Name: Entrega sub-retiniana de progenitores fotorreceptores derivados de células madre embrionarias humanas en ratones rd10 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-06T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Aprende a preparar progenitores fotorreceptores derivados de células madre embrionarias humanas y su inyección sub-retiniana en ratones rd10. Este protocolo optimiza terapias celulares para degeneración retiniana.

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Agradecemos a Wei Sheng Tan, Luanne Chiang Xue Yen, Xinyi Lee y Yingying Chung por brindar asistencia técnica para la preparación de los progenitores de fotorreceptores derivados de hESC del día 32 después de la criopreservación. Este trabajo fue financiado en parte por subvenciones del Premio de Beca de Investigación para Jóvenes Investigadores del Consejo Nacional de Investigación Médica (NMRC/OFYIRG/0042/2017) y la24ª Subvención del Programa de Investigación Competitiva de la Fundación Nacional de Investigación (CRP24-2020-0083) a H.G.T.

Los experimentos in vivo se realizaron de acuerdo con las pautas y el protocolo aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de SingHealth (IACUC) y la Declaración de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) para el uso de animales en la Investigación Oftálmica y de la Visión. Las crías fueron inmunosuprimidas desde P17 (pre-trasplante) hasta P30 (post-trasplante) alimentándolas con agua potable que contenía ciclosporina (260 g/L).
1. Preparación de progenitores fotorreceptores derivados de hESC de día 32 después de la criopreservación
<ol><li>Medio de diferenciación fotorreceptor precalentado (PRDM) en un baño de agua a 37 °C.</li>
	<li>Recuperar un criovial que contiene células progenitoras fotorreceptoras derivadas de hESC de día 32 a partir de nitrógeno líquido. Manténgalo en hielo seco.</li>
	<li>Descongelar la criovial a 37 °C al baño maría durante 3-5 min. Resuspender las 32 células del día en 1 mL de PRDM y centrifugar a 130 x g durante 4 min.</li>
	<li>Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 1 mL de PRDM.</li>
	<li>Retire 10 μL de la mezcla para el recuento de células. Mezcle las células con azul de tripano al 0,2% de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Pipetee la mezcla de células en el portaobjetos de la cámara de recuento de células. Determine el número de celdas y la viabilidad mediante un contador de celdas automatizado.</li>
	<li>Continúe con el siguiente paso cuando la viabilidad de la célula sea superior al 70%. Centrifugar la suspensión celular restante a 130 x g durante 4 min. Retirar el sobrenadante y resuspender el gránulo celular en PRDM a la concentración de 3 x 105 células/μL para trasplante.</li>
	<li>Observe si hay grupos celulares visibles. Vuelva a suspender los grupos celulares repetidamente utilizando una punta de pipeta de 10 μL en el tubo de microfuga hasta que no se observe ningún grupo celular visible. Cargue en la jeringa de inyección 33G para observar la extrusión de la solución celular a través de la aguja.</li>
</ol>2. Liberación sub-retiniana de las hESCs en ratones rd10
<ol><li>Preparación de los animales<ol><li>Anestesiar al ratón (P20, macho/hembra, 3-6 g) utilizando una combinación de ketamina (20 mg/kg de peso corporal) y xilacina (2 mg/kg de peso corporal) en una jeringa de tuberculina de 1 ml unida a una aguja de 27G por vía intraperitoneal. Administrar una inyección subcutánea de buprenorfina (0,05 mg/kg) al ratón como analgésico preventivo.</li>
		<li>Después de administrar la anestesia, instilar una gota de tropicamida al 1% y fenilefrina al 2,5% para la dilatación de la pupila. Aplique un gel oftálmico en la córnea para evitar que el ojo se seque y las cataratas relacionadas con la anestesia.</li>
		<li>Coloque al ratón en una jaula vacía hasta que esté completamente anestesiado. Evalúe el nivel adecuado de anestesia pellizcando la almohadilla de la pata y confirme si el animal no reacciona al pellizco fuerte.</li>
		<li>Cuando el ratón esté completamente anestesiado, coloque al animal sobre una almohadilla tibia colocada a 38 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Liberación sub-retiniana de las células<ol><li>Para utilizar un abordaje de pars plana transvítrea de 1 puerto, como se hace aquí, realice la inyección subretiniana en un entorno estéril. Utilice un microscopio de operación vertical con una trayectoria de luz directa para realizar la inyección.</li>
		<li>Prepare la jeringa de vidrio de 10 μL retirando el cubo de la aguja. Monte la aguja roma 33G en la jeringa de vidrio. Tome la cubierta metálica del cubo y asegure con cuidado la aguja en la jeringa.</li>
		<li>Enjuague con agua destilada para verificar si hay signos de fugas y permeabilidad de la aguja. Vacíe la jeringa y colóquela a un lado con cuidado.</li>
		<li>Coloque el ratón anestesiado sobre una almohada, con el ojo de tratamiento mirando hacia arriba directamente hacia el objetivo del microscopio. Aplicar el clorhidrato de proparacaína al 0,5% y esperar 30 s. Aplicar 150 μL de gel oftálmico sobre el ojo y colocar sobre él un cubreobjetos redondo.</li>
		<li>Realice un examen aproximado del ojo observando la córnea, el iris, la pupila, el cristalino y la conjuntiva. A través de la pupila, visualiza el fondo del ojo del ratón ajustando el plano focal. Ajuste la cabeza hasta que la cabeza óptica se coloque en el centro de la pupila y minimice el movimiento de la cabeza colocándola correctamente sobre la almohada.</li>
		<li>Golpee suavemente la base del tubo con las hESC varias veces para obtener una suspensión celular uniforme. Utilizando la jeringa de microlitros de vidrio de 10 μL con una aguja roma de 33G, extraiga 2 μL de células/medios. Extraiga las células justo antes de la inyección para evitar que las células se asienten o se aglutinen en la jeringa.</li>
		<li>Con una aguja desechable de 30 G, haga una herida de esclerectomía a 2 mm detrás del limbo. Mantenga el ángulo de la aguja a ~45° para evitar tocar la lente. Una vez que se visualice la punta de la aguja en el ojo, retire suavemente la aguja. Deseche la aguja en el recipiente afilado después de usarla para evitar lesiones por pinchazos con la aguja.</li>
		<li>Tome la jeringa de vidrio e inserte la aguja roma en la herida de la esclerectomía. Sin tocar el cristalino, avance la aguja roma hasta que llegue a la retina opuesta de la herida de entrada. Asegúrese de que el área de la inyección esté libre de los principales vasos sanguíneos de la retina para evitar sangrado.</li>
		<li>Penetre suavemente en la retina hasta que se vea una rama de presión en la esclerótica. Mantenga el extremo romo de la aguja paralelo a la esclerótica para evitar la fuga de las células hacia el espacio vítreo.</li>
		<li>Inyecte lentamente 2 μL de suspensión celular o medio PRDM (control) en el espacio subretiniano mientras se mantiene una presión suave sobre la jeringa. Con una inyección exitosa, se debe formar una ampolla visible (es decir, una retina elevada con la suspensión/medio celular en ella) en el lugar de la inyección. NOTA: Solo se debe usar una presión suave durante la inyección para evitar el desgarro de la retina y el bloqueo de las células en la punta de la aguja.</li>
		<li>Después de confirmar la ampolla, espere 10 segundos para que las células se asienten. Retraiga suavemente la aguja del ojo.</li>
	</ol></li>
	<li>Tomografía de coherencia óptica (OCT) intraoperatoria de la ampolla (opcional)<ol><li>Coloque el ojo del ratón para visualizar la ampolla bajo el microscopio moviendo lentamente la cabeza. Asegure la posición sujetando suavemente la cabeza. No es necesaria una dilatación adicional de la pupila. No retire el cubreobjetos y el gel del ojo. Proporciona un medio óptico claro para visualizar la ampolla.</li>
		<li>Realice la OCT intraoperatoria utilizando la función iOCT incorporada del microscopio quirúrgico.</li>
		<li>Presione la opción Cubo en la pantalla OCT y coloque el área de escaneo en la ampolla presionando los botones de flecha . Ajuste la OCT deslizando el centrado y el enfoque para obtener la mejor calidad de OCT. Presione Capturar/Escanear para adquirir el escaneo OCT del área de la ampolla. Revise las imágenes para comprobar la calidad de los escaneos.</li>
	</ol></li>
	<li>Recuperación<ol><li>Retire el cubreobjetos y limpie el gel del ojo con una gasa. Aplique ungüento antibiótico una vez después de la inyección para prevenir infecciones.</li>
		<li>Permita que el animal se recupere de la anestesia bajo una luz cálida hasta que recupere la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal y regresar a la jaula de origen. Vigile al animal durante al menos 3 días después de la inyección para detectar signos de inflamación, infección y angustia. NOTA: La luz cálida de 150 W debe estar al menos a 30 cm de distancia de la jaula del animal, y se debe tener precaución para evitar una lesión por quemadura.</li>
		<li>Administrar una inyección subcutánea de buprenorfina (0,05 mg/kg) 8 horas durante 1 día o según recomendación del veterinario. Si se observa inflamación o infección del ojo, consulte a un profesional veterinario para el tratamiento adecuado.</li>
	</ol></li>
	<li>Limpieza y esterilización del instrumental<ol><li>Enjuague la jeringa de microlitros de vidrio de 10 μL y la aguja roma de 33G con etanol al 100% 10x. Lave el etanol flasheando la jeringa con agua destilada.</li>
		<li>Desmonte la jeringa de vidrio y la aguja. Seque la jeringa para guardarla.</li>
	</ol></li>
</ol>

Revitalización de la vista: terapia con células madre para la degeneración de la retina

Hwee Goon Tay es cofundador de Alder Therapeutics AB. Otros autores declaran no tener intereses contrapuestos.

La inyección subretiniana se ha utilizado para el trasplante en suspensión celular para tratar el EPR y las enfermedades de la retina 23,25,26,27,28,31,40. Este enfoque es muy esencial en los estudios con roedores, no solo para el trasplante de células y los enfoques de terapia génica, sino ...

Las enfermedades hereditarias de la retina y la degeneración macular relacionada con la edad conducen a la pérdida de células fotorreceptoras y a la ceguera final. El fotorreceptor de la retina es la capa del segmento externo de la retina compuesta por células especializadas responsables de la fototransducción (es decir, la conversión de la luz en señales neuronales). Los bastones y los conos fotorreceptores se encuentran adyacentes a la capa pigmentada de la retina (EPR)1. La terapia de reemplazo de células fotorreceptoras para compensar la pérdida celular ha sido un enfoque terapéutico emergente y en desarrollo. Se utilizaron células madre embrionarias (ESC)2,3,4, células madre pluripotentes inducidas (iPSC) derivadas de células madre y células progenitoras de la retina (RPC)4,5,6,7,8 para restaurar las células fotorreceptoras dañadas. El espacio sub-retiniano, un espacio confinado entre la retina y el EPR, es un lugar atractivo para depositar estas células para reemplazar las células fotorreceptoras dañadas, el EPR y las células de Mueller debido a su proximidad 9,10,11.
Las terapias génicas y celulares han estado utilizando el espacio sub-retiniano para la medicina regenerativa para diversas enfermedades de la retina en estudios preclínicos. Esto incluye la administración de copias funcionales del gen o de las herramientas de edición génica en forma de terapia con oligonucleótidos antisentido12,13 o CRISPR/Cas9 o la edición de bases a través de una estrategia basada en virus adenoasociados (AAV) 14,15,16, la implantación de materiales (p. ej., lámina de EPR, prótesis retinianas 17,18,19) y organoides retinianos diferenciados derivados de células madre 20,21,22 para tratar enfermedades relacionadas con la retina y el EPR. Ensayos clínicos que utilizan hESC-RPE31 en el espacio subretiniano para tratar la amaurosis congénita de Leber (LCA) asociada a RPE6523,24, la acromatopsia ligada a CNGA325, la retinosis pigmentaria asociada a MERTK26, la coroideremia 27,28,29,30 han demostrado ser un enfoque eficaz. La inyección directa de células en las proximidades del área dañada mejora en gran medida la posibilidad de asentamiento celular en la región apropiada, la integración sináptica y la eventual mejoría visual.
A pesar de que se ha establecido la inyección sub-retiniana en modelos humanos y de ojos grandes (es decir, cerdo 32,33,34,35, conejo 36,37,38,39,40 y primates no humanos 41,42,43), dicha inyección en el modelo murino sigue siendo un desafío debido a la limitación del tamaño del globo ocular y al enorme tamaño del globo ocular. lente que ocupa el ojo del ratón 44,45,46. Sin embargo, los modelos modificados genéticamente solo están disponibles en animales pequeños y no en animales grandes (es decir, conejos y primates no humanos), por lo que la inyección subrretiniana en ratones llama la atención para investigar nuevos enfoques terapéuticos en trastornos genéticos de la retina. Se están utilizando tres enfoques principales para administrar células o AAV en el espacio subretiniano, a saber, la ruta transcorneal, la ruta transescleral y la ruta pars plana (ver Figura 2). Las vías transcorneales y transesclerales se asocian con la formación de cataratas, sinequias, hemorragia coroidea y reflujo desde el lugar de la inyección 11,44,45,47,48,49. Adoptamos el enfoque de pars plana como una visualización directa del proceso de inyección, y el sitio de inyección se puede lograr en tiempo real bajo el microscopio.
Recientemente describimos un método que puede diferenciar células madre embrionarias humanas (hESCs) en progenitores de fotorreceptores bajo condiciones químicamente definidas y libres de xenos utilizando la isoforma de laminina recombinante específica de retina humana LN523. Dado que se encontró que LN523 estaba presente en la retina, planteamos la hipótesis de que el nicho de la matriz extracelular de la retina humana podría recapitularse in vitro y, por lo tanto, apoyar la diferenciación de los fotorreceptores de las hESC36. El análisis transcriptómico de una sola célula mostró que los progenitores fotorreceptores que coexpresan la homeobox de conos y la recoverina se generaron después de 32 días. Se utilizó un modelo de ratón mutante de degeneración retiniana 10 (rd10) que imita la retinosis pigmentaria humana autosómica para evaluar la eficacia de los progenitores fotorreceptores derivados de hESC de día 32 in vivo. Las células progenitoras fotorreceptoras derivadas de hESC se inyectaron en el espacio sub-retiniano de ratones rd10 en P20, donde la disfunción y degeneración de los fotoceptores están en curso36. Aquí, describimos un protocolo detallado para la preparación de los progenitores de fotorreceptores derivados de hESC post-criopreservados y la administración en el espacio sub-retiniano de ratones rd10 . Este método también se puede utilizar para administrar AAV, suspensiones celulares, péptidos o productos químicos en el espacio subretiniano en ratones.

<table><tbody><tr><td>0.3% Tobramicina</td><td>Novartis</td><td>NDC &nbsp; 0078-0813-01</td><td>Tobrex (3,5 g)</td></tr><tr><td>0,3% Tobramicina y 0,1% Dexametasona</td><td>Novartis</td><td>NDC 0078-0876-01</td><td>Tobradex (3,5 g)</td></tr><tr><td>0,5% Clorhidrato de proparacaína</td><td>Alcon</td><td>NDC 0998-0016-15</td><td>0,5% Alcaína (15 mL)</td></tr><tr><td>1 mL Jeringa de tuberculina</td><td>Turemo</td><td>SS01T2713</td><td></td></tr><tr><td>1% Tropicamida</td><td>Alcon</td><td>NDC 0998-0355-15</td><td>1% Madriacil (15 mL)</td></tr><tr><td>2,5% Clorhidrato de fenilefrina</td><td>Alcon</td><td>NDC 0998-0342-05</td><td>2,5% Mydfrin (5 mL)</td></tr><tr><td>Placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos</td><td>Costar</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>30 G Aguja desechable</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>305128</td><td></td></tr><tr><td>33 G, 20 mm de longitud agujas romas</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td></td></tr><tr><td>Contador de células automatizado</td><td>NanoEnTek</td><td>Modelo: Eve</td><td></td></tr><tr><td>B27 sin vitamina A</td><td>Life Technologies</td><td>12587001</td><td>2%36</td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Ceva</td><td></td><td>Vetergesic vet (0,3 mg/mL)</td></tr><tr><td>CKI-7</td><td>Sigma</td><td>C0742</td><td>5 &micro; M36</td></tr><tr><td>Cyclosporine</td><td>Novartis</td><td></td><td>260 g/L en agua potable</td></tr><tr><td>Día 32 hCélulas progenitoras fotorreceptoras derivadas de ESC</td><td>Facultad de Medicina DUKE-NUS Las</td><td></td><td>células madre embrionarias humanas se diferencian durante 32 días. Ver protocolo en Ref 36.</td></tr><tr><td></td><td>Gasa Winner Industries Co., Ltd.</td><td>1SNW475-4</td><td></td></tr><tr><td>Glasgow Medio Esencial Mínimo</td><td>Gibco</td><td>11710&ndash; 035</td><td></td></tr><tr><td>hESC línea celular H1</td><td>WiCell Research Institute</td><td>WA01</td><td></td></tr><tr><td>Factor neurotrófico derivado del cerebro humano (BDNF)</td><td>Peprotech</td><td>450-02-50</td><td>10 ng/mL36</td></tr><tr><td>Factor neurotrófico ciliar humano (CNTF)</td><td>Prospec-Tany Technogene</td><td>CYT-272</td><td>10 ng/mL36</td></tr><tr><td>Clorhidrato de ketamina (100 mg/mL)</td><td>Ceva Sant&eacute; Animale</td><td>KETALAB03</td><td></td></tr><tr><td>LN-521</td><td>Biolamina</td><td>LN521-02</td><td>1 &micro; g36</td></tr><tr><td>mFreSR</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5854</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de vidrio de microlitros (10 mL)</td><td>Hamilton</td><td>7653-01</td><td></td></tr><tr><td>N-[N-(3,5-difluorofenacetil-L-alanil)]-S-fenilglicina t-butil éster (DAPT)</td><td>Selleckchem</td><td>S2215</td><td>10 &micro; M36</td></tr><tr><td>N-2 suplemento</td><td>Life Technologies</td><td>A13707-01</td><td>1%36</td></tr><tr><td>Aminoácidos no esenciales (NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140&ndash; 050</td><td>1x36</td></tr><tr><td>NutriStem XF Media</td><td>Satorius</td><td>05-100-1A</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de operación</td><td>Zeiss</td><td>OPMI LUMERA 700</td><td>Con función iOCT incorporada</td></tr><tr><td>PRDM (Medio de diferenciación de fotorreceptores, 50 ml)</td><td>Facultad</td><td></td> de Medicina DUKE-NUS <td>Ver composición de medios36. Medio basal, 10 y micro; M DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0,5 y micro; M Ácido retinoico, 2% B27 y 1% N2. Medio basal: 1x GMEM, 1 mM de piruvato de sodio, 0,1 mM de B-mercaptoetanol, 1x Aminoácidos no esenciales (NEAA).</td></tr><tr><td>Piruvato</td><td>Gibco</td><td>11360&ndash; 070</td><td>1 mM36</td></tr><tr><td>Rd10 ratones</td><td>Laboratorio Jackson</td><td>B6. Ratones CXB1-Pde6brd10/J</td><td>Sexo: macho/hembra, Edad: P20 (inyección), Peso: 3-6 g&nbsp;</td></tr><tr><td>Ácido retinoico</td><td>Tocris Bioscience</td><td>0695/50</td><td>0.5 &micro; M36</td></tr><tr><td>Cubreobjetos redondos (12 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-80</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Sigma</td><td>S4317</td><td>0.5 &micro; M36</td></tr><tr><td>Gel Vidísico (10 g)</td><td>Dr. Gerhard Mann</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de xilacina (20 mg/mL)</td><td>Troy Laboratories</td><td>LI0605</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985&ndash; 023</td><td>0,1 mM36</s></td></tr></tbody></table>

entrega sub-retiniana de progenitores fotorreceptores derivados de células madre embrionarias humanas en ratones rd10

Sub-Retinal Delivery of Human Embryonic Stem Cell Derived Photoreceptor Progenitors in rd10 Mice

La regeneración de células fotorreceptoras utilizando células madre pluripotentes humanas es una terapia prometedora para el tratamiento de enfermedades de la retina hereditarias y de envejecimiento en etapas avanzadas. Hemos demostrado que la matriz de isoformas de laminina específica de retina recombinante humana es capaz de apoyar la diferenciación de células madre embrionarias humanas (hESCs) a progenitores de fotorreceptores. Además, la inyección sub-retiniana de estas células también ha mostrado una restauración parcial en los modelos de roedores y conejos rd10 . Se sabe que la inyección subretiniana es un método establecido que se ha utilizado para administrar compuestos farmacéuticos a las células fotorreceptoras y a la capa epitelial pigmentada de la retina (EPR) del ojo debido a su proximidad al espacio objetivo. También se ha utilizado para administrar vectores virales adenoasociados en el espacio subretiniano para tratar enfermedades de la retina. La administración sub-retiniana de compuestos farmacéuticos y células en el modelo murino es un desafío debido a la restricción en el tamaño del globo ocular murino. Este protocolo describe el procedimiento detallado para la preparación de células progenitoras fotorreceptoras derivadas de hESC para inyección y la técnica de administración sub-retiniana de estas células en ratones con mutación de retinosis pigmentaria genética, rd10 . Este enfoque permite la terapia celular en el área objetivo, en particular la capa nuclear externa de la retina, donde se producen las enfermedades que conducen a la degeneración de los fotorreceptores.

La jeringa de vidrio de 10 μL se ensambló de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Figura 1), y la aguja roma utilizada para administrar la suspensión/medio celular se muestra en la Figura 1B. En la Figura 2 se ilustran diferentes enfoques para la inyección subretiniana. Describimos el enfoque de pars plana en este protocolo (Figura 2C). La aguja roma montada en una jeringa de vidrio se insertó ...

Describimos un protocolo detallado para la preparación de células progenitoras fotorreceptoras derivadas de hESC post-criopreservadas y la administración sub-retiniana de estas células en ratones rd10 .

Entrega sub-retiniana de progenitores fotorreceptores derivados de células madre embrionarias humanas en ratones rd10

Regeneration of photoreceptor cells using human pluripotent stem cells is a promising therapy for the treatment of both hereditary and aging retinal ...

Mi investigación se centra en el desarrollo de terapias basadas en células madre para estadios avanzados de enfermedades de la retina que causan degeneración de fotorreceptores. El objetivo de nuestra investigación es reemplazar la pérdida de fotorreceptores en pacientes con progenitores fotorreceptores clínicamente seguros y funcionales con el objetivo de mejorar su agudeza visual o incluso restaurar su visión. El principal modelo preclínico son los ratones, pero su pequeño tamaño ocular dificulta la inyección de materiales, especialmente debajo de la retina.Desarrollar la habilidad para realizar inyecciones subretinianas exitosas requiere paciencia y perseverancia. Hemos desarrollado con éxito una base de laminina para el método de diferenciación de receptores que es capaz de generar progenitores fotorreceptores en 32 días. Los trasplantes subretinianos de las suspensiones celulares de este progenitor fotorreceptor en los roedores dieron lugar a una conectividad sináptica entre los orificios y el injerto en los ojos.Esto ha llevado a una restauración visual parcial. Nuestro enfoque es simple, la visualización correcta ayuda al cirujano a manejar la aguja en el área de interés.

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Investigación

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Medicina

Esta técnica quirúrgica ilustra la inyección de vectores de terapia génica y las células madre en el espacio subretiniano del ojo del ratón.

Inyección subretiniana de vectores de terapia génica y células madre en el ojo del ratón

El trasplante de la célula representa una estrategia para el tratamiento de la degeneración retiniana caracterizada por pérdida del fotorreceptor. Aquí describimos un método para el enriquecimiento de fotorreceptores trasplantables y su injerto subretinal en ratones adultos.

Trasplante Subretinal De Macs Purificado Fotorreceptores Precursores De Células En La Retina Del Ratón Adulto

Aquí presentamos un protocolo aceptado por la comunidad en formato multimedia para inyectar subretinialmente un bolo de células EPR en ratas y ratones. Este enfoque se puede utilizar para determinar los potenciales de rescate, los perfiles de seguridad y las capacidades de supervivencia de las células EPR injertadas tras la implantación en modelos animales de degeneración de la retina.

Realizar Subretinal Inyecciones en roedores administrar células de la retina epitelio pigmentario en Suspensión

Inyección subretinal se ha aplicado extensamente en estudios preclínicos de terapia de reemplazo de la célula de vástago para la degeneración macular relacionada con la edad. En este artículo visualizado, describimos una técnica de inyección subretinal menos riesgoso, reproducible y exacto modificado vía trans-escleral para entregar las células en los ojos de rata.

Desarrollo de un protocolo de refinado para Trans-escleral transplante Subretinal de células epiteliales del pigmento retiniano humano a ojos de rata

Las células epiteliales del pigmento retiniano podrían servir como una terapia de reemplazo celular para la forma avanzada de la degeneración macular seca relacionada con la edad. Este protocolo describe la generación de un modelo de grandes ojos de atrofia geográfica y el transplante subretinal de células epiteliales del pigmento retiniano derivados de células madre embrionarias humanas en este modelo de la enfermedad.

Transplante subretinal de células epiteliales del pigmento retiniano derivado de células madre embrionarias humanas en un modelo de grandes ojos de atrofia geográfica

Se describe un método para diseñar un retineano tejido compuesto de células epiteliales del pigmento retiniano derivadas de las células de vástago pluripotent humanas cultivadas sobre las membranas amnióticas humanas y su preparación para injerto en modelos animales.

Ingeniería del tejido epitelio pigmentario de la retina trasplante adecuado derivado de células madre embrionarias humanas

Aquí se presenta una técnica quirúrgica para trasplantar tejido retiniano derivado de células madre pluripotentes humanas (hPSC) en el espacio subretiniano de un modelo animal grande.

Trasplante subretiniano de tejido retiniano derivado de células madre embrionarias humanas en un modelo felino de animales grandes

Este protocolo presenta un abordaje transescleral transpupilar guiado por visión para administrar de forma segura y precisa injertos celulares subretinianos, con una baja tasa de complicaciones quirúrgicas, en receptores de ratón con o sin degeneración retiniana.

Trasplante transescleral guiado por transpupilar de injertos subretinianos en un modelo de ratón con degeneración retiniana

Se describe un método para propagar los tumores humanos en ratones retinoblastoma. Las células tumorales se inyectan directamente en los ojos de ratones inmunes deficientes. Los tumores secundarios se han establecido con éxito utilizando las células cosechadas directamente de tumores humanos y tumorspheres cultivadas.

Establecimiento y propagación de los tumores del retinoblastoma humanos en ratones con deficiencia inmune

Trasplante de células madre en un In vitro Simulación de isquemia / reperfusión modelo

Aprende a preparar progenitores fotorreceptores derivados de células madre embrionarias humanas y su inyección sub-retiniana en ratones rd10. Este protocolo optimiza terapias celulares para degeneración retiniana.

Entrega sub-retiniana de progenitores fotorreceptores derivados de células madre embrionarias humanas en ratones rd10

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