Aislamiento optimizado de núcleos a partir de muestras de tumores sólidos frescos y congelados para la secuenciación multioma
13 de octubre de 2023
El protocolo proporciona un enfoque fiable y optimizado para el aislamiento de núcleos de muestras de tumores sólidos para la secuenciación multioma utilizando la plataforma 10x Genomics, que incluye recomendaciones para las condiciones de disociación de tejidos, la criopreservación de suspensiones unicelulares y la evaluación de núcleos aislados.
A medida que crece nuestro conocimiento de la biología tumoral y nuestro interés por comprender las complejidades de cómo las células interactúan dentro del tumor e influyen en los resultados de los pacientes, también ha aumentado la importancia de analizar células heterogéneas en todo el microambiente tumoral. La secuenciación multioma, que permite la adquisición de ARN de una sola célula y la secuenciación de ataque de la misma célula en forma de célula pareada, supone un avance significativo en este sentido. Sin embargo, la calidad de los datos obtenidos de estos experimentos depende en gran medida de la calidad de las condiciones experimentales y del material biológico introducido.
Este protocolo proporciona un enfoque fiable y optimizado para el aislamiento de núcleos de muestras de tumores sólidos para la secuenciación multioma utilizando la plataforma 10x Genomics. Este protocolo es fiable utilizando suspensiones unicelulares frescas o congeladas. Proporcionamos recomendaciones para las condiciones de disociación de tejidos, la criopreservación de suspensiones unicelulares y la evaluación de núcleos aislados.
En este protocolo, utilizamos muestras de adenocarcinoma ductal pancreático humano, que son un tipo de foco de tejido primario en nuestro laboratorio. El cáncer de páncreas representa un tipo de tumor altamente desmoplásico, que presagia tejido y células relativamente pegajosas. Además, dado que los especímenes de tumores pancreáticos disponibles para la investigación también tienden a ser relativamente pequeños, se realizan esfuerzos para maximizar la cantidad de células capturadas.
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Visión general
Este protocolo describe un método confiable y optimizado para aislar núcleos de especímenes de tumores sólidos para secuenciación multi-om usando la plataforma de 10x Genomics. Incluye recomendaciones para condiciones de disociación de tejido y criopreservación de suspensiones de células individuales.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Oncología
- Genómica
Antecedentes
- Entender la biología del tumor es crucial para mejorar los resultados de los pacientes.
- Analizar células heterogéneas en el microambiente tumoral es cada vez más importante.
- La secuenciación multi-om permite la adquisición combinada de secuenciación de ARN y ATAC de células individuales.
- La calidad de los datos depende altamente de las condiciones experimentales y el material biológico.
Propósito del estudio
- Proporcionar un protocolo confiable para aislar núcleos de tumores sólidos.
- Mejorar la calidad de los datos de secuenciación multi-om.
- Facilitar el análisis de microambientes tumorales.
Métodos utilizados
- Aislamiento de núcleos de especímenes de tumores sólidos.
- Uso de suspensiones de células individuales frescas o congeladas.
- Recomendaciones para condiciones de disociación de tejido.
- Técnicas de criopreservación para suspensiones de células individuales.
Resultados principales
- Se estableció un enfoque optimizado para el aislamiento de núcleos.
- Se obtuvieron resultados confiables tanto de muestras frescas como congeladas.
- Se mejoró la calidad de los datos para secuenciación multi-om.
- Se proporcionaron pautas para el procesamiento de tejidos y la criopreservación.
Conclusiones
- El protocolo mejora la confiabilidad del aislamiento de núcleos de los tumores.
- Apoya el avance de las técnicas de secuenciación multi-om.
- Estudios futuros pueden beneficiarse de condiciones experimentales mejoradas.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Optimized nuclei isolation from solid tumor specimens is critical for generating high-quality multiome sequencing data, directly impacting the reliability of tumor heterogeneity analyses in translational oncology. This protocol addresses the challenge of extracting intact nuclei from both fresh and frozen desmoplastic tumor tissues, supporting robust single-cell multiomic profiling. Reliable nuclei preparation at this stage enhances predictive confidence in downstream discovery and biomarker development pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables high-fidelity interrogation of tumor cell heterogeneity at the single-cell level.
- Supports functional target validation by preserving diverse cell populations during isolation.
- Facilitates mechanistic de-risking through accurate representation of the tumor microenvironment.
Screening & Assay Development
- Provides standardized nuclei preparations for reproducible multiome sequencing assays.
- Ensures quantitative and qualitative consistency in input material for downstream workflows.
- Improves assay readiness by accommodating both fresh and cryopreserved tumor samples.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker discovery by enabling paired RNA and chromatin accessibility profiling.
- Maintains disease relevance by capturing the complexity of solid tumor microenvironments.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by standardizing input quality.
Pipeline & Workflow Integration
This nuclei isolation protocol is positioned at the interface of tissue processing and multiomic data generation, bridging early discovery and translational research workflows.
- Discovery Biology: Maximizes hypothesis testing power by preserving cell diversity and integrity.
- Screening: Delivers reproducible, high-quality nuclei for scalable multiome sequencing assays.
- Analytics: Enables robust quantitative readouts for comparing tumor cell states and chromatin landscapes.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment by supporting paired single-cell RNA and ATAC-seq analyses.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, adaptable protocol for diverse solid tumor types and sample conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in tumor biology and target validation studies.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability across fresh and frozen tumor samples.
- Strategic Value: Reduces risk of data loss or artifact introduction at the sample preparation stage.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement of oncology discovery and translational programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissociation and nuclei handling for optimal yield and quality.
- Demands access to specialized reagents, cell strainers, and quantitative assessment tools.
- Necessitates cross-team standardization of digestion and lysis conditions for reproducibility.
- Must be adapted for varying tumor types and sample sizes, especially for desmoplastic tissues.
- Careful monitoring of nuclear integrity is essential to avoid downstream sequencing artifacts.
