Inyección de espermatida redonda de ratón

La inyección redonda de espermatida puede resolver el problema de la reproducción en algunos pacientes con azoospermia no obstructiva, pero su eficacia es muy baja. Nuestro estudio utilizó ratones como modelos para buscar métodos que mejoraran la eficiencia del desarrollo embrionario de ROSI en ratones. Una estadística incompleta indica que en todo el mundo se han dado a luz menos de 200 fetos humanos concebidos por ROSI.

Un punto de inflexión en la comprensión del potencial de la tecnología ROSI se produjo en 2015, cuando Tanaka y sus colegas informaron sobre los nacimientos exitosos de 14 fetos a través de la tecnología ROSI, infundiendo una confianza renovada en su aplicación clínica y viabilidad. El enfoque actual de la investigación de ROSI se centra en las anomalías en las modificaciones epigenéticas y la activación asistida por ovocitos anormales, mientras que la identificación precisa de los datos redondos de los espermatozoides también es un desafío. La eficiencia de desarrollo de los embriones ROSI en ratones ya es muy alta en nuestro laboratorio, que es similar a otros laboratorios.

Sin embargo, la eficiencia del desarrollo de los no roedores, como los humanos, es todavía muy nueva. En el futuro, nos centraremos en la mejora de la eficiencia del desarrollo de los no roedores. Para comenzar, inyecte a una rata hembra de seis a ocho semanas de edad por vía intraperitoneal 7,5 unidades internacionales de gonadotropina sérica de yegua preñada a las 5:00 p.m. y gonadotropina coriónica humana 48 horas después.

Asegúrese de que no haya contacto con ratones macho después de la inyección. Después de sacrificar al ratón, abra su cavidad abdominal. Con unas tijeras, corte las trompas de Falopio cerca de ambos ovarios y colóquelas en un tampón M2 precalentado a 37 grados centígrados.

Bajo el objetivo 10X de un microscopio vertical, localice la parte transparente y agrandada de la trompa de Falopio. Luego, con una jeringa de un mililitro, asegure la trompa de Falopio, corte la parte agrandada y recoja los complejos del cúmulo coronal del ovocito. Para eliminar las células de la granulosa, coloque el complejo de ovocitos en una solución quirúrgica M2 precalentada que contenga un 0,1 % de hialuronidasa y sople suavemente a través de una pipeta oral.

Transfiera el ovocito en serie a las gotas de KSOMaa para enjuagar tres veces y colóquelo en una incubadora a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono. Para empezar, obtenga un ratón macho C57BL/6 de ocho a 10 semanas de edad sacrificado. Abra su cavidad abdominal y extirpe suavemente el epidídimo cerca de los testículos con unas tijeras.

Coloque la placa que contiene el epidídimo en un medio M2 bajo un objetivo 10X de un microscopio vertical. Y con una jeringa de un mililitro, extirpe suavemente el epidídimo para que los espermatozoides fluyan. Sifón los espermatozoides que fluyen en suspensión en el fondo de un tubo que contenga 0,5 mililitros de tampón M2.

Para el aislamiento de espermatidas redondas, transfiera el testículo disecado al tampón M2. Con una jeringa de un mililitro, corte suavemente la membrana blanca bajo el microscopio y luego exprima y extirpe los túbulos seminíferos enrevesados. Después de extraer la suspensión, filtre con un tamiz de malla 400 y centrifugue las células filtradas.

Deseche el sobrenadante e incube las células con 200 microlitros de Hoechst 33342 a 37 grados centígrados durante 10 minutos. Coloque el tubo de citometría que contiene las células teñidas en el citómetro de flujo. Después de ajustar el voltaje, seleccione la población de celdas en función de la dispersión frontal y lateral.

Luego, elimine las adherencias de la celda de acuerdo con la dispersión hacia adelante y el ancho de pulso del disparo. Usando dos canales de detección bajo un láser de longitud de onda de 355 nanómetros, clasifique las espermátidas redondas y guárdelas a cuatro grados Celsius. Bajo el microscopio, las espermátidas redondas de ratón tenían aproximadamente 10 micrómetros de diámetro y mostraban una estructura de nucléolo similar a una protuberancia en el medio.

Para empezar, obtén ovocitos y espermátidas redondas de ratones. A continuación, prepare las agujas de sujeción e inyección con diámetros adecuados. Coloque los ovocitos en gotas M2 de 10 microlitros con o sin citocalasina B para ablandar y almacenar los gametos.

A continuación, coloque las gotas redondas M2 de las espermátidas y monte el plato de operaciones en la mesa de operaciones microscópica. Ajuste la posición de la inyección y fije la aguja. Con polivinilpirrolidona, o PVP, humedezca y limpie la aguja de inyección.

A continuación, extraiga la espermatida redonda en la aguja de inyección. Gire el ovocito con la aguja de sujeción para orientar el cuerpo polar del ovocito a la posición de las 12 en punto. A continuación, coloque la aguja de inyección con cuidado en la posición de las tres en punto del ovocito.

Con un dispositivo PiezoXpert, cree un agujero en la zona pelúcida de los ovocitos. A continuación, avance suavemente la aguja de inyección en el ovocito horizontalmente y rompa la membrana del ovocito. Inyectar gradualmente la espermatida redonda en el citoplasma del ovocito.

Retire la aguja de inyección y aspire una pequeña cantidad de la membrana de los ovocitos cerca de la abertura para sellarla. Para la inyección intracitoplasmática de espermatozoides, coloque los espermatozoides en una pista de PVP. Aspire los espermatozoides de la cola y coloque su cuello en la boca de la aguja de inyección.

Aplique un piezoeléctrico para separar la cabeza del espermatozoide de la cola. A continuación, inyecte el esperma en el ovocito como se ha demostrado anteriormente, con una aguja de inyección de nueve a 10 micrómetros de diámetro. Para la activación asistida de los ovocitos, coloque los ovocitos en gotas de 20 microlitros de medio CZB libre de calcio y magnesio que contenga cloruro de estroncio hexahidratado.

Luego, transfiéralos al medio de cultivo KSOMaa para su cultivo. Al mismo tiempo, establecer un grupo para la activación de la partenogénesis sin inyectar espermátidas redondas o espermatozoides para estudios embriológicos. Después de la activación, transfiéralo al medio de cultivo KSOMaa para su cultivo.

Los embriones redondos inyectados con espermátida mostraron una eficiencia de desarrollo reducida en comparación con los embriones inyectados con espermatozoides intracitoplasmáticos.