Name: Interacción entre bacteriófagos T4 y E. coli en el intestino murino: un modelo prototípico para estudiar la dinámica huésped-bacteriófago in vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T13:55:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Aprende a producir lisados de bacteriófagos T4 para inocular y enumerar en modelos murinos gnotobióticos. Este protocolo estandarizado permite estudiar las interacciones trípartitas entre fagos, bacterias y el sistema inmune en el intestino.

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Los autores reconocen que la tierra en la que realizaron esta investigación es el territorio tradicional, ancestral y no cedido de la Nación xwməθkwəy̓əm (Musqueam). La tierra en la que se encuentra siempre ha sido un lugar de aprendizaje para el pueblo Musqueam, que durante milenios ha transmitido su cultura, historia y tradiciones de una generación a otra en este sitio. Animamos a otros a aprender más sobre las tierras nativas en las que viven y trabajan en https://native-land.ca. Los autores agradecen el apoyo del Consejo de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC) Becas Canadienses de Posgrado - Maestría (N.P.), Premio Michael Smith Health Research BC Trainee (RT-2023-3174, a MH), Programa de Becas de Descubrimiento del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC) (RGPIN-2019-04591 a C.T., RGPIN-2016-04282 a LCO), Instituto Canadiense de Investigación Avanzada / Humanos y el Microbioma (FL-001253 Appt 3362, a C.T.), Premio Académico de la Fundación Michael Smith para la Investigación en Salud (18239, a C.T.), los Institutos Canadienses para la Investigación en Salud (PJT-159458 a LCO) y la Fundación Canadiense para la Innovación (34673 a LCO y 38277 a CT). Agradecemos el apoyo técnico del Centro de Modelización de Enfermedades de la UBC y ubcFLOW, que cuenta con el apoyo de la Iniciativa de Resiliencia Biológica GREx de la UBC, y a los miembros de los laboratorios de Osborne y Tropini por las discusiones críticas y la evaluación del manuscrito. La Figura 1A y la Figura 2A se crearon utilizando Biorender.com.

Exploración de la dinámica de los fagos intestinales y las bacterias en modelos murinos utilizando el fago T4

Los autores no tienen nada que revelar.

Los bacteriófagos, o fagos, son virus que infectan y matan bacterias con especificidad a nivel de especie y cepa. Los fagos desempeñan un papel importante dentro de comunidades bacterianas complejas, como la microbiota intestinal, donde se han implicado en la regulación de la dinámica de la población y en la mejora de la aptitud bacteriana2. A lo largo de la última década, ha habido un renovado interés en la investigación de fagos debido al aumento de patógenos resistentes a los antimicrobianos3 y el potencial de la terapia con fagos como estrategia de tratamiento alternativa. En los últimos años, los cócteles de fagos líticos se han utilizado por vía intravenosa con cierto éxito en infecciones sépticas bacterianas graves y resistentes a los antibióticos en humanos 3,4. La terapia oral con fagos también se ha propuesto como una alternativa potencial a los antibióticos para tratar las infecciones intestinales y la inflamación. Además, los fagos han sido implicados en el éxito de los trasplantes de filtrado fecal (FFT), que son preparaciones de microbiota fecal que se han filtrado para eliminar bacterias, en el tratamiento de la infección recurrente por Clostridioides difficile (rCDI)5,6, los trastornos inflamatorios intestinales (EII)7,8 y la enterocolitis necrotizante en cerdos prematuros9. Teniendo en cuenta estos resultados, es importante tener en cuenta las interacciones tanto entre los fagos y la microbiota intestinal, como entre los fagos y el huésped mamífero, ya que la adición de nuevos fagos a una comunidad preexistente puede tener efectos indirectos en la comunidad en su conjunto, y no solo en sus bacterias diana 2,10.
El estudio in vitro de las interacciones de los fagos con sus bacterias diana ha demostrado ser útil para comprender los mecanismos y los impactos de las interacciones de los fagos y las bacterias en el intestino. En este contexto, se ha demostrado que los fagos T4 específicos de Escherichia coli del orden Caudovirales requieren dominios similares a inmunoglobulinas (Ig) ubicados dentro de proteínas de la cápside externa (Hoc) altamente antigénicas en la superficie del virión para adherirse al moco intestinal11. Además, los ensayos de transwell han demostrado que los fagos T4 son capaces de interactuar con cultivos celulares epiteliales y translocarse a través de las capas celulares por macropinocitosis12,13. Estos resultados apoyan la hipótesis de que los fagos pueden interactuar con su huésped metazoario, a pesar de que son incapaces de infectar las células eucariotas. Estos modelos, si bien son útiles, carecen de la gama completa de interacciones complejas que ocurren en un ecosistema intestinal que se requieren para una exploración exhaustiva de la interacción tripartita entre los fagos, las bacterias y el huésped metazoario.
Los modelos de ratón son una herramienta importante para investigar fagos en entornos complejos. Una aplicación deseable de la administración de fagos es como una estrategia alternativa para tratar infecciones resistentes a los antimicrobianos o patógenos asociados con enfermedades inflamatorias crónicas, incluida la EII. Sin embargo, la literatura emergente sugiere que el comportamiento de los fagos in vitro no representa completamente las funciones in vivo. Buttimer et al.14 demostraron que un cóctel de fagos era capaz de agotar las bacterias objetivo en un consorcio simplificado de microbiota humana in vitro, pero no podía replicarse in vivo en ratones gnotobióticos colonizados con el mismo consorcio bacteria-fago. Además, en un microbioma de ratón convencional, el fago T7 condujo a un agotamiento selectivo de sus bacterias intestinales objetivo, aunque se observó una recuperación gradual a lo largo del tiempo, lo que indica una resistencia evolucionada15. Otros estudios han demostrado la coexistencia de fagos administrados por vía oral y sus cepas bacterianas diana in vivo 2,16. De hecho, más allá de la coexistencia entre fagos y bacterias, la administración de fagos dio lugar a cambios generalizados en la composición y función general de la comunidad de microbiota 2,16. Esto es relevante en entornos de enfermedad, ya que varios estudios han encontrado asociaciones entre el aumento de la abundancia relativa de caudovirales y la EII 7,8,17 que fueron independientes de los cambios en la abundancia bacteriana7. Se desconoce si esto es un impulsor o una consecuencia de la patogénesis de la enfermedad.
El enfoque histórico de la investigación de fagos ha girado en torno a la relación entre un fago y su bacteria objetivo. Sin embargo, también es importante tener en cuenta las posibles interacciones entre el fago y la mucosa, el epitelio y el sistema inmunitario del huésped metazoario. Todas estas interacciones juegan un papel importante en la respuesta general a la infección por fagos intestinales. Para demostrarlo, se han estudiado los fagos con ratones libres de gérmenes (GF) para dilucidar su impacto en el sistema inmunitario sin interferencia de la microbiota8. En este sistema, los ácidos nucleicos de los fagos fueron detectados por receptores tipo Toll (TLR) ubicados dentro de los endosomas de las células inmunes fagocíticas (macrófagos y células dendríticas). Esto activó la señalización descendente y estimuló la producción dependiente de células T de interferón (IFN)-γ 8 o IFN tipo I18. Además, Fluckiger et al.19 implicaron a los linfocitos T CD8+ de memoria en el reconocimiento de antígenos codificados por fagos (profagos), lo que dio lugar a una reactividad cruzada de los linfocitos T con los antígenos tumorales, lo que resultó en una reducción de la carga tumoral. Por último, la producción de anticuerpos específicos de fagos se ha documentado en estudios con ratones en los que se administraron fagos a modelos animales de forma continua a través del agua de bebida 8,20, o mediante sonda nasogástrica oral repetida durante varios meses20, lo que demuestra la capacidad de las proteínas de los fagos para promover respuestas inmunitarias humorales. Aunque estos modos de inoculación de fagos permiten un cebado óptimo y continuo del sistema inmunitario, es posible que no representen las interacciones naturales entre los fagos y el entorno intestinal, ni la cinética de la terapia con fagos aplicada por vía oral. Hasta ahora, un número limitado de estudios han examinado las interacciones de los fagos con una sola especie bacteriana en modelos de ratón monocolonizados21. Sin embargo, los ratones monocolonizados demostraron ser fundamentales para descifrar los efectos específicos de los microbios de especies individuales en el tracto gastrointestinal (GI) y el desarrollo inmunológico 22,23,24, y aún pueden resultar útiles para comprender las interacciones tripartitas entre los fagos, sus bacterias objetivo y el huésped metazoario.
Curiosamente, todavía hay mucho que aprender sobre las interacciones entre los fagos intestinales y las bacterias comensales intestinales, así como las interacciones que se producen entre el huésped metazoario y los fagos que residen en él. Este protocolo proporciona un conjunto de procedimientos para estudiar el fago T4 aislado y su contraparte bacteriana, E. coli (K-12, BW25113), utilizando un modelo de ratón gnotobiótico. Estos procedimientos estandarizados también proporcionan una base para optimizar otras díadas de fagos/bacterias mediante la adaptación de los parámetros de crecimiento a los pares de interés. Los métodos descritos aquí describen: (1) Preparación de lisados de fagos y vehículos T4 para la sonda nasogástrica oral de ratones; (2) Administración oral de fagos T4 a ratones gnotobióticos monocolonizados por E. coli ; (3) Monitoreo de los niveles de fagos T4 en heces y tejidos de ratón a lo largo del tiempo.
Para los resultados representativos presentados aquí, los lisados de fagos T4 purificados se propagaron a partir de las existencias de bancos de fagos mantenidos por el Laboratorio Rohwer. Se adaptó el método Phage-on-Tap para propagar el fago T425, como se menciona en este protocolo. El método produce un alto título y bajas reservas de fagos con endotoxinas en tres días. Utilizando este enfoque, se recolectaron rutinariamente 10 ml de ≥10 10 unidades formadoras de placa (ufp)/ml de fago T4 con < 0,5 unidades de endotoxinas (UE)/ml. Los niveles de endotoxinas recomendados para la administración oral o intravenosa en ratones son ≤ 20 UE/ml y ≤ 5 UE/kg/h (o 0,1 UE administrados durante 1 h para un ratón de 20 g), respectivamente, lo que lo convierte en un método adecuado de preparación de fagos para la inoculación in vivo . Todas las cepas de fagos se almacenaron a 4 °C en tampón salino de magnesio y magnesio (SM) para fagos (receta proporcionada en el paso 1.1.5.1). E. coli se cultivó en medios LB. Para varios pares de fagos-bacterias, se pueden adaptar diversos medios de cultivo y condiciones de crecimiento a partir de este protocolo. Los fagos también pueden obtenerse del medio ambiente, como las aguas residuales, el agua marina, el suelo y el contenido intestinal, y pueden aislarse y purificarse según Sambrook y Russell26 antes de la preparación utilizando las condiciones de crecimiento y propagación adecuadas para cada par de interés fago-huésped25. Alternativamente, los fagos pueden obtenerse de fuentes comerciales (véase la Tabla de materiales) o de bancos de fagos.

<table><tbody><tr><td>1-octanol (99%)</td><td>Thermofisher</td><td>CAAAA15977-AP</td><td></td></tr><tr><td>50 ml PES Steriflip Unidades de filtro de vacío desechables estériles</td><td>Millipore Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>SCGP00525</tr><tr><td>Agarosa (grado de biología molecular / multipropósito / bajo)</td><td>Fisher BioReagents&nbsp;</td><td>BP160-500</td><td></td></tr><tr><td>Amicon&reg; 100kDa Ultra-15 dispositivo de filtro centrífugo, Ultracel-100</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC910008</td><td></td></tr><tr><td>BD Microtainer&reg; Tubos, SST</td><td>BD Medical</td><td>365967</td><td></td></tr><tr><td>Jaulas herméticas de bioexclusión (jaulas ISO)&nbsp;</td><td>Techiplast</td><td>1245ISOCAGE</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch&trade; Termociclador con módulo de reacción rápida de 96 pocillos</td><td>BioRad</td><td>1851196</td><td></td></tr><tr><td>cloruro de calcio dihidratado (cristales blancos a polvo)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP510-500</td><td></td></tr><tr><td>Bloqueos de tapa para tubo de 1,5 ml 100 / paquete</td><td>Andwin Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>16812612</tr><tr><td>Cloroformo (Etanol como conservante/ACS certificado)</td><td>Fisher</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>Perlas de acero recubiertas de cobre (4,5 mm)</td><td>Crosman Corporation</td><td>0767</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Blood & Kit de pañuelos (50)</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Mezcla maestra de PCR verde (2X)</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>K1081</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina disódica de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), para biología molecular, 0,5 M en H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents&trade; Agar, Polvo / Copos, Fisher BioReactivos y comercio; &nbsp;</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents&comercio; Medios de microbiología: Caldo LB (polvo) - Lennox&nbsp;</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP1427-500</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 100 bp Escalera de ADN</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>SM0241</td><td></td></tr><tr><td>Verde FastMix&reg; Mezcla qPCR, 1250 rxns</td><td>QuantaBio</td><td>95072-012</td><td></td></tr><tr><td>Filtros HEPA para tapas isocage, FILTROS H14 ESTERILIZABLES EN AUTOCLAVE PARA LÍNEA ISO- IRRADIADO</td><td>Techiplast</td><td>UISOHEPAXTBOX-300</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio heptahidratado</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP213-1</td><td></td></tr><tr><td>MaxQ 6000 Agitador incubado</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>8354-30-0009</td><td></td></tr><tr><td>Medios de microbiología: Caldo LB (polvo) - Lennox</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1427-500</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga con tapón a presión de bloqueo, 2 ml</td><td>Fisher</td><td>14-666-315</td><td></td></tr><tr><td>Película de sellado Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Existencias de fagos</td><td>Carolina Biological Supply&nbsp;</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>PicoLab&reg; Dieta del ratón 20 EXT</td><td>LabDiet</td><td>5R58</td><td></td></tr><tr><td>Pierce&trade; Kit cuantitativo de endotoxinas cromogénicas</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>A39552S</tr><tr><td>RNasa A (17,500 U)</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de DNasa libre de RNasa</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio (polvo blanco fino)</td><td>Fisher Chemical</td><td>BP328-500</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (cristalino/ACS certificado)</td><td>Sonicador</td><td>Fisher Chemical S271</td><td></td></tr><tr><td>(modelo de sonda CL-18; modelo de fuente de alimentación FB50)</td><td>Fisher scentific&nbsp;</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Aislador de película flexible estéril&nbsp;</td><td>Clase Biológicamente Limpio&nbsp;</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>SYBR&comercio; Tinción de gel de ADN seguro</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>T100 Termociclador&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>cebador de fagos T4, adelante (CCACACATAGCGCGAGTATAA)</td><td>IDT</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Cebador de fagos T4, adelante (GAAACTCGGTCAGGCTATCAA)</td><td>IDT</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>TissueLyser II&nbsp;</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl, solución 1M, pH 8.0, grado de biología molecular, Thermo Scientific ultrapuro</td><td>;</td><td></td><td></td>AAJ22638AE</tr><tr><td>Agua, (libre de ADNASA, ARNASA)</td><td>BioReactivos de Fisher</td><td>BP2484100</td><td></td></tr></tbody></table>

interacción entre bacteriófagos t4 y e. coli en el intestino murino: un modelo prototípico para estudiar la dinámica huésped-bacteriófago in vivo

T4 Bacteriophage and E. coli Interaction in the Murine Intestine: A Prototypical Model for Studying Host-Bacteriophage Dynamics In Vivo

Los bacteriófagos (fagos) son virus que infectan bacterias con especificidad a nivel de especie y cepa y son las entidades biológicas más abundantes en todos los ecosistemas conocidos. Dentro de las comunidades bacterianas, como las que se encuentran en la microbiota intestinal, los fagos están implicados en la regulación de la dinámica de las poblaciones de microbiota y en el impulso de la evolución bacteriana. En la última década ha habido un renovado interés en la investigación de fagos, en parte debido a las capacidades de eliminación específicas del huésped de los fagos líticos, que ofrecen una herramienta prometedora para contrarrestar la creciente amenaza de las bacterias resistentes a los antimicrobianos. Además, estudios recientes que demuestran que los fagos se adhieren al moco intestinal sugieren que pueden tener un papel protector en la prevención de la invasión bacteriana en el epitelio subyacente. Es importante destacar que, al igual que los microbiomas bacterianos, los fageomas alterados se han asociado con peores resultados en enfermedades como la enfermedad inflamatoria intestinal. Estudios anteriores han demostrado que los fagos pueden modular el microbioma de animales y humanos a través de trasplantes de filtrado fecal, lo que beneficia la salud del huésped. Con esta reciente ola de investigación surge la necesidad de establecer y estandarizar protocolos para estudiar los fagos en el contexto del microbioma intestinal. Este protocolo proporciona un conjunto de procedimientos para estudiar los fagos T4 aislados y su huésped bacteriano, Escherichia coli, en el contexto del tracto gastrointestinal murino. Los métodos descritos aquí describen cómo partir de un lisado de fagos, administrarlo a ratones y evaluar los efectos sobre el huésped bacteriano y los niveles de fagos. Este protocolo puede modificarse y aplicarse a otros pares fago-bacteria y proporciona un punto de partida para estudiar la dinámica huésped-fago in vivo.

Para investigar las interacciones entre el fago T4 y la díada E. coli en el intestino murino, se prepararon, limpiaron y purificaron los lisados del fago T4 y del vehículo (Figura 1A). Los lisados de fagos T4 se titularon mediante ensayo de placa y se diluyeron a 2 x 107 ufp/ml (2 x 106 ufc/ratón) en tampón SM. Los lisados de vehículos también se titularon para confirmar la ausencia de presencia de fagos viables y se diluyeron en el mismo volumen de tampón SM que el lisado de fagos T4. Los niveles de endotoxinas se cuantificaron en lisados diluidos utilizando un kit de cuantificación de endotoxinas cromogénicas. El fago T4, el fago inactivado por calor y el lisado de vehículos tenían niveles de endotoxinas por debajo de los niveles aceptables para el agua potable (&lt;20 UE/ml)25 (Figura 1B). Como el lisado del vehículo tenía una cantidad de endotoxina similar a la del lisado del fago T4, se consideró que era un control adecuado. El lisado de fagos inactivado por calor (2 x 107 puf/mL antes del tratamiento térmico) tenía menos endotoxinas que el lisado de fagos del vehículo y T4. De acuerdo con las instrucciones del kit, las muestras que habían sido tratadas con 1-octanol se analizaron para determinar la inhibición del ensayo mediante la adición de un patrón de endotoxinas al lisado del vehículo (vehículo con picos), para obtener una concentración final de 0,5 UE/ml. Los niveles de endotoxinas de los vehículos aumentados menos los niveles de endotoxinas de los vehículos midieron 0,5 UE/ml ±25%, según las recomendaciones del fabricante (Figura 1B). Esto demostró que el 1-octanol se eliminó con éxito y que no hubo inhibición del ensayo causada por los lisados que pudiera interferir con los resultados del ensayo.
E. coli Los ratones C57BL/6 monocolonizados K-12 (BW25113) se criaron dentro de un aislador de vinilo de película flexible estéril en condiciones gnotobióticas (Figura 2A). Los ratones de la generación F0 fueron colonizados con E. coli a través de su adición a su entorno y co-vivienda. Solo se utilizaron para los experimentos la progenie (generación F1 y F2) que fue colonizada con E. coli desde el nacimiento a través de la transmisión vertical y el co-alojamiento. Esta estrategia controló los cambios en el sistema inmune, la producción de moco y el desarrollo del tracto gastrointestinal que ocurren en respuesta a la inoculación bacteriana22,37, lo que permite medir los cambios que ocurren solo debido a la introducción de fagos. Una vez maduros, los ratones experimentales fueron transferidos a isojaulas estériles, donde cada uno recibió 2 x 106 pfu de fago T4 o un volumen igual de lisado de vehículo por sonda oral a las 6-8 semanas de edad. La abundancia de fagos T4 y E. coli se monitoreó durante cuatro semanas mediante la recolección de gránulos fecales y ensayos de siembra puntual en agar al 0,5% (blando) o agar al 1,5%, respectivamente. En el transcurso de este experimento, el fago T4 y E. coli pudieron coexistir sin que ninguna de las poblaciones se agotara (Figura 2B, C). La administración oral de fagos T4 a dosis más bajas de 2 x 102 y 2 x 104 ufp/ratón no redujo la capacidad del fago T4 para colonizar el intestino en comparación con 2 x 106 ufp (Figura 2D). Del mismo modo, no se observó un efecto dosis-dependiente de la inoculación de T4 sobre los niveles de E. coli (Figura 2E).
Es importante destacar que se encontró que la consistencia en la siembra entre las muestras es crucial para el recuento de placas. Por ejemplo, al añadir bacterias al agar blando, se determinó que la densidad de bacterias influía en gran medida en el resultado del ensayo. La adición de E. coli subcultivada durante 1 h, 1,5 h o 2 h, dio como resultado recuentos de placa más bajos que con la adición de E. coli subcultivada durante 2,8 h o más. Además, la cuantificación de la placa se estabilizó en ~1 x 109 pfu/mL cuando E . coli se subcultivó durante 2,8 h a 16 h (durante la noche), lo que supuso un aumento de aproximadamente 5 veces en comparación con el valor calculado a partir de un subcultivo de 1 h (~2 x 108 ufp/ml) (Figura 3A). En lugar de subcultivar, las bacterias objetivo se pueden inocular en agar blando a partir de cultivos nocturnos. Aquí, el volumen de las 16 h (durante la noche) del cultivo de E. coli que se inoculó en el agar blando afectó los recuentos de placa (Figura 3B). Estos resultados indican que la densidad de E. coli dentro del agar puede influir en los recuentos de placas. En ambos enfoques, los resultados de la cuantificación de fagos se estabilizaron en el mismo valor (109 ufp/ml), lo que sugiere que las bacterias objetivo deben tener una densidad suficientemente alta en el agar blando para garantizar la precisión del recuento de placas.
En conjunto, estos resultados ponen de manifiesto la importancia de desarrollar una comprensión de la cinética de los fagos y las bacterias a través de experimentos piloto in vitro e in vivo antes de realizar manipulaciones experimentales.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65906/65906fig01v2.jpg"> Figura 1: Preparación de lisados de fagos. (A) Flujo de trabajo para iniciar un lisado de fagos a partir de un stock de fagos de alto título. Los lisados se propagaron, limpiaron, concentraron y eliminaron las endotoxinas. El 1-octanol contaminante se eliminó mediante el vacío de velocidad. (B) Las endotoxinas se cuantificaron en lisados de fagos y vehículos utilizando un kit de cuantificación de endotoxinas cromogénicas. Las líneas azules discontinuas indican los límites superior e inferior para refutar la inhibición del producto en el control de la inhibición del producto (0,5 UE/ml ± 25%). Cada punto representa una de las dos réplicas técnicas. La altura de la barra representa la media en las réplicas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65906/65906fig01largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65906/65906fig02v2.jpg"> Figura 2: Generación de ratones monocolonizados y monitorización de los niveles de fagos y bacterias en gránulos fecales. (A) Flujo de trabajo para colonizar ratones libres de gérmenes con una sola especie de bacteria y generación de ratones monocolonizados F1 y F2. (B-E) Niveles de fago T4 y E. coli detectados en gránulos fecales de ratones C57BL/6 que nacieron monocolonizados con E. coli y fueron inoculados con el fago T4 a las 6-8 semanas de edad. En el día 0 (pre-colonización) y los días indicados después de la colonización, los niveles de fagos T4 se midieron mediante siembra puntual y ensayos de placa utilizando el método de una sola capa de agar. Los niveles de E. coli se midieron mediante siembra puntual en agar 1.5% LB. (B, C) Cinética de los niveles de (B) fagos T4 y (C) E. coli en gránulos fecales recuperados después de la inoculación con 2 x 106 pfu de fago T4 o lisado de vehículo (normalizado para niveles de volumen y endotoxinas). (D, E) (D) Niveles de fagos T4 y (E) E. coli en gránulos fecales recuperados después de la inoculación con 2 x 102 ufp, 2 x 104 ufpf o 2 x 106 ufp de fago T4. Las barras de error representan la media y el error estándar de la media (SEM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65906/65906fig02largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65906/65906fig03v2.jpg"> Figura 3: Precisión de la resolución de problemas en los ensayos de placa. (A) Título de lisado de fagos T4 utilizando cultivos o subcultivos nocturnos de E. coli para la preparación de agar blando (agar 0,5%, LB). Los subcultivos se realizaron utilizando una dilución 1:50 de cultivo de E. coli durante la noche en LB fresco. Se inocularon 5 mL de preparaciones de agar blando con 100 μL de E. coli y 20 μL de fago T4. CaCl2 y MgSO4 no se agregaron al agar blando para estas pruebas, pero se pueden agregar si se desea. Los tiempos de subcultivo de E. coli por debajo de 2,8 h dieron como resultado un título aparente de fagos más bajo. (B) Título de lisado de fagos T4 utilizando diferentes densidades de E. coli en preparación de agar blando. La adición de diferentes volúmenes de E. coli de un cultivo nocturno (no subcultivado, como en A) en el agar blando dio como resultado diferentes títulos aparentes de fagos. Las barras de error representan la incertidumbre calculada del título de fagos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65906/65906fig03largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Los bacteriófagos (fagos), virus que infectan a las bacterias, son un componente integral del microbioma intestinal. Aunque estos habitantes simbióticos impulsan la aptitud bacteriana y la dinámica de la población, se sabe poco sobre cómo afectan a la homeostasis intestinal y a la enfermedad. Este protocolo estudia fagos T4 aislados dentro de un modelo de ratón, adaptables a otros pares fago-bacteriano.

Interacción entre bacteriófagos T4 y E. coli en el intestino murino: un modelo prototípico para estudiar la dinámica huésped-bacteriófago in vivo

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Nuestra investigación tiene como objetivo comprender las interacciones tripartitas entre las bacterias bacteriófagos y el sistema inmune de los mamíferos en el contexto del intestino, el intestino gnotobiótico del ratón. Esperamos obtener información sobre estas interacciones en condiciones de salud y enfermedad para comprender mejor la importancia del microbioma intestinal. Desarrollos recientes han encontrado que los bacteriófagos pueden ser detectados por el sistema inmunológico de los mamíferos.Se ha sugerido que el fageoma intestinal humano puede estar desregulado en enfermedades como el trastorno inflamatorio intestinal, y la estimulación inmunitaria por fagos podría exacerbar los fenotipos de la enfermedad. Nuestro objetivo es proporcionar a otros un protocolo estandarizado para producir un lisado de fagos T4 para su inoculación y enumeración en modelos de ratón gnotobióticos. Estos protocolos pueden desarrollarse y modificarse para su uso con otros pares de bacterias bacteriófagos.

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Investigación

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Immunology and Infection

Inmunología e Infección

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Disección de Host-virus Interacción en la replicación lítica de un Herpesvirus Modelo

Trasplante de médula ósea murina es una técnica ampliamente utilizada para estudiar los mecanismos inmunológicos que regulan injerto contra huésped enfermedad en los seres humanos. La capacidad para monitorear los patrones de tráfico de células...

La inducción de la enfermedad de injerto contra huésped y<em&gt; En Vivo</em&gt; T Monitoreo Celular Utilizando un modelo murino MHC de concordancia

Nosotros describimos métodos para el aislamiento / cultura eficiente y rápida de la microglia viable desde la corteza cerebral neonatal y adulto de la médula espinal. La disección y placas de microglia cortical se puede lograr dentro de los 90 minutos, con la cosecha microglial posterior que tiene lugar ~ 10 días después de la disección inicial.

Microglia cultivo del Sistema Nervioso Central Neonatal y Adultos

Los miembros del género Burkholderia son patógenos de importancia clínica. Se describe un método para la extracción de proteína total bacteriana, usando disrupción mecánica, y electroforesis en gel 2-D para el análisis proteómico posterior.

Extracción de proteínas totales y 2-D Métodos gel de electroforesis para<em&gt; Burkholderia</em&gt; Especies

Aquí, se describe un procedimiento para el establecimiento de la infección sistémica en la rata neonatal con cultivos de Escherichia coli K1. Este procedimiento no invasivo permite la colonización del tracto gastrointestinal, la translocación del patógeno a la circulación sistémica, y la invasión del sistema nervioso central en el plexo coroideo.

Modelo no invasiva de neuropatogénico Escherichia coli La infección en Neonatología Rata

El presente estudio describe el desarrollo y las aplicaciones de un sistema de ensayo de ingeniería genética basado en la transfección de células de leucemia basófila de rata con el gen equino FcεRIα. Las células transfectadas expresan un receptor funcional donde la liberación de mediadores de la respuesta alérgica puede ser activada por IgE y antígeno.

Desarrollo de una In vitro Sistema modelo para estudiar la interacción de Equus Caballus IgE con su receptor de alta afinidad Fc RI

Aprende a producir lisados de bacteriófagos T4 para inocular y enumerar en modelos murinos gnotobióticos. Este protocolo estandarizado permite estudiar las interacciones trípartitas entre fagos, bacterias y el sistema inmune en el intestino.

Interacción entre bacteriófagos T4 y E. coli en el intestino murino: un modelo prototípico para estudiar la dinámica huésped-bacteriófago in vivo (Video) | JoVE Journal

Interacción entre bacteriófagos T4 y E. coli en el intestino murino: un modelo prototípico para estudiar la dinámica huésped-bacteriófago in vivo

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