Name: Inyección de espermatida redonda de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Aprende la técnica de inyección de espermatida redonda en ratones para mejorar la eficiencia del desarrollo embrionario. Este método avanza en aplicaciones clínicas para pacientes con azoospermia no obstructiva.

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<meta charset="utf8"></head><body>Procedimiento de inyección de espermatida redonda murina para estudiar el desarrollo embrionario

<ol><li>Redgrove, K. A., McLaughlin, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+immune+response+in+Chlamydia+trachomatis+infection+of+the+male+genital+tract%3A+A+double-edged+sword%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The role of the immune response in Chlamydia trachomatis infection of the male genital tract: A double-edged sword.</a> Front Immunol. 5, 534(2014).</li>
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<li>Tekayev, M., Vuruskan, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+values+and+advances+in+round+spermatid+injection+%28ROSI%29%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biol%22%5BJournal%5D)">Clinical values and advances in round spermatid injection (ROSI).</a> Reprod Biol. 21 (3), 100530(2021).</li>
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<li>Yang, H., Shi, L., Chen, C. D., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+generated+after+round+spermatid+injection+into+haploid+two-cell+blastomeres%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Mice generated after round spermatid injection into haploid two-cell blastomeres.</a> Cell Res. 21 (5), 854-858 (2011).</li>
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<li>Sakamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paternally+inherited+H3K27me3+affects+chromatin+accessibility+in+mouse+embryos+produced+by+round+spermatid+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Paternally inherited H3K27me3 affects chromatin accessibility in mouse embryos produced by round spermatid injection.</a> Development. 149 (18), 200696(2022).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+multiomics+sequencing+reveals+the+reprogramming+defects+in+embryos+generated+by+round+spermatid+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Single-cell multiomics sequencing reveals the reprogramming defects in embryos generated by round spermatid injection.</a> Sci Adv. 8, (2022).</li>
<li>Ward, M. A., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracytoplasmic+sperm+injection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Intracytoplasmic sperm injection in mice.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2018 (1), (2018).</li>
<li>Yoshida, N., Perry, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Piezo-actuated+mouse+intracytoplasmic+sperm+injection+%28ICSI%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Piezo-actuated mouse intracytoplasmic sperm injection (ICSI).</a> Nat Protoc. 2 (2), 296-304 (2007).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS+selection+of+valuable+mutant+mouse+round+spermatids+and+strain+rescue+via+round+spermatid+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Zygote%22%5BJournal%5D)">FACS selection of valuable mutant mouse round spermatids and strain rescue via round spermatid injection.</a> Zygote. 23 (3), 336-341 (2013).</li>
<li>Kong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+histone+deacetylase+inhibitor+%27Scriptaid%27+on+the+developmental+competence+of+mouse+embryos+generated+through+round+spermatid+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Effects of the histone deacetylase inhibitor 'Scriptaid' on the developmental competence of mouse embryos generated through round spermatid injection.</a> Hum Reprod. 32 (1), 76-87 (2017).</li>
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<li>Ogura, A., Ogonuki, N., Miki, H., Inoue, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinsemination+and+nuclear+transfer+using+male+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Microinsemination and nuclear transfer using male germ cells.</a> Int Rev Cytol. 246, 189-229 (2005).</li>
<li>Kimura, Y., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracytoplasmic+sperm+injection+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Intracytoplasmic sperm injection in the mouse.</a> Biol Reprod. 52 (4), 709-720 (1995).</li>
<li>Ogonuki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-speed+congenic+strategy+using+first-wave+male+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A high-speed congenic strategy using first-wave male germ cells.</a> PLoS One. 4 (3), e4943(2009).</li>
<li>Abdelaal, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertility+preservation+for+pediatric+male+cancer+patients%3A+illustrating+contemporary+and+future+options%3B+a+case+report%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Androl+Urol%22%5BJournal%5D)">Fertility preservation for pediatric male cancer patients: illustrating contemporary and future options; a case report.</a> Transl Androl Urol. 10 (1), 520-526 (2021).</li>
<li>Eyni, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+bioengineering+of+male+germ+stem+cells+to+preserve+fertility%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Advanced bioengineering of male germ stem cells to preserve fertility.</a> J Tissue Eng. 12, (2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>CaCl22H2O&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C7902&nbsp;</td><td>Preparación de CZB</td></tr><tr><td>Glucosa&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G6152&nbsp;</td><td>Preparación de CZB</td></tr><tr><td>HEPES-Na (básico)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H3784&nbsp;</td><td>Preparación de CZB</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Beyotime&nbsp;</td><td>C1025</td><td>FACS</td></tr><tr><td>gonadotropina coriónica humana (HCG)</td><td>Ningbo Segunda compañía hormonal</td><td>HCG</td><td>Medicamentos promotores de la ovulación</td></tr><tr><td>Hialuronidasa</td><td>Sigma</td><td>H3506</td><td>Eliminación de células de la granulosa alrededor del ovocito</td></tr><tr><td>KCl&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>Preparación de CZB KH</td></tr><<tr><td>sub>2PO4&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P5655&nbsp;</td><td>Preparación de CZB</td></tr><tr><td>KSOMaa</td><td>Caisson Labs</td><td>IVL04-100ML</td><td>Medio optimizado de potasio simple suplementado con aminoácidos</td></tr><tr><td>L-glutamina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G8540&nbsp;</td><td>Preparación de CZB</td></tr><tr><td>M2</td><td>Sigma</td><td>M7167-50ML</td><td>Fluido de trabajo</td></tr><tr><td>MgSO47H2O&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M1880&nbsp;</td><td>Preparación de CZB</td></tr><tr><td>Na2-EDTA2H2O&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E5134&nbsp;</td><td>Preparación de CZB</td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td>Preparación de CZB</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761&nbsp;</td><td>Preparación de CZB</td></tr><tr><td>Na-lactato 60% jarabe d = 1,32 g/L</td><td>Sigma</td><td>L7900&nbsp;</td><td>Preparación de CZB</td></tr><tr><td>Na-piruvato&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P4562&nbsp;</td><td>Preparación de CZB</td></tr><tr><td>Puntas de perforación piezoeléctricas (ICSI)&nbsp;</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>piezoXpert</td><td>Ruptura de la membrana piezoeléctrica de</td></tr><tr><td>yegua embarazada gonadotropina sérica (PMSG)</td><td>Ningbo Second Hormone Company</td><td>PMSG</td><td>Medicamentos promotores de la ovulación</td></tr><tr><td>PVA&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P8136</td><td>Preparación de CZB</td></tr></tbody></table>

inyección de espermatida redonda de ratón

Mouse Round Spermatid Injection

Comenzamos nuestra investigación examinando el efecto de AOA en la capacidad de desarrollo de los embriones. En la Figura 1A se muestra una ilustración esquemática del diseño experimental. Antes de la inyección de espermatozoides, los ovocitos se sometieron a AOA (A-ICSI) o permanecieron sin tratamiento (ICSI). En la Tabla 1 se presentan datos detallados sobre el desarrollo embrionario. Los resultados no revelaron diferencias significativas en las tasas de escisión, blastocisto o natalidad entre los grupos A-ICSI e ICSI (P &gt; 0,05; Figura 1B). Estos hallazgos indican que el uso de AOA 10 mM SrCl2 durante 20 min no afectó el potencial de desarrollo de los embriones.
Anteriormente se informó que no había diferencias perceptibles en la eficiencia del desarrollo de los embriones ROSI seleccionados por FACS o por examen visual directo bajo un microscopio22. Nuestros experimentos emplearon la tecnología FACS para identificar RS (Figuras 2A,B). Bajo el microscopio, las espermátidas redondas de ratón tenían aproximadamente 10 μm de diámetro y mostraban una estructura de nucléolo similar a una protuberancia en el centro (Figura 2C). Postulamos que la selección a través de FACS es más precisa que el examen visual directo bajo un microscopio. Además, la literatura apoya la exploración directa de las RS a través de las diferencias morfológicas. Los embriones ROSI se generaron utilizando dos métodos distintos: el grupo A-ROSI, en el que los ovocitos se sometieron a AOA antes de la inyección redonda de espermatida, y el grupo ROSI-A, en el que los ovocitos se sometieron a AOA después de la inyección redonda de espermatida. El diagrama esquemático del diseño experimental se muestra en la Figura 1C. Cabe destacar que no se encontraron diferencias significativas en las tasas de escisión y blastocisto entre los grupos A-ROSI, ROSI-A e ICSI (P &gt; 0,05; Figura 1D). Las tasas de blastocisto de los grupos A-ROSI, ROSI-A e ICSI fueron significativamente más altas que las del grupo de activación (P &lt; 0,05; Figura 1D). Sin embargo, la tasa de natalidad del grupo ROSI fue menor que la del grupo ICSI, independientemente de si los ovocitos se activaron antes o después de la inyección (P &lt; 0,05; Figura 1D). Es importante destacar que la tasa de natalidad del grupo A-ROSI fue ligeramente superior a la del grupo ROSI-A (Figura 1D). En la Tabla 1 se presentan más detalles sobre los datos de desarrollo embrionario.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65898/65958fig01.jpg"> 
Figura 1: Los embriones ROSI mostraron una eficiencia de desarrollo reducida en comparación con los embriones ICSI. (A) Ilustración esquemática del protocolo experimental que evalúa el efecto de la activación en el desarrollo embrionario ICSI. Azul = Los ovocitos no estaban activados; Amarillo = Los ovocitos estaban activados. (B) Eficiencia en el desarrollo de embriones derivados de A-ICSI e ICSI. (C) Ilustración esquemática del protocolo experimental para la generación de diferentes tipos de embriones. (D) Eficiencia en el desarrollo de embriones derivados de A-ROSI, ROSI-A, A e ICSI. **, P &lt; 0,01. Abreviaturas: A= Activación E= Día embrionario; ROSI= Inyección redonda de espermatida; ICSI= Inyección intracitoplasmática de espermatozoides. Las barras de error muestran la desviación estándar. La comparación de tasas se realiza mediante la prueba de chi-cuadrado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65898/65958fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65898/65958fig02.jpg"> 
Figura 2: Las espermátidas redondas se seleccionaron mediante clasificación por citometría de flujo. (A) Se utilizó un diagrama de clasificación por citometría de flujo para la selección de espermátidas redondas. (B) Imágenes representativas que muestren la selección de espermátidas redondas. Barra de escala: 10 μm. Abreviaturas: FSC = Dispersión directa; SSC = dispersión lateral; 355 es la longitud de onda de excitación; 460/50 y 670/30 son dos canales de detección bajo láser de 355 longitudes de onda. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65898/65958fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">Grupos</td>
			<td colspan="3">Desarrollo preimplantacional</td>
			<td colspan="2">Desarrollo post-implantación</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replica</td>
			<td>Tasa de escisión (%)</td>
			<td>Tasa de blastocisto (%)</td>
			<td>Embriones de 2 células transferidos/ No. de los destinatarios</td>
			<td>Tasa de natalidad (%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-ICSI</td>
			<td>5</td>
			<td>99.33 (149/150)</td>
			<td>75.17 (112/149)</td>
			<td>49/5</td>
			<td>48.98 (24/49)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-ROSI</td>
			<td>5</td>
			<td>99.33 (149/150)</td>
			<td>73.83 (110/149)</td>
			<td>44/5</td>
			<td>18.18 (8/44) **</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROSI-A</td>
			<td>5</td>
			<td>98.00 (147/150)</td>
			<td>64.63 (95/147)</td>
			<td>45/5</td>
			<td>13.33 (6/45) **</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activación</td>
			<td>5</td>
			<td>100.00 (150/150)</td>
			<td>12.00 (18/150) **</td>
			<td>51/5</td>
			<td>0.00 (0/51) **</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ICSI</td>
			<td>5</td>
			<td>98.00 (147/150)</td>
			<td>73.47 (108/147)</td>
			<td>46/5</td>
			<td>52.17 (24/46)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 1. La eficiencia del desarrollo de embriones derivados de diferentes grupos.
Tabla complementaria 1. Proporción de diferentes poblaciones celulares ordenadas por citometría de flujo. La parte P3 son espermátidas redondas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65898/Supplementary%20Table%201_RE.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Inyección de espermatida redonda de ratón

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

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Evaluación funcional de la quinesina-7 CENP-E en espermatocitos mediante inhibición in vivo , inmunofluorescencia y citometría de flujo

El método de manipulación cervical presentado puede inducir pseudoembarazo en ratones sin necesidad de reproductoras con machos vasectomizados. La inducción del pseudoembarazo es necesaria para el éxito de la transferencia embrionaria no quirúrgica y de la inseminación artificial no quirúrgica, que también se presentan.

Inducir pseudoembarazo en ratones hembra sin necesidad de machos vasectomizados antes de la transferencia embrionaria no quirúrgica o la inseminación artificial

El modelo de ratón AcroSensE y los métodos de obtención de imágenes de células vivas descritos aquí proporcionan un nuevo enfoque para estudiar la dinámica del calcio en el compartimento subcelular del acrosoma, el espermatozoide, y cómo regulan los pasos intermedios que conducen a la fusión de la membrana y la exocitosis acrosómica.

Imágenes en tiempo real de la dinámica del calcio acrosómico y la exocitosis en espermatozoides de ratón vivos

Aquí, presentamos un protocolo para establecer un modelo de ratón de inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) y transferencia de embriones (ET), lo que nos permite observar cambios relacionados con la edad en el metabolismo de la glucosa que pueden atribuirse a ICSI, proporcionando información sobre sus posibles impactos a largo plazo en el desarrollo humano.

Monitorización de la glucosa en sangre en crías de ratón después de la inyección intracitoplasmática de espermatozoides

Aprende la técnica de inyección de espermatida redonda en ratones para mejorar la eficiencia del desarrollo embrionario. Este método avanza en aplicaciones clínicas para pacientes con azoospermia no obstructiva.

Inyección de espermatida redonda de ratón

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