Name: Aislamiento intestinal de larvas de pez cebra para la secuenciación de ARN de una sola célula (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: Aprende a aislar células intestinales de larvas de Danio rerio para secuenciación de ARN de una sola célula. Este protocolo permite identificar tipos celulares epiteliales, estromales, sanguíneos, musculares, inmunes y ganglios neuronales entéricos.

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Este trabajo fue financiado por la Fundación de Amigos de Sophia (SSWO WAR-63).

Toda la cría y los experimentos de pez cebra se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices institucionales de la legislación Erasmus MC y de bienestar animal. El uso de larvas de pez cebra a los 5 días después de la fertilización entra en la categoría de experimentos que no requieren aprobación ética formal, como se describe en las regulaciones holandesas.
1. Obtención de larvas de tipo silvestre y tg (phox2bb:GFP) 5 días después de la fertilización (dpf)
<ol><li>Establecer la cría de peces cebra salvajes y recoger 50 huevos en medio E3 tamponado con HEPES (en lo sucesivo, E3) en una placa de Petri de 15 cm. Utilice estos peces como control negativo para la clasificación celular activada por fluorescencia (FAC).</li>
	<li>Establezca la cría de pez cebra tg (phox2bb: GFP) y recoja aproximadamente 300 huevos en E3 en una placa de Petri de 15 cm.</li>
	<li>Mantener los óvulos fecundados en E3 (máximo 50 huevos/plato) en un ciclo de luz/oscuridad de 14 h/10 h, en incubadora a 28,5 °C.</li>
	<li>A 1 dpf, retire los óvulos no fertilizados y deje que los fertilizados se desarrollen a 5 dpf.</li>
	<li>Seleccione larvas tg(phox2bb:GFP) a 1 dpf.</li>
</ol>2. Disociación de larvas enteras de tipo salvaje
<ol><li>Anestesiar larvas de 5 dpf con tricaína al 0,016%.</li>
	<li>Pica 30 peces cebra en trozos pequeños con una cuchilla de afeitar en una placa de Petri que contenga 1 ml de solución de tripsina-EDTA 10x.</li>
	<li>Transfiera el pez cebra picado a un tubo de microcentrífuga con un volumen total de 2 ml de solución de tripsina-EDTA 10x y déjelo en hielo durante 3 h. Pipetear hacia arriba y hacia abajo con una pipeta P1000 cada hora para estimular la disociación.</li>
</ol>3. Aislamiento intestinal
<ol><li>Colocar 6-10 larvas de 5 dpf anestesiadas con Tricaína al 0,016% seguidas, en una placa de agarosa al 1,8% (0,45 g de agarosa en 25 mL de E3), bajo un microscopio de disección</li>
	<li>Coloca un alfiler de insecto en la cabeza del pez cebra.</li>
	<li>Retire todo el E3 restante con un pañuelo de papel.</li>
	<li>Aísle el intestino con otro alfiler de insecto, sin perturbar ningún otro órgano. Asegúrese de retirar la yema (Figura complementaria S1A).</li>
	<li>Una vez aislado, inspeccione el intestino y retire todo el material no intestinal (por ejemplo, piel, grasa, hígado) si es necesario.</li>
	<li>Recoja el intestino con pinzas y colóquelo en un tubo de microcentrífuga, que contiene solución salina tamponada con fosfato (PBS) con suero fetal de ternero (FCS) al 10%, en hielo. NOTA: Se debe aislar un mínimo de 244 intestinos, manteniendo el tiempo total de disección en 3 h. Esto es factible con dos personas trabajando en paralelo.</li>
</ol>4. Disociación intestinal
<ol><li>Inmediatamente después de la disección de todos los intestinos, centrifugar el tubo de microcentrífuga a toda velocidad (13.800 × g) durante 30 s.</li>
	<li>Retire el PBS/FCS al 10% pero deje una pequeña cantidad (~100 μL) para evitar que los intestinos se sequen. Añadir 500 μL de 2,17 mg/mL de papaína en HBSS que contenga CaCl2 y MgCl2, para disociar las células.</li>
	<li>Activar la papaína con 2,5 μL de cisteína (1 M).</li>
	<li>Incubar las tripas al baño maría a 37 °C durante 10 min. Pipetear hacia arriba y hacia abajo hasta la mitad (después de 5 minutos) para estimular la digestión enzimática del tejido.</li>
	<li>Transfiera las células a un tubo FACS utilizando un filtro de células de 35 μm, prehumedecido con 0,5 ml de PBS/FCS al 10%.</li>
	<li>Lave el colador agregando un total de 2 ml de PBS/10% FCS en pasos de 0.5 ml.</li>
	<li>Centrifugar a 700 × g durante 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Retirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 300 μL de PBS/10% FCS.</li>
	<li>Añadir 1 μg/ml de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para marcar las células muertas (1:1.000) e incubar durante 5 min para permitir su exclusión durante el FACS.</li>
</ol>5. Enriquecimiento de FACS
<ol><li>Utilice la muestra de tipo salvaje para establecer las puertas de la población de células ordenadas registrando 3.000 células en el citómetro de flujo (Figura complementaria S1B-E).</li>
	<li>Utilice una boquilla de 100 μm, ajuste la precisión de clasificación en función de la pureza y coloque el tubo de recolección que contiene 200 μL de PBS / 5% FCS, en la máquina FACS.</li>
	<li>Cargue la suspensión celular de los intestinos y clasifique las células individuales vivas (DAPI-negativas) en el tubo de recolección (Figura 2C), excluyendo los dobletes (Figura 2B) y las células muertas (Figura 2C). NOTA: Para el pez cebra tg(phox2bb), la proporción de células GFP+ sólo se comprueba como referencia, ya que todas las células vivas individuales están clasificadas.</li>
	<li>Mantenga el tubo de recolección en hielo después de la clasificación de células.</li>
	<li>Cuente la suspensión celular con un hemocitómetro, incluyendo una verificación de viabilidad con azul de tripano. Si la viabilidad es de al menos el 80%, continúe con el siguiente paso.</li>
	<li>Las células ahora están listas para procesar para scRNAseq (es decir, la plataforma 10x Genomics Chromium). Utilice aproximadamente 20.000 células por muestra.</li>
</ol>

Procesamiento de células intestinales de larvas de pez cebra para la secuenciación de ARN unicelular

<ol><li>Saldana-Morales, F. B., Kim, D. V., Tsai, M. T., Diehl, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Healthy+intestinal+function+relies+on+coordinated+enteric+nervous+system%2C+immune+system%2C+and+epithelium+eesponses%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Healthy intestinal function relies on coordinated enteric nervous system, immune system, and epithelium eesponses.</a> Gut Microbes. 13 (1), 1-14 (2021).</li>
<li>Sitrin, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSitrin%2C+M+%22The+Gastrointestinal+System%22">The Gastrointestinal System</a>. , (2014).</li>
<li>Furness, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organisation+of+the+autonomic+nervous+system%3A+peripheral+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Autonomic+Neuroscience%3A+Basic+and+Clinical%22%5BJournal%5D)">The organisation of the autonomic nervous system: peripheral connections.</a> Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 130 (1-2), 1-5 (2006).</li>
<li>Furness, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enteric+nervous+system+and+neurogastroenterology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">The enteric nervous system and neurogastroenterology.</a> Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 9 (5), 286-294 (2012).</li>
<li>Obata, Y., Pachnis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+microbiota+and+the+immune+system+on+the+development+and+organization+of+the+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">The effect of microbiota and the immune system on the development and organization of the enteric nervous system.</a> Gastroenterology. 151 (5), 836-844 (2016).</li>
<li>Heuckeroth, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hirschsprung+disease+-+integrating+basic+science+and+clinical+medicine+to+improve+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hirschsprung disease - integrating basic science and clinical medicine to improve outcomes.</a> Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 15 (3), 152-167 (2018).</li>
<li>Antonucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+intestinal+pseudo-obstruction%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Chronic intestinal pseudo-obstruction.</a> World Journal of Gastroenterology. 14 (19), 2953-2961 (2008).</li>
<li>De Giorgio, R., Sarnelli, G., Corinaldesi, R., Stanghellini, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+our+understanding+of+the+pathology+of+chronic+intestinal+pseudo-obstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Advances in our understanding of the pathology of chronic intestinal pseudo-obstruction.</a> Gut. 53 (11), 1549-1552 (2004).</li>
<li>Bianco, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+neuromyopathies%3A+highlights+on+genetic+mechanisms+underlying+chronic+intestinal+pseudo-obstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Enteric neuromyopathies: highlights on genetic mechanisms underlying chronic intestinal pseudo-obstruction.</a> Biomolecules. 12 (12), 1849(2022).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+disease%3A+zebrafish+swim+into+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).</li>
<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li>
<li>Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+growth+and+differentiation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Intestinal growth and differentiation in zebrafish.</a> Mechanisms of Development. 122 (2), 157-173 (2005).</li>
<li>Wallace, K. N., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+and+conserved+aspects+of+gut+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Unique and conserved aspects of gut development in zebrafish.</a> Developmental Biology. 255 (1), 12-29 (2003).</li>
<li>Harrison, C., Wabbersen, T., Shepherd, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+visualization+of+the+development+of+the+enteric+nervous+system+using+a+Tg%28-8.3bphox2b%3AKaede%29+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">In vivo visualization of the development of the enteric nervous system using a Tg(-8.3bphox2b:Kaede) transgenic zebrafish.</a> Genesis. 52 (12), 985-990 (2014).</li>
<li>Kuil, L. E., Chauhan, R. K., Cheng, W. W., Hofstra, R. M. W., Alves, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+a+model+organism+for+studying+enteric+nervous+system+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: a model organism for studying enteric nervous system development and disease.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 629073(2020).</li>
<li>Stuart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Integration+of+Single-Cell+Data%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Integration of Single-Cell Data.</a> Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).</li>
<li>Kuil, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+characterization+of+the+larval+zebrafish+enteric+nervous+system+at+a+single+cell+transcriptomic+level%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Unbiased characterization of the larval zebrafish enteric nervous system at a single cell transcriptomic level.</a> iScience. 26 (7), 107070(2023).</li>
<li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+differential+transcriptomes+and+cell+types+in+zebrafish+larvae+intestine+and+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Unraveling differential transcriptomes and cell types in zebrafish larvae intestine and liver.</a> Cells. 11 (20), 3290(2022).</li>
<li>Jin, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdx1b+protects+intestinal+cell+fate+by+repressing+signaling+networks+for+liver+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Cdx1b protects intestinal cell fate by repressing signaling networks for liver specification.</a> Journal of Genetics and Genomics. 49 (12), 1101-1113 (2022).</li>
<li>Willms, R. J., Jones, L. O., Hocking, J. C., Foley, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+atlas+of+microbe-responsive+processes+in+the+zebrafish+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A cell atlas of microbe-responsive processes in the zebrafish intestine.</a> Cell Reports. 38 (5), 110311(2022).</li>
<li>Kline, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKline%2C+M+%22Fishing+for+answers%3A+Isolating+enteric+neurons+and+identifying+putative+ENS+mutants%22">Fishing for answers: Isolating enteric neurons and identifying putative ENS mutants</a>. , Iowa State University. https://doi.org/10.31274/etd-180810-5368 (2016).</li>
<li>Allan, K., DiCicco, R., Ramos, M., Asosingh, K., Yuan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+a+single+cell+suspension+from+zebrafish+retinal+tissue+for+flow+cytometric+cell+sorting+of+Muller+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Preparing a single cell suspension from zebrafish retinal tissue for flow cytometric cell sorting of Muller glia.</a> Cytometry A. 97 (6), 638-646 (2020).</li>
<li>Lopez-Ramirez, M. A., Calvo, C. F., Ristori, E., Thomas, J. L., Nicoli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+adult+zebrafish+brain-derived+neurospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of adult zebrafish brain-derived neurospheres.</a> Journal of Visualized Experiments. 53617 (108), 53617(2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Aquí, presentamos un método para el aislamiento y disociación del intestino de larvas de pez cebra de 5 dpf utilizando FACS. Con este método, se recolectaron y analizaron con éxito diferentes tipos de células intestinales mediante scRNA-seq, utilizando la plataforma 10x Genomics Chromium. Seleccionamos la línea de pez cebra tg(phox2bb:GFP), ya que queríamos una indicación de que las células viables del SNE también se aislarían (Figura 2D). Sin embargo, es importante tener en cuenta ...

El tracto gastrointestinal (GI) es un sistema complejo que desempeña un papel vital en la salud y el bienestar general. Es responsable de la digestión y absorción de nutrientes, así como de la eliminación de productos de desecho 1,2. El tracto gastrointestinal está compuesto por múltiples tipos de células, incluidas las células epiteliales, las células del músculo liso, las células inmunitarias y el sistema nervioso entérico (SNE), que se comunican estrechamente entre sí para regular y mantener una función intestinal adecuada 3,4,5. Los defectos en el desarrollo del tracto gastrointestinal pueden tener efectos de gran alcance en diversos aspectos, como la absorción de nutrientes, la composición de la microbiota, el eje intestino-cerebro y el SNE, lo que conduce a varios trastornos neuromusculares entéricos, como la enfermedad de Hirschsprung y la pseudoobstrucción intestinal crónica 6,7. Estos trastornos se caracterizan por una dismotilidad intestinal severa causada por alteraciones en varias células clave, como las células intersticiales de Cajal, las células musculares lisas y el SNE 6,8,9. Sin embargo, los mecanismos moleculares que subyacen al desarrollo y la disfunción gastrointestinal aún no se conocen bien.
El pez cebra es un organismo modelo valioso para estudiar el desarrollo y la disfunción gastrointestinal debido a su rápido desarrollo embrionario, transparencia durante las etapas embrionaria y larvaria, y trazabilidad genética 10,11,12,13,14. Se dispone de numerosas líneas transgénicas de pez cebra que expresan proteínas fluorescentes. Un ejemplo de este tipo de línea es el pez cebra tg(phox2bb:GFP), comúnmente utilizado para estudiar el SNE, ya que todas las células phox2bb+, incluidas las neuronas entéricas, están marcadas como15,16. Aquí, utilizando la línea de pez cebra tg(phox2bb:GFP), presentamos un método para el aislamiento intestinal de larvas 5 días después de la fertilización (dpf) para el análisis de secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) (Figura 1).

<table><tbody><tr><td>10x Tripsina (0,5%)-EDTA (0,2%)</td><td>Sigma</td><td>59418C</td><td></td></tr><tr><td>5 mL tubo de fondo redondo con tapón de filtro de celdas</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon Tubo de fondo redondo 5 mL (tubos FACS) tapón a presión</td><td>BD Biosciences</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>Cell Ranger v3.0.2</td><td>10X Genomics</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat#D-9542</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>Olympus SZX16</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSAria III máquina clasificadora</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HBSS con CaCl2 y MgCl2</td><td>Gibco</td><td>14025050</td><td></td></tr><tr><td>alfileres de insectos</td><td>Fine Science Tools</td><td>26000-25</td><td></td></tr><tr><td>L-Cisteína</td><td>Sigma</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>MS-222, Tricaína</td><td>Supelco</td><td>A5040-250G</td><td></td></tr><tr><td>Papaína</td><td>Sigma</td><td>P4762</td><td></td></tr><tr><td>Seurat v3</td><td>Stuart et &nbsp;al. (2019)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Azul de tripán&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>Gato#T8154</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento intestinal de larvas de pez cebra para la secuenciación de arn de una sola célula

Gut Isolation from Zebrafish Larvae for Single-cell RNA Sequencing

El tracto gastrointestinal (GI) realiza una serie de funciones esenciales para la vida. Los defectos congénitos que afectan a su desarrollo pueden dar lugar a trastornos neuromusculares entéricos, lo que pone de manifiesto la importancia de comprender los mecanismos moleculares que subyacen al desarrollo y la disfunción gastrointestinal. En este estudio, presentamos un método para el aislamiento intestinal de larvas de pez cebra a los 5 días después de la fertilización para obtener células vivas y viables que se pueden utilizar para el análisis de secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq). Este protocolo se basa en la disección manual del intestino del pez cebra, seguida de la disociación enzimática con la papaína. Posteriormente, las células se someten a una clasificación celular activada por fluorescencia y las células viables se recolectan para la secuenciación de scRNA. Con este método, pudimos identificar con éxito diferentes tipos de células intestinales, incluidas las células epiteliales, estromales, sanguíneas, musculares e inmunitarias, así como las neuronas entéricas y la glía. Por lo tanto, consideramos que es un recurso valioso para estudiar la composición del tracto gastrointestinal en la salud y la enfermedad, utilizando el pez cebra.

Con este protocolo, logramos aislar y disociar con éxito intestinos enteros de larvas de 5 dpf. Utilizando papaína como enzima de disociación, mejoramos significativamente la viabilidad celular, permitiendo la captura de 46.139 eventos que involucraron células individuales viables (6,4% de todas las células) de 244 intestinos aislados (Figura 2A). Se utilizaron larvas enteras de tipo salvaje como control para garantizar que se optimizara el proceso de clasificación, lo que permitió una ident...

Aquí, describimos un método para el aislamiento intestinal de larvas de pez cebra a los 5 días después de la fertilización, para el análisis de secuenciación de ARN de una sola célula.

Aislamiento intestinal de larvas de pez cebra para la secuenciación de ARN de una sola célula

The gastrointestinal (GI) tract performs a range of functions essential for life. Congenital defects affecting its development can lead to enteric ...

Nuestra investigación tiene como objetivo investigar los cambios transcriptómicos que ocurren durante el desarrollo gastrointestinal y la disfunción en larvas de pez cebra. Aquí, proporcionamos un nuevo protocolo que permite el aislamiento de diferentes tipos de células dentro del intestino del pez cebra, que tiene aplicaciones potenciales en la comprensión de la salud y las enfermedades gastrointestinales. En los últimos años, ha habido un creciente interés en explorar la interacción entre el sistema nervioso entérico y otros tipos de células intestinales durante el desarrollo y la enfermedad.La comprensión de esta compleja dinámica mediante técnicas avanzadas, como la secuenciación de ARN de una sola célula, tiene el potencial de revelar información crítica sobre las neuromiopatías entéricas, lo que conduce a diagnósticos y tratamientos más precisos. Utilizando este protocolo, identificamos con éxito varios tipos de células intestinales, incluidas las epiteliales, estromales, sanguíneas, musculares, células inmunitarias e incluso neuronas entéricas y glía, que no se habían capturado antes en esta cantidad utilizando enfoques similares. De este modo, proporcionamos una técnica fiable para estudiar la composición gastrointestinal durante el desarrollo y la disfunción.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

El aislamiento de alta calidad, intacta ARN es un paso esencial en los protocolos de laboratorio de muchos. Este sentido, demuestran la extracción de RNA a partir de embriones de pez cebra conjunto y la síntesis de ADNc para su posterior aplicación en diversos procedimientos experimentales, incluyendo el análisis de microarrays de expresión génica.

Aislamiento del ARN de síntesis embrionarias pez cebra y el cDNA de análisis de expresión génica

Este video describe un protocolo para aislar neuronas, macrófagos y microglía de cerebros de larvas de pez cebra mediante la interrupción mecánica del tejido cerebral. Las poblaciones celulares purificadas se pueden utilizar además para el análisis genómico.

Aislamiento de células cerebrales de larvas de pez cebra: una técnica para obtener neuronas, macrófagos y microglía intactos a partir de tejido cerebral de pez cebra

Este protocolo describe un método para aislar células individuales de embriones de pez cebra, enriquecer para obtener células de interés, capturar células de pez cebra en sistemas multiplex de células individuales basados en microfluidos y evaluar la expresión génica de células individuales.

Aislamiento y caracterización de células individuales a partir de embriones de pez cebra

Aquí, se presenta un protocolo para el aislamiento de tejido gonadal de larvas de pez cebra, que facilitará las investigaciones de la diferenciación sexual de pez cebra y el mantenimiento.

La disección de las larvas de pez cebra de tejidos gonadales

A continuación, describimos una técnica para aislar las células de población lateral de un modelo de pez cebra de células T myc inducida por la leucemia linfoblástica aguda (LLA-T). Este ensayo población lado es muy sensible y se describe, por pez cebra T-ALL, pero puede ser aplicable a otros tipos de células de pez cebra malignas y no malignas.

Aislamiento de la población lateral en la leucemia linfoblástica aguda inducida por linfocitos T de Myc en peces cebra

Este protocolo presenta un enfoque para el análisis del transcriptoma completo de embriones de pez cebra, larvas, o clasificar las células. Se incluyen aislamiento de RNA, análisis de la vía de datos RNASeq y qRT-PCR-based validación de los cambios de expresión génica.

Preparación de muestras y análisis de datos de expresión basada en RNASeq gen de pez cebra

Presentamos un protocolo para aislar a las neuronas, macrófagos y microglia del cerebro de pez cebra larvas bajo condiciones fisiológicas y patológicas. Al aislamiento, el RNA se extrae de estas células a analizar su perfil de expresión génica. Este protocolo permite la colección de ARN de alta calidad para realizar análisis posteriores como qPCR y transcriptómica.

Aislamiento y extracción de ARN de las neuronas, macrófagos y Microglia de cerebros de larvas de pez cebra

Describimos una técnica para perfilar microARN en embriones de ratón tempranos. Este protocolo supera el desafío de la entrada de células bajas y el enriquecimiento de ARN pequeño. Este ensayo se puede utilizar para analizar los cambios en la expresión de miRNA a lo largo del tiempo en diferentes linajes celulares del embrión de ratón temprano.

Preparación de pequeñas bibliotecas de ARN para la secuenciación de embriones de ratón tempranos

El aislamiento de núcleos individuales se basa en la disociación y la permeabilización basada en detergente de la membrana celular, pasos que necesitan optimización y son propensos a introducir artefactos técnicos. Demostramos un protocolo libre de detergente y enzimas para el aislamiento rápido de núcleos intactos directamente de todo el tejido, produciendo núcleos adecuados para ARN-seq de un solo núcleo (snRNA-Seq) o ATAC-seq.

Aislamiento de núcleos de tejido entero utilizando un método de detergente y libre de enzimas

Aquí, presentamos un método para alinear y crioseccionar múltiples muestras de larvas de pez cebra (Danio rerio) y recolectarlas en un solo portaobjetos para el análisis transcriptómico espacial.

Disposición espacialmente compacta de secciones de larvas de pez cebra para análisis transcriptómico espacial

Aprende a aislar células intestinales de larvas de Danio rerio para secuenciación de ARN de una sola célula. Este protocolo permite identificar tipos celulares epiteliales, estromales, sanguíneos, musculares, inmunes y ganglios neuronales entéricos.

Aislamiento intestinal de larvas de pez cebra para la secuenciación de ARN de una sola célula

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