alteraciones genéticas y epigenéticas adicionales para la progresión a PDAC. Se ha proyectado que la progresión de la PanIN a través de las diferentes etapas hasta el PDAC invasivo tarda unos 10 años 13,15,16,17. Este período de tiempo ofrece una gran oportunidad para beneficiarse del diagnóstico precoz de PDAC. Por lo tanto, se ha llevado a cabo una amplia investigación para establecer modelos animales de xenoinjertos tumorales y cultivos de organoides para estudiar la progresión de PDAC 18,19,20,21. Estos modelos han sido muy útiles para estudiar las etapas invasivas de PDAC, aunque no la transición de las fases tempranas de PanIN. Por lo tanto, es importante desarrollar modelos experimentales que puedan recapitular la progresión temprana de las etapas de PanIN para permitir el descubrimiento de biomarcadores de detección temprana.
La reprogramación de células somáticas en células madre pluripotentes inducidas (iPSC) utilizando los cuatro factores de transcripción OCT4, SOX2, KLF4 y c-MYC (OSKM) ha ilustrado el alcance de la plasticidad celular22. La plasticidad de las células cancerosas ha sido bien documentada, y la reprogramación de células cancerosas humanas en iPSC se ha utilizado con éxito para restablecer las células a su estado celular original, eliminando muchas de las agresiones epigenéticas que se han acumulado durante la progresión del cáncer 23,24,25,26,27,28,29. Por lo tanto, la posibilidad de utilizar esta estrategia de reprogramación para manipular la identidad de las células cancerosas ha sido muy prometedora en el tratamiento del cáncer30,31. De hecho, hemos demostrado previamente que la diferenciación de las iPSCs derivadas de las PDACs puede recapitular la progresión de las PDAC a través de las primeras etapas de PanIN32. Mediante la identificación de genes y vías específicas de las etapas tempranas e intermedias del PDAC, se identificaron biomarcadores candidatos que pueden ser utilizados clínicamente para el diagnóstico precoz del PDAC32,33. Sin embargo, los biomarcadores descubiertos utilizando una sola línea de iPSC mostraron una cobertura limitada en la mayoría de los pacientes con PDAC32. Los desafíos de generar líneas de iPSC a partir de otros pacientes con PDAC han detenido la capacidad de descubrir biomarcadores más confiables. Esto se debe a muchos factores técnicos, incluida la heterogeneidad de la administración de OSKM, ya que solo una pequeña parte de las células PDAC primarias humanas contenían los cuatro factores y respondieron con éxito a la reprogramación. Aquí, se presenta un protocolo detallado para la reprogramación de células PDAC primarias utilizando una administración lentiviral dual más eficiente y consistente de OSKM.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoetanol (50 mM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 antihumano TRA-1-60-R</td><td>BioLegend</td><td>330613</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de hipófisis bovina (BPE)</td><td>Thermo Fisher</td><td>13028014</td><td></td></tr><tr><td>BxPc3</td><td>ATCC</td><td>CRL-1687</td><td></td></tr><tr><td>Toxina del cólera de Vibrio cholerae</td><td>Merck&nbsp;</td><td>C8052-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno, solución de tipo I de cola de rata</td><td>Merck&nbsp;</td><td>C3867</td><td></td></tr><tr><td>Finalización de K-SFM Defined K-SFM</td><td>Thermo Fisher</td><td>&nbsp; 10744-019</td><td></td></tr><tr><td>Placas de pocillos múltiples tratadas con TC de Corning Costar Merck</td><td>&nbsp;</td><td></td><td></td>CLS3516</tr><tr><td>Filtros de jeringa Corning</td><td>Merck&nbsp;</td><td></td><td></td>CLS431231</tr><tr><td>Placas de cultivo tratadas con cultivo de tejidos de Corning</td><td>Merck&nbsp;</td><td></td><td></td>CLS430599</tr><tr><td>Día Impex&nbsp; Virkon Desinfectante Tabletas Virucidas</td><td>Thermo Fisher</td><td>12328667</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime; s Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Merck&nbsp;</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Suero de becerro fetal (FCS)&nbsp;</td>Reactivo de transfección <td>Thermo Fisher</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Fugene HD&nbsp;</td><td>Promega&nbsp;</td><td>&nbsp; E2312</td><td></td></tr><tr><td>Solución de gelatina, Tipo B, 2% en H2O</td><td>Merck&nbsp;</td><td>G1393-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Glasgow Medios Esenciales Mínimos (GMEM)</td><td>Merck&nbsp;</td><td>G5154</td><td></td></tr><tr><td>Proteína recombinante de EGF humano</td><td>Thermo Fisher</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>FGF humano básico (FGF-2/bFGF) (154 aa) Proteína recombinante, PeproTech</td><td>Thermo Fisher</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Línea celular epitelial del conducto pancreático humano (H6c7)</td><td>Kerafast</td><td>ECA001-FP</td><td></td></tr><tr><td>Células alimentadoras iMEF&nbsp;</td><td>iXcells Biotechnologies</td><td>10MU-001-1V</td><td></td></tr><tr><td>Medios libres de suero de queratinocitos (KSFM)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>17005-042</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut DMEM&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut sérum de reemplazo&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina (200 mM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>MEM Solución de Aminoácidos No Esenciales (100x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Millex-HP 0,45 &mu; Unidad de filtro de jeringa M (estéril)</td><td>Merck&nbsp;</td><td></td><td></td>SLHP033RS</tr><tr><td>Opti-MEM Suero Reducido Medio&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>pMDG&nbsp;</td><td>AddGene</td><td>187440</td><td></td></tr><tr><td>Polibreno (bromuro de hexadimetrina)&nbsp;</td><td>Merck&nbsp;</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr><tr><td>pSIN4-CMV-K2M&nbsp;</td><td>AddGene</td><td>21164</td><td></td></tr><tr><td>pSIN4-EF2-O2S&nbsp;</td><td>AddGene</td><td>21162</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>AddGene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>pWPT-GFP&nbsp;</td><td>AddGene</td><td>12255</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medio (modificación ATCC)</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1049101</td><td></td></tr><tr><td>Sodym Pyruvate</td><td>Thermo Fisher</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>Jeringas estériles de un solo uso (60 mL)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>15899152</td><td></td></tr><tr><td>Enzima TrypLE Express (1x), rojo de fenol</td><td>Thermo Fisher</td><td>12605036</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td><td>Thermo Fisher</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 (diclorhidrato)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72304</td><td></td></tr></tbody></table>

reprogramación del adenocarcinoma ductal de páncreas a pluripotencia

Reprogramming Pancreatic Ductal Adenocarcinoma to Pluripotency

La generación de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) utilizando factores de transcripción se ha logrado a partir de casi cualquier tipo de célula diferenciada y ha demostrado ser muy valiosa para la investigación y las aplicaciones clínicas. Curiosamente, se ha demostrado que la reprogramación iPSC de las células cancerosas, como el adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC), revierte el fenotipo invasivo de PDAC y anula el epigenoma del cáncer. La diferenciación de las iPSC derivadas de PDAC puede recapitular la progresión de PDAC a partir de su precursor temprano de la neoplasia intraepitelial pancreática (PanIN), revelando los cambios moleculares y celulares que ocurren temprano durante la progresión de PDAC. Por lo tanto, las iPSC derivadas de PDAC se pueden utilizar para modelar las primeras etapas de PDAC para el descubrimiento de marcadores de diagnóstico de detección temprana. Esto es particularmente importante para los pacientes con PDAC, que generalmente se diagnostican en las etapas metastásicas tardías debido a la falta de biomarcadores confiables para las etapas anteriores de PanIN. Sin embargo, la reprogramación de líneas celulares cancerosas, incluida la PDAC, en pluripotencia sigue siendo un desafío, requiere mucha mano de obra y es muy variable entre las diferentes líneas. Aquí, describimos un protocolo más consistente para generar iPSCs a partir de varias líneas celulares PDAC humanas utilizando vectores lentivirales bicistrónicos. Las líneas de iPSC resultantes son estables, no mostrando dependencia de la expresión exógena de factores de reprogramación o fármacos inducibles. En general, este protocolo facilita la generación de una amplia gama de iPSCs derivadas de PDAC, lo cual es esencial para descubrir biomarcadores tempranos que sean más específicos y representativos de los casos de PDAC.

En la Figura 1 se muestran imágenes representativas que muestran la morfología de las colonias de iPSC derivadas de las células PDAC, BXPc3, H6C7 y hFib. Las colonias PDAC-iPSC comenzaron a formarse el día 25 de la reprogramación. En el día 40 de la reprogramación se identificaron colonias robustas de iPSC con una morfología similar a la de ESC más establecida (Figura 1). Del mismo modo, la formación de BxPc3-iPSCs comenzó el día 23 y se estableció más en el día 35. La formación de H6C7-iPSC fue similar a la de PDAC-iPSC y comenzó a establecerse en el día 45. Las colonias de hFib-iPSC comenzaron a formarse el día 15 de la reprogramación.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65811/65811fig1.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14px;"> Figura 1: Imágenes representativas de colonias de iPSC. Las imágenes muestran una morfología establecida similar a la de hESC derivada de (A) PDAC, (B) BxPc3, (C) H6c7 y (D) hFib. Los días de reprogramación se indican encima de cada imagen. Barras de escala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65811/65811fig1large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 
Se establecieron líneas clonales de iPSC a partir de cada reprogramación de las células PDAC, BxPc3, H6C7 y hFib. Todas las líneas de iPSC establecidas dieron positivo para TRA-1-60, un marcador indiferenciado de la superficie celular de las células ESC, lo que confirma su reprogramación a pluripotencia (Figura 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65811/65811fig2.jpg"> Figura 2: Imágenes representativas de líneas clonales de iPSC. Las imágenes se derivan de (A) PDAC, (B) BxPc3, (C) H6c7 y (D) hFib que muestran una morfología similar a la de ESC (paneles superiores) y tinción positiva para TRA-1-60 (panel inferior). Barras de escala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65811/65811fig2large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

El presente protocolo describe la reprogramación del adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) y las células epiteliales ductales pancreáticas normales en células madre pluripotentes inducidas (iPSC). Proporcionamos un procedimiento optimizado y detallado, paso a paso, desde la preparación de lentivirus hasta el establecimiento de líneas estables de iPSC.

Reprogramación del adenocarcinoma ductal de páncreas a pluripotencia

The generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) using transcription factors has been achieved from almost any differentiated cell type and has ...

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