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Artículo de método

Modelo de isquemia-reperfusión renal bilateral para la lesión renal aguda en ratones

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DOI:

10.3791/65838

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2 de febrero de 2024

 ,  ,  ,  , 
1Kidney Disease Center, the First Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 2International Institute of Medicine, The Fourth Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine

Autores correspondientes: Weiqiang Lin <wlin@zju.edu.cn>, Fei Han <hanf8876@zju.edu.cn>

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

El modelo de lesión por isquemia-reperfusión (IRI) se puede utilizar en diferentes etapas del desarrollo de la lesión renal aguda (IRA), especialmente durante la progresión de la LRA a la enfermedad renal crónica (ERC). Aquí, describimos el procedimiento para el desarrollo del modelo IRI en ratones a través de un abordaje transabdominal, pinzando pedículos renales a través de un clip vascular para inducir lesión isquémica.

Resumen

La lesión renal aguda (IRA) se define como un rápido deterioro de la función renal, en el que la disfunción renal persistente progresa gradualmente a enfermedad renal crónica (ERC) debido a la pérdida irreversible de nefronas y su reparación desadaptativa. En los últimos años, la incidencia de LRA ha ido en aumento en diversas etiologías, incluyendo la depleción de volumen, la sepsis, la nefrotoxicidad, la lesión muscular y el traumatismo mayor, en el que la lesión por isquemia-reperfusión (IRI) representa la mayoría de los episodios. El desarrollo del modelo IRI en ratones es inducido por el pinzamiento quirúrgico de los pedículos renales, lo que proporciona herramientas potentes y controlables para los modelos preclínicos de LRA. Es importante destacar que el modelo IRI se despliega en diferentes etapas del desarrollo de AKI, especialmente en los procesos de AKI a CKD. A pesar de que el modelo IRI está ampliamente practicado en muchos laboratorios, una serie de variables siguen influyendo en los resultados de este modelo. Aquí, describimos el procedimiento de desarrollo del modelo IRI para proporcionar un método repetible y confiable para que los investigadores exploren la patogénesis subyacente en el desarrollo de LRA y la progresión de LRA a ERC.

Introducción

La lesión renal aguda (IRA) es un síndrome clínico grave con una morbilidad y mortalidad significativas, definida como un aumento de la creatinina sérica de ≥ 0,3 mg/dl (26,5 μM/l) en 48 h o un aumento de la creatinina sérica hasta ≥ 1,5 veces el basal en un plazo de 7 días, o un volumen de orina < 0,5 mL/kg/h durante 6 h1, 2,3. A pesar de décadas de investigación, no existe una terapia eficaz para la LRA que alivie el daño renal o acelere la recuperación renal, y una proporción considerable de pacientes con LRA progresa a enfermedad renal crónica (ERC)4,5,6. Las moléculas y vías complejas están implicadas en parte en la LRA y en su progresión, por lo que los modelos preclínicos proporcionan herramientas poderosas para desentrañar estas complejidades para el desarrollo de modalidades terapéuticas eficientes.

Clínicamente, la lesión por isquemia-reperfusión (IRI) es la principal causa de LRA en diversas afecciones, incluyendo cirugías cardíacas y hepáticas, shock circulatorio, depleción de volumen, sepsis, oclusión u obstrucción vascular renal, trasplante renal,etc. 7. El modelo de ratón IRI-AKI ha estado en uso desde la década de 1960; Este modelo se desarrolló mediante pinzamiento quirúrgico de los pedículos renales con pinzamientos no traumáticos en ratones que condujeron a isquemia y seguido de reperfusión del flujo sanguíneo renal mediante la eliminación de los pinzamientos. El modelo IRI-LRA se caracteriza típicamente por muerte de células tubulares renales y daño progresivo del tejido renal. El IRI es uno de los modelos más utilizados para la patogenia y la intervención terapéutica en la LRA por varias razones: (1) La simplicidad y seguridad del procedimiento quirúrgico mejoran la tasa de supervivencia y la tasa de éxito del modelo IRI-LRA8; (2) Dado que la isquemia es una etiología importante en la LRA humana, el modelo IRI-LRA se utiliza mejor para evaluar el evento clínico de LRA9; (3) El modelo IRI podría presentar lesión renal y cambios histopatológicos en diferentes estadios de la LRA, lo que también es aplicable al estudio de la progresión de LRA a ERC10. Dependiendo del diseño experimental, los modelos de LRA inducida por IRI incluyen IRI bilateral, IRI unilateral con riñón contralateral intacto e IRI unilateral con nefrectomía contralateral simultánea. En particular, el modelo de IRI bilateral se considera más relevante para las condiciones patológicas humanas de LRA porque ambos riñones han sido afectados por el suministro de sangre11. El modelo IRI es aplicable para simular los efectos de la reducción del flujo sanguíneo renal después de un trasplante renal, un bypass cardíaco, una cirugía renal vascular o conservadora de nefronas, así como en el contexto de la hipotensión9. Aquí, describimos el procedimiento para un modelo de IRI bilateral para proporcionar un método consistente y confiable para que los investigadores exploren la patogénesis subyacente en la LRA inducida por isquemia.

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Protocolo

Se utilizaron ratones machos C57BL/6J de 8 semanas de edad y 25 g de peso para establecer el modelo de LRA mediante isquemia-reperfusión bilateral. De acuerdo con estudios previos, mantenemos la temperatura corporal en torno a 36,5 °C-37 °C, y la duración de la isquemia renal es de 30 min en la cirugía IRI12,13. Se necesitaron un total de 6 ratones para cada grupo, y los ratones operados simuladamente sirvieron como controles. Los experimentos con animales en este estudio han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Zhejiang para proteger el bienestar de los animales. Todos los procedimientos de investigación con animales se llevaron a cabo siguiendo las directrices y principios éticos de la Universidad de Zhejiang.

1. Preparación preoperatoria

  1. Esterilizar a alta presión todo el instrumental quirúrgico.
  2. Prepare la solución anestésica añadiendo 2 mL de ketamina y 0,4 mL de xilacina en 7,6 mL de solución salina estéril. Anestesiar al ratón con una mezcla de ketamina (80 mg/kg) y xilacina (16 mg/kg) mediante inyección intraperitoneal. Evalúe la profundidad anestésica usando el reflejo de pellizco de los dedos del pie.
  3. Coloque el ratón anestesiado sobre la manta homeotérmica para asegurarse de que sus vías respiratorias permanezcan sin obstrucciones. Mantenga la temperatura corporal en el rango de 36,5-37 °C.
  4. Cubra los ojos del ratón con ungüento ocular de clorhidrato de tetraciclina al 1% para evitar la sequedad mientras está bajo anestesia.
  5. Afeitar el vello del abdomen con una cortadora de pelo y limpiar la piel de la zona quirúrgica con una solución de povidona yodada para 3x.

2. Cirugía

  1. Realice una incisión en la mediana abdominal de aproximadamente 1-1,5 cm con unas tijeras quirúrgicas a través de la capa de piel y músculo y abra la cavidad abdominal con un separador.
  2. Exponga el riñón moviendo la grasa retroperitoneal y empujando los intestinos y otros órganos hacia el fuera de juego con un hisopo de algodón. El riñón se encuentra en el espacio retroperitoneal, alrededor de 0,5 cm lateral a la columna vertebral, y por debajo de la13ª costilla.
  3. Diseccionar el pedículo renal con pinzas finas y puntiagudas para separar y eliminar la fascia y el tejido adiposo y exponer los pedículos renales izquierdos.
  4. Pinzar los pedículos renales con una pinza vascular con pinzas de sujeción y asegurarse de que el daño vascular sea lo menor posible. Evite pinzar la grasa redundante del seno renal, que puede provocar isquemia renal incompleta.
  5. Establezca la duración de la isquemia renal, comenzando con el pinzamiento durante 30 min. La característica de la isquemia exitosa es que el riñón cambia gradualmente de rojo a púrpura oscuro en unos pocos minutos.
  6. Mover el riñón hacia el espacio retroperitoneal. Repita el procedimiento en el lado contralateral para exponer y sujetar los pedículos renales derechos.
  7. Registre el tiempo de isquemia en cada lado por separado para asegurarse de que ambos riñones reciban la duración exacta de la isquemia. Vuelva a abrir la incisión y suelte el clip vascular al final de la duración de la isquemia.
  8. Reemplace el riñón en el espacio retroperitoneal y luego suture el músculo y la piel capa por capa con la sutura Vicryl 4-0.
    NOTA: Los procedimientos quirúrgicos deben realizarse en condiciones estériles. Limpie la mesa quirúrgica y los instrumentos con etanol al 75% durante la operación cuando sea necesario.

3. Cuidados postoperatorios

  1. Administrar 0,5-1 mL de suero fisiológico tibio y estéril mediante inyección intraperitoneal para compensar la pérdida de líquido.
  2. Mantenga la decúbito esternal con atención hasta que el ratón haya recuperado la conciencia suficiente. Coloque al ratón en la manta homeotérmica hasta que recupere la plena conciencia, luego regrese a su jaula. No devuelva el ratón a la compañía de otros animales hasta que esté completamente recuperado.
  3. Administre buprenorfina 0,05-0,10 mg/kg cada 12 h durante los 3 primeros días para aliviar el dolor postquirúrgico. Monitoree los ratones quirúrgicos todos los días.

4. Evaluación del modelo

  1. Tinción con hematoxilina-eosina (HE)
    1. Eutanasiar a los animales con pentobarbital sódico por inyección intraperitoneal en los días 1, 3, 7 o 14 después de la IRI.
    2. Fije los tejidos renales frescos con paraformaldehído (PFA) al 4% durante la noche y almacene en etanol al 75% a 4 °C.
    3. Después de la deshidratación y la inclusión, corte las muestras obtenidas en un espesor de 8 μm para teñirlas.
    4. Desparafinar las secciones de tejido en xileno y luego rehidratar con concentraciones decrecientes de etanol.
    5. Teñir las secciones de tejido con hematoxilina y eosina.
    6. Deshidratar las secciones de tejido aumentando las concentraciones de etanol y xileno.
  2. Ensayo de función renal
    1. Recoja muestras de sangre utilizando el método de recolección de sangre del globo ocular después de la anestesia.
    2. Centrifugar las muestras de sangre a 12000 x g durante 10 min para separar el suero.
    3. Determine la creatinina sérica y el nitrógeno ureico en sangre (BUN) mediante el analizador automático de química seca para controlar la función renal.
  3. PCR en tiempo real (RT-PCR)
    1. Extraiga el ARN total de los tejidos renales utilizando un kit de extracción rápida de ARN y, a continuación, sintetice el ADNc con un kit de mezcla de transcriptasa inversa. Realice RT-PCR con el kit de premezcla verde SYBR y ejecútelo en el instrumento RT-PCR. Las secuencias de cebadores utilizadas aquí se informaron antes de14: KIM1 adelante, 5'-GCTGCTACTGCTCCTTGTGA-3'; reverso 5'-GGAAGGCAACCACGCTTAGA-3'; NGAL delantero, 5'-GGCCAGTTCACTCTGGGAAA-3; reverso 5'- TGGCGAACTGGTTGTAGTCC-3'; GAPDH delantero, 5'-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3'; reverso 5'-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3'.

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Resultados

Estado del riñón durante la cirugía

La característica de la isquemia exitosa es que el riñón cambia gradualmente de rojo a púrpura oscuro en 1-2 minutos, y la reperfusión exitosa se caracteriza por el cambio gradual del riñón de púrpura oscuro a rojo en 1-2 minutos.

Histología del riñón después de la cirugía

La HE y la tinción de Schiff con ácido peryódico (PAS) son las formas directas de verificar la les...

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Discusión

En este trabajo hemos realizado un procedimiento detallado sobre el modelo de IRI renal, destacando posteriormente que es un modelo robusto para la progresión de LRA e LRA a ERC. Además, demostramos el impacto de los dos criterios principales de la lesión renal, incluida la histología y la función renal.

Es necesario enfatizar varios puntos clave en los procedimientos quirúrgicos para un modelo repetible y confiable. Para la cirugía abdominal, se recomienda un...

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Divulgaciones

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

Expresamos nuestro agradecimiento a todos los participantes por su colaboración en el presente estudio. Este estudio contó con el apoyo financiero de la Fundación Provincial de Ciencias Naturales de Zhejiang de China (LZ22H050001) y el programa provincial de Zhejiang para el cultivo de talentos innovadores de alto nivel en salud para Weiqiang Lin.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Cortapelos de animalesFEIYUBIO19-7002
Jeringas de 1 mlLongreenSR60061
EtanolMacklin E885996
gasaFEIYUBIO19-5022
Sistema de monitor homeotérmicoWarmmate40 x 50
PortaagujasDKBTCZQ-00160
EsparcidorRWDR22029-03
Suero fisiológico estérilBiosharpBL158A Tijeras
de tejidoDKBTDC-YKJ1002
Pinzas de tejidoDKBTDK079904
Pinza vascularFine Science Tools18055-02
Sutura de vicrylShanghai Jinhuan4 -0 

Referencias

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