Expresión y purificación de alto rendimiento de portadores de solutos humanos para estudios estructurales y bioquímicos
29 de septiembre de 2023
Los estudios estructurales y bioquímicos de los transportadores de membrana humana requieren cantidades de miligramos de proteína estable, intacta y homogénea. Aquí describimos métodos escalables para seleccionar, expresar y purificar transportadores de solutos humanos utilizando genes optimizados para codones.
Los portadores de solutos, o SLC, son responsables de absorber nutrientes y están involucrados en enfermedades humanas. Sin embargo, hay pocos medicamentos dirigidos a las SLC porque están poco estudiados. Desarrollamos enfoques eficientes para clonar, expresar y purificar SLC.
Nuestro flujo de trabajo produce proteínas puras, lo que permite realizar estudios bioquímicos y estructurales y, en última instancia, proporciona información para las campañas de descubrimiento de fármacos. Con las numerosas funciones que desempeñan los procesos biológicos, las enfermedades y la administración de fármacos, las SLC han recibido cada vez más atención y se han convertido en atractivas dianas terapéuticas. Los proyectos privados y públicos de ReSOLUTE IMI generaron recursos y datos de acceso abierto para permitir nuevos descubrimientos en la función, la fisiología, la patología y la orientación terapéutica de SLC.
Tradicionalmente, las SLC eran difíciles de estudiar, ya que son proteínas integrales de membrana con diversos sustratos y diversos mecanismos de transporte. Recientemente, Cryo-EM, el sistema de expresión de BacMam y los nuevos reactivos de solubilización han supuesto un cambio radical en su caracterización. Se necesitan muestras de proteínas puras para estudios bioquímicos y estructurales.
En humanos, los portadores de solutos a menudo tienen un rendimiento pobre cuando se sobreexpresan y son inestables cuando se purifican. Por lo tanto, en el pasado, cada objetivo requería años para desarrollar estructuras individuales para producir la muestra de proteína para aplicaciones posteriores. Nuestro método está optimizado para el estudio paralelo y rentable de múltiples objetivos o construcciones de un solo objetivo.
Por lo tanto, equilibra cuidadosamente la flexibilidad experimental, el costo, el tiempo y los recursos de laboratorio. Además, ofrecemos acceso abierto a todos nuestros protocolos y recursos en este artículo y en el portal web de ReSOLUTE.
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Descripción general
Este estudio se centra en los transportadores de solutos (SLC), que son cruciales para la absorción de nutrientes y están asociados con diversas enfermedades humanas. Los investigadores desarrollaron métodos eficientes para la clonación, expresión y purificación de SLC, lo que posibilita estudios bioquímicos y estructurales adicionales.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Bioquímica
- Farmacología
Antecedentes
- Los transportadores de solutos desempeñan un papel fundamental en el transporte de nutrientes.
- Están implicados en varias enfermedades humanas.
- A pesar de su importancia, pocos fármacos tienen como diana a los SLC debido a la investigación limitada.
- Recientes iniciativas han tenido como objetivo mejorar la comprensión de las funciones de los SLC.
Objetivo del estudio
- Desarrollar métodos escalables para el estudio de los SLC humanos.
- Producir proteínas puras para análisis bioquímicos y estructurales.
- Facilitar los esfuerzos de descubrimiento de fármacos dirigidos a los SLC.
Métodos Utilizados
- Clonación de genes optimizados en el código de nucleótidos para SLCs.
- Expresión de proteínas SLC en sistemas adecuados.
- Purificación de proteínas para obtener muestras homogéneas.
- Utilización de recursos abiertos de proyectos IMI para el acceso a datos.
Resultados principales
- Se establecieron métodos eficientes de clonación y expresión.
- Se obtuvieron proteínas SLC de alta pureza para estudios posteriores.
- El estudio proporciona información sobre las funciones de las SLC y su potencial terapéutico.
- Los datos generados respaldan la investigación en curso sobre la fisiología y patología de las SLC.
Conclusiones
- Los métodos desarrollados mejoran significativamente el estudio de los SLC.
- Los conocimientos obtenidos podrían conducir a nuevas estrategias de descubrimiento de fármacos.
- Una mayor comprensión de los SLC podría mejorar la selección terapéutica.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Los transportadores de solutos humanos (SLC) representan una gran clase subutilizada de transportadores de membrana con un potencial terapéutico significativo, sin embargo, su caracterización estructural y bioquímica ha avanzado lentamente debido a los desafíos en la expresión y purificación. Este flujo de trabajo de alto rendimiento permite la producción paralela y escalable de proteínas SLC puras y funcionalmente activas, abordando directamente un cuello de botella clave en la descubrimiento temprano de fármacos y la validación de dianas. Al facilitar el acceso a muestras de SLC de alta calidad, el método apoya la reducción de riesgos en toda la cartera y acelera la evaluación de estas dianas para intervención farmacéutica.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la interrogación sistemática de la función y especificidad de sustrato de los transportadores SLC.
- Apoya la desactivación de riesgos mecanicistas al proporcionar proteínas bioquímicamente activas e intactas desde el punto de vista estructural para la comprobación de hipótesis.
- Facilita la validación de dianas mediante la producción reproducible de múltiples constructos SLC en paralelo.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Proporciona proteínas SLC de alta pureza adecuadas para ensayos bioquímicos y de transporte cuantitativos.
- Normaliza la cantidad de proteína para análisis posteriores de cribado de alto rendimiento y estudios de interacción.
- Mejora la reproducibilidad y escalabilidad del ensayo al garantizar una calidad y rendimiento consistentes de la proteína.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Posibilita estudios estructurales que aportan información sobre mecanismos de transportadores relevantes para enfermedades y su capacidad de ser dianas terapéuticas.
- Proporciona preparaciones estables de proteínas para estudios de unión y transporte de moléculas pequeñas, alineados con el desarrollo de biomarcadores traslacionales.
- Apoya la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante la generación de datos sobre estabilidad y actividad proteica.
Integración de la Canalización y del Flujo de Trabajo
Este flujo de trabajo se integra en la interfaz entre el descubrimiento inicial y la identificación de compuestos activos, proporcionando reactivos fundamentales tanto para estudios mecanicistas como para campañas de cribado.
- Biología del Descubrimiento: Proporciona proteínas SLC de alta calidad para análisis funcionales y estructurales guiados por hipótesis.
- Cribado: Permite el desarrollo de ensayos robustos y el cribado de compuestos con entradas reproducibles de proteínas.
- Análisis: Ofrece resultados cuantitativos como concentración, pureza y monodispersidad de proteínas para comparaciones entre diferentes condiciones.
- Investigación Traducional: Apoya la identificación de SLCs relevantes para enfermedades y su modulación farmacológica.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma escalable y reutilizable para la evaluación de objetivos SLC en múltiples programas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la selección de dianas SLC y reduce la ambigüedad mecanicista.
- Valor operativo: Optimiza la producción de proteínas mediante protocolos estandarizados y de alto rendimiento.
- Valor estratégico: Acelera las decisiones de avance o interrupción y mejora la asignación de capital al permitir la triage temprana de dianas.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de dianas SLC para su avance hacia cribados y fases preclínicas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la expresión, purificación y caracterización analítica de proteínas de membrana.
- Exige acceso a sistemas de expresión eucariotas, infraestructura de cromatografía y análisis de proteínas.
- Se beneficia de protocolos estandarizados y recursos de acceso abierto para la reproducibilidad entre equipos.
- Adaptable a diversos miembros de la familia SLC y diseños de constructos, lo que favorece una amplia aplicabilidad.
- La estabilidad y el rendimiento de la proteína pueden variar según el blanco, lo que requiere optimización del constructo y del tampón.
