Name: Marcaje inmunofluorescente en secciones de tejido de la mucosa nasal de ratas con rinitis alérgica mediante inmunoensayo multicolor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-22T14:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Aprende inmunofluorescencia multicolor para evaluar proteínas asociadas a la rinitis alérgica en secciones de mucosa nasal de ratas. Esta técnica permite identificar marcadores clave y explorar mecanismos terapéuticos.

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Este trabajo contó con el apoyo del Departamento Provincial de Ciencia y Tecnología de Sichuan (2021YJ0175).

El protocolo y los procedimientos experimentales han recibido la aprobación del Comité Administrativo y de Investigación Animal de la Universidad de Medicina Tradicional China de Chengdu (Número de registro: 2022DL-010). Se obtuvieron comercialmente ratas macho Sprague Dawley (SD) de ocho semanas de edad, con un peso de 180-200 g (ver Tabla de Materiales) y se alojaron bajo un ciclo de luz/oscuridad natural con temperatura controlada (23 ± 2 °C) y humedad relativa (55% ± 10%). Doce ratas fueron divididas aleatoriamente en dos grupos: el grupo de control y el grupo de AR. Todas las ratas se aclimataron a estas condiciones y se les proporcionó acceso gratuito a comida y agua durante una semana antes del ensayo.
1. Establecimiento de un modelo de RA en ratas
<ol><li>Preparación de la solución sensibilizante: suspender 30 mg de ovoalbúmina (OVA) y 3 g de Al(OH)3 en 100 mL de suero fisiológico (ver Tabla de Materiales)14,15.</li>
	<li>Sensibilización básica: agarrar y sostener a la rata completamente despierta con el abdomen hacia arriba. Desinfecte el abdomen con bolas de algodón empapadas en alcohol al 75%. Utilice una jeringa de 1,5 ml para inyectar 1 ml de la solución sensibilizante preparada en el paso 1.1 en la cavidad abdominal izquierda de las ratas del grupo AR. Repita esta inyección una vez cada dos días durante 14 días (Figura 1A). NOTA: Asegúrese de que la cabeza de la rata esté colocada más abajo que su cola para evitar daños en los intestinos grueso y delgado al insertar la jeringa. El lugar de la inyección se encuentra a 1,5 cm de la línea media ventral. Las ratas del grupo control deben recibir inyecciones intraperitoneales de 1 ml de solución salina normal una vez cada dos días durante 14 días.</li>
	<li>Provocación nasal: Administrar 50 μL de OVA al 5% mediante gotas nasales utilizando una pipeta de 100 μL (Figura 1B) al día siguiente de la sensibilización basal, repitiendo este procedimiento durante 7 días (Figura 1C). NOTA: Prepare la solución de OVA al 5% mezclando 5 g de OVA con 100 ml de solución salina. Para el grupo control, administrar gotas del mismo volumen de solución salina.</li>
</ol>2. Puntuación conductual de ratas
<ol><li>Dentro de los 30 minutos posteriores a completar el desafío nasal final, observe y registre a las ratas con una cámara digital para identificar síntomas como rascarse la nariz, estornudar y secreción nasal, según los criterios de puntuación descritos en la Tabla 1 (Figura 1D). NOTA: La confirmación del modelado de RA exitoso se basa en lograr una puntuación total de ≥5 puntos14.</li>
</ol>3. Adquisición de muestras de mucosa nasal
<ol><li>Sacrificio de ratas: sacrificar las ratas exponiéndolas a una sobredosis de CO2. Después, desinfecte las ratas con etanol al 75% (ver Tabla de Materiales). Use un bisturí para hacer una incisión a lo largo de las dos esquinas de la boca para exponer el tejido muscular (Figura 2A). A continuación, corte las articulaciones del hueso cigomático y la mandíbula a ambos lados del cráneo con unas tijeras de tejido (Figura 2B) y retire la mandíbula (Figura 2C).</li>
	<li>Exposición de la cavidad nasal: separar la piel del maxilar con un hemostático (Figura 2D) para exponer la cavidad nasal (Figura 2E). Corte la conexión ósea entre la cavidad nasal y el maxilar con unas tijeras de tejido (Figura 2F). A continuación, cortar la conexión entre la cavidad nasal y los huesos orbitarios de ambos lados en el agujero infraorbitario (Figura 2G) y extirpar la cavidad nasal (Figura 2H).</li>
	<li>Fijación: colocar la cavidad nasal extraída en paraformaldehído al 4% para su fijación y conservarla a temperatura ambiente durante 24-72 h (ver Tabla de Materiales). NOTA: Asegúrese de que la cantidad de fijador de paraformaldehído utilizada sea suficiente para cubrir completamente las secciones para una fijación adecuada.</li>
</ol>4. Preprocesamiento de muestras de mucosa nasal
<ol><li>Descalcificación: comience fijando los tejidos eliminados del paso 3.1. Lávelos tres veces con PBS durante 20 minutos cada uno. A continuación, lávelos tres veces con agua destilada, cada vez durante 20 minutos. Posteriormente, descalcificar los tejidos en una solución de descalcificación con un volumen de 20-30 veces el de los tejidos a temperatura ambiente.<ol><li>La solución de descalcificación (ver Tabla de Materiales) debe mantener un pH de 7.2-7.4. Finalmente, coloque el tejido descalcificado en una caja de deshidratación. NOTA: La solución descalcificante debe cambiarse semanalmente. El proceso de descalcificación puede concluir cuando el tejido se ablanda (aproximadamente 2 meses).</li>
	</ol></li>
	<li>Deshidratación y encerado: transfiera la caja de deshidratación a un deshidratador (ver Tabla de Materiales). Comience con 75% de alcohol durante 4 h, seguido de 85% de alcohol durante 2 h, 90% de alcohol durante 2 h y 95% de alcohol durante 1 h.<ol><li>Posteriormente, sumerja el tejido en etanol anhidro durante 30 minutos, repita el proceso durante otros 30 minutos, use xileno durante 5-10 minutos, repita este paso durante otros 5-10 minutos, sumerja el tejido en cera durante 1 h, repita este paso durante otra hora y, finalmente, sumerja el tejido en cera durante 1 hora adicional.</li>
	</ol></li>
	<li>Incrustación: coloque el bloque de cera derretida en la caja de incrustación (consulte la tabla de materiales) y guárdelo en un congelador a -20 ° C. Una vez que la cera se solidifique, retírala y recorta el bloque de cera.</li>
	<li>Loncheado: insertar el bloque de cera recortado en un micrótomo de parafina (ver Tabla de materiales) y cortarlo en rodajas con un grosor de 3 μm. Coloque las rodajas en un baño de agua a 40 °C en un esparcidor deslizante. Aplanar el pañuelo, luego levantarlo con un portaobjetos de vidrio y hornearlo en un horno a 60 ° C.<ol><li>Una vez que el agua se haya evaporado y la cera esté bien fraguada, retire los portaobjetos y guárdelos a una temperatura de 25 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Tinción de H&E del tejido de la mucosa nasal
<ol><li>Desparafinado e hidratación: colocar las rodajas en xileno durante 20 min, repetir el proceso durante otros 20 min, etanol absoluto durante 5 min, repetir este paso durante otros 5 min, alcohol al 75% durante 5 min, y finalmente, lavar durante 5 min.</li>
	<li>Tinción con hematoxilina: dispensar 100 μL de solución de tinción con hematoxilina (ver Tabla de materiales) durante 3-5 min con una pipeta de 100 μL, enjuagar durante 5-10 s, añadir 100 μL de etanol de ácido clorhídrico al 0,5% durante 10-30 s, enjuagar durante 5-10 s, añadir 100 μL de agua amoniacal al 0,2% durante 10-30 s y enjuagar durante 30 s. NOTA: Después de la tinción con hematoxilina, es necesaria la diferenciación con etanol de ácido clorhídrico al 0,5% para eliminar el exceso de colorante de hematoxilina unido al núcleo y absorbido por el citoplasma. Cuando se realiza la tinción con eosina, los núcleos y el citoplasma se tiñen claramente. Las rodajas aparecerán rojas o rosadas después de la diferenciación con etanol de ácido clorhídrico al 0,5%, así que enjuague inmediatamente después de la diferenciación para eliminar el ácido de las rodajas de tejido y detener la diferenciación. A continuación, utilice agua con amoníaco al 0,2% para mejorar la tinción nuclear.</li>
	<li>Tinción con eosina: utilice una pipeta de 100 μL para dispensar 100 μL de solución de tinción con eosina (consulte la Tabla de materiales) durante 5 min y enjuague durante 30 s.</li>
	<li>Deshidratación y sellado: sumergir las rodajas en etanol absoluto durante 5 minutos, repetir el proceso durante otros 5 minutos, repetir una vez más durante 5 minutos, dimetil durante 5 minutos y xileno durante 5 minutos. Por último, sellar con resina neutra (ver Tabla de Materiales).</li>
	<li>Colocación de la sección teñida en el microscopio: coloque la sección teñida en el microscopio, ajuste el enfoque del microscopio hasta que la imagen sea claramente visible, ajuste el aumento a 40x y capture la imagen.</li>
</ol>6. Inmunotinción multicolor del tejido de la mucosa nasal
<ol><li>Desparafinado e hidratación: siga lo mismo que se mencionó en el paso 5.1.</li>
	<li>Tratamiento con tampón de citrato-fosfato: coloque el tampón de citrato-fosfato (pH 6,0) (consulte la tabla de materiales) en un recipiente apto para microondas. Caliéntalo hasta que hierva, retíralo y luego agrega los portaobjetos al recipiente. Cocine en el microondas a fuego medio durante 8 minutos hasta que hierva, apague el fuego durante 8 minutos y luego cambie a fuego medio-bajo durante 7 minutos.<ol><li>Después del enfriamiento natural, transfiera las rodajas a PBS (pH 7.4), agítelas y lávelas tres veces con una coctelera decolorante, cada vez durante 5 minutos. NOTA: Asegúrese de que el tampón no se evapore durante este proceso y evite que las rodajas se sequen.</li>
	</ol></li>
	<li>Bloqueo de la peroxidasa endógena: secar las rodajas, dibujar un círculo alrededor del tejido con un bolígrafo inmunohistoquímico (para evitar que el anticuerpo se desvanezca) y aplicar una solución de peróxido de hidrógeno al 3% (peróxido de hidrógeno: agua pura = 1:9).<ol><li>Incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 15 min. Después del enfriamiento natural, coloque las rodajas en PBS (pH 7.4) y agítelas en una coctelera decolorante durante tres ciclos de 5 minutos cada uno.</li>
	</ol></li>
	<li>Bloqueo: aplicar un 5% de suero de cabra dentro del círculo e incubar durante 30 min.</li>
	<li>Adición primaria de anticuerpos: retire suavemente la solución de bloqueo, agregue FOXP3 (dilución: 1:200, consulte la tabla de materiales) a la rebanada y colóquela en una cámara húmeda. Incubar a 4 °C durante la noche. NOTA: Agregue una pequeña cantidad de agua a la cámara húmeda para evitar la evaporación de anticuerpos.</li>
	<li>Adición secundaria de anticuerpos: colocar las rodajas en PBS (pH 7,4) y agitarlas en un agitador decolorante durante tres ciclos de 5 min cada uno. Seque suavemente las rodajas y aplique el anticuerpo secundario (IgG H&L contra el conejo de cabra, consulte la tabla de materiales) dentro del círculo. Incubar a temperatura ambiente durante 50 minutos en la oscuridad.</li>
	<li>Preparación de la solución de dilución de tiramida: combinar 100 μL de H 2 O2al 3% con 100 ml de 1x TBST (ver Tabla de Materiales).</li>
	<li>Adición de la solución de trabajo TSA: Mezcle 1 ml de diluyente de tiramida con 2 μl de CY3-tiramida para preparar la solución de trabajo de TSA. Aplicar 100 μL de solución de trabajo TSA a cada rebanada e incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 10 min. Luego, lave las rodajas con PBS tres veces, 5 minutos cada vez. NOTA: Prepare y utilice inmediatamente la solución de trabajo TSA y guárdela a 4 °C en la oscuridad; Tiene una validez de hasta 24 h.</li>
	<li>Repita los pasos 6.2-6.8: cambie a una dilución 1:200 de RORγt (colorante fluorescente FITC) y luego a una dilución 1:200 de TICAM1 (colorante TYP620) (consulte la Tabla de materiales).</li>
	<li>Núcleos contrateñidos con DAPI: agitar suavemente las rodajas para secarlas, aplicar solución de tinción DAPI e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos en la oscuridad.</li>
	<li>Autofluorescencia de apagado: colocar las rodajas en PBS (pH 7,4) y agitarlas en un agitador decolorante durante tres ciclos de 5 min cada uno. Aplique el extintor de autofluorescencia (consulte la Tabla de materiales) a las rodajas, espere 5 minutos y luego lave durante 10 minutos.</li>
	<li>Bloqueo: colocar las rodajas en PBS (pH 7,4) y agitarlas en un agitador decolorante durante tres ciclos de 5 min cada uno. Agite suavemente las rodajas para secarlas y séllelas con el extintor antifluorescente (consulte la tabla de materiales).</li>
	<li>Microscopía: coloque la sección teñida en el microscopio, ajuste el enfoque del microscopio para una visibilidad clara, ajuste el aumento a 20x y 40x y capture la imagen. NOTA: DAPI tiene una longitud de onda de excitación UV de 330-380 nm y una longitud de onda de emisión de 420 nm (luz azul). FITC tiene una longitud de onda de excitación de 465-495 nm y una longitud de onda de emisión de 515-555 nm (luz verde). CY3 tiene una longitud de onda de excitación de 510-560 nm y una longitud de onda de emisión de 590 nm (luz roja). TYP-690 tiene una longitud de onda de excitación de 630 nm y una longitud de onda de emisión de 690 nm (luz rosa).</li>
</ol>

Inmunofluorescencia multicolor del tejido nasal en un modelo de rata con rinitis alérgica

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<li>Yaling, Y., Gui, Y., Shuqi, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+research+advances+of+toll-like+receptors+and+allergic+rhinitis%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Recapitulate%22%5BJournal%5D)">Recent research advances of toll-like receptors and allergic rhinitis.</a> Medical Recapitulate. 23 (7), 1273-1276 (2017).</li>
<li>Shan, H., Jie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+TLR4+gene+polymorphisms+and+allergic+rhinitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Otorhinolaryngology%2C+Head%2C+and+Neck+Surgery%22%5BJournal%5D)">Correlation between TLR4 gene polymorphisms and allergic rhinitis.</a> Journal of Clinical Otorhinolaryngology, Head, and Neck Surgery. 31 (13), 991-994 (2017).</li>
<li>Xu, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoregulatory+mechanism+of+Treg+cells+and+TICAM-1+patients+with+severe+allergic+rhinitis%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Journal+of+Coal+Industry+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immunoregulatory mechanism of Treg cells and TICAM-1 patients with severe allergic rhinitis.</a> Chinese Journal of Coal Industry Medicine. 23 (3), 303-306 (2020).</li>
<li>Granier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tim-3+expression+on+tumor-infiltrating+PD-1%2BCD8%2B+T+cells+correlates+with+poor+clinical+outcome+in+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tim-3 expression on tumor-infiltrating PD-1+CD8+ T cells correlates with poor clinical outcome in renal cell carcinoma.</a> Cancer Research. 77 (5), 1075-1082 (2017).</li>
<li>Badoual, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+expressing+tumor-infiltrating+T+cells+are+a+favorable+prognostic+biomarker+in+hpv-associated+head+and+neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">PD-1 expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in hpv-associated head and neck cancer.</a> Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).</li>
<li>Gustavson, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+unsupervised+pixel-based+clustering+algorithm+for+compartmentalization+of+immunohistochemical+expression+using+automated+quantitative+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Immunohistochemistry+%26+Molecular+Morphology%22%5BJournal%5D)">Development of an unsupervised pixel-based clustering algorithm for compartmentalization of immunohistochemical expression using automated quantitative analysis.</a> Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 17 (4), 329-337 (2009).</li>
<li>Lu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+biomarker+modalities+for+predicting+response+to+PD-1%2FPD-L1+checkpoint+blockade%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Oncology%22%5BJournal%5D)">Comparison of biomarker modalities for predicting response to PD-1/PD-L1 checkpoint blockade: a systematic review and meta-analysis.</a> JAMA Oncology. 5 (8), 1195-1204 (2019).</li>
<li>Hernandez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+immunofluorescence+tyramide+signal+amplification+for+immune+cell+profiling+of+paraffin-embedded+tumor+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification for immune cell profiling of paraffin-embedded tumor tissues.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 667067(2021).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La rinitis alérgica (RA) es una enfermedad inflamatoria no infecciosa de la mucosa nasal que resulta de una combinación de factores ambientales y genéticos. Se ha convertido en un problema de salud mundial, que afecta la eficiencia del trabajo, disminuye la calidad de vida, perjudica el sueño, la función cognitiva y causa irritabilidad y fatiga. La RA afecta a entre el 10 % y el 20 % de la población mundial¹ y conlleva costes económicos sustanciales, causando pérdidas anuales de hasta 30-50 mil millones de euros en los p...

La rinitis alérgica (RA) es una enfermedad inflamatoria crónica no infecciosa de la mucosa nasal mediada principalmente por inmunoglobulina E (IgE) específica1,2. Se caracteriza por síntomas como estornudos, secreción nasal, congestión nasal y picazón nasal. Con la industrialización y la urbanización, la prevalencia de la RA está aumentando gradualmente, afectando aproximadamente al 10%-20% de la población mundial1. La técnica de inmunofluorescencia (IF) es un método de tinción fluorescente que utiliza una reacción de unión anticuerpo-antígeno. Se puede emplear para detectar y cuantificar los niveles de distribución y expresión de proteínas específicas en tejidos biológicos o células. En la investigación de RA, la FI puede detectar simultáneamente múltiples dianas, incluidas citoquinas relacionadas con la RA, células inflamatorias, receptores y más, lo que facilita la exploración de la patogénesis de la RA y los efectos de los fármacos 3,4,5,6.
El proceso de tinción por inmunofluorescencia multicolor (mIF) se parece mucho al FI tradicional, con la adición de un paso de elución de anticuerpos durante cada ronda de tinción. Esta modificación permite la detección simultánea de múltiples biomarcadores en la misma sección de tejido a través de un solo etiquetado secuencial y múltiples rondas de retinción. La mIF se basa en la amplificación de la señal de tiramida (TSA), lo que permite ciclos repetidos de tinción fluorescente de TSA y el uso de calentamiento por microondas para eliminar los anticuerpos mientras se conservan las señales fluorescentes 7,8. En comparación con el FI convencional, el FIm ofrece varias ventajas: (1) puede detectar antígenos débilmente expresados que son difíciles de identificar con el FI convencional 9,10; (2) proporciona una tinción de alta calidad con una relación señal-ruido mejorada; (3) permite cuantificar las estructuras específicas de los tejidos y las regiones de interés11; (4) la multiplexación de múltiples vías utiliza eficientemente los tejidos y conserva los recursos patológicos limitados12; (5) el análisis multiparamétrico a través de mIF ofrece una visión más profunda de los tejidos, descubriendo información biológica oculta13.
En general, mIF permite la observación de diferentes expresiones y distribuciones de antígenos dentro de una misma muestra, facilitando el estudio de las proteínas diana. En el futuro, los investigadores que busquen comprender la expresión y distribución de múltiples proteínas diana encontrarán en esta técnica una opción valiosa. Este estudio demuestra la aplicación de mIF para la tinción de muestras de mucosa nasal de ratas con RA y evalúa el establecimiento de un modelo de RA en ratas.

<table><tbody><tr><td>Al(OH)3</td><td>Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd</td><td>A7130</td><td></td></tr><tr><td>75% etanol</td><td>Anhui Yiren An Co., Ltd</td><td>20210107</td><td></td></tr><tr><td>Amoníaco</td><td>Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd</td><td>2021070101</td><td></td></tr><tr><td>Etanol anhidro</td><td>Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd</td><td>2022070501 Sellador</td><td></td></tr><tr><td>de enfriamiento antifluorescente</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de teñido automática</td><td>Thermo scientific</td><td>Varistain Gemini ES</td><td></td></tr><tr><td>Correderas portadoras</td><td>Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd</td><td>220518001</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de citrato-fosfato </td><td>Servicebio biotechnology co., Ltd</td><td>G1201</td><td></td></tr><tr><td>Solución de reparación de antígenos de ácido cítrico (PH 6.0)</td><td>Xavier Biotechnology Co., Ltd</td><td>G1201</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co.</td><td></td><td></td>220518001</tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd</td><td>CS01-2450</td><td></td></tr><tr><td>CY3-Tiramida</td><td>Sawell Biotechnology Co., Ltd</td><td>G1223-50UL</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sawell Biotechnology Co., Ltd</td><td>G1012</td><td></td></tr><tr><td>Agitador de decoloración</td><td>SCILOGEX</td><td>S1010E</td><td></td></tr><tr><td>Solución de descalcificación EDTA</td><td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd</td><td></td><td></td>CR2203047</tr><tr><td>Secador rápido de calefacción eléctrica </td><td>Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd</td><td>DHG-9240A</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de marcado de cajas de incrustación</td><td>Thermo scientific</td><td>  PrintMate AS</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de incrustación</td><td>Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd</td><td>JB-P5</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de deshidratación rápida de tejidos</td><td>Thermo scientific</td><td>STP420 ES</td><td></td></tr><tr><td>Sellador de película</td><td>Thermo scientific</td><td>Autostainer 360</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Tyramide</td><td>Sawell Biotechnology Co., Ltd</td><td>G1222-50UL</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia</td><td>Sunny Tecnología óptica Co.Ltd</td><td>CX40</td><td></td></tr><tr><td>Foxp3</td><td>Affinity Biosciences Co., Ltd</td><td>bs-10211R</td><td></td></tr><tr><td>Mesa de congelación</td><td>Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd</td><td>JB-L5</td><td></td></tr><tr><td>Cabra Anti-Conejo IgG H&amp; L (HRP)</td><td>Liankebio Co., Ltd</td><td>GAR0072</td><td></td></tr><tr><td>Suero de cabra</td><td>Biosharp</td><td>BL210A</td><td></td></tr><tr><td>H&amp; Kit de tinción E</td><td>Leagene</td><td>DH0020</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas hemostáticas</td><td>Shanghai Medical Devices Co., Ltd</td><td>J31010</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico</td><td>Sichuan Xilong Science Co., Ltd</td><td>210608</td><td></td></tr><tr><td>Pluma inmunohistoquímica</td><td>Biosharp</td><td>BC004</td><td></td></tr><tr><td>Horno microondas</td><td>Midea</td><td>M1-L213B</td><td></td></tr><tr><td>Goma neutra</td><td>Grupo Sinopharm Reactivo químico Co., Ltd</td><td>10004160</td><td></td></tr><tr><td>Ovoalbúmina  </td><td>Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd</td><td>A804010</td><td></td></tr><tr><td>Horno</td><td>Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd</td><td>DHG-9240A</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de palma</td><td>SCILOGEX</td><td>D1008E</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Beyotime Biotechnology Co., Ltd</td><td>P0099-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Escáner de sección de patología</td><td>3DHISTECH Kft</td><td>Pannoramic SCAN </td><td></td></tr><tr><td>Tampón PBS</td><td>Biosharp</td><td>G4202</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta </td><td>Dragón</td><td>KE0003087/KA0056573</td><td></td></tr><tr><td>Rorγ t</td><td>Affinity Biosciences Co., Ltd</td><td>DF3196</td><td></td></tr><tr><td>Bisturí</td><td>Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd</td><td>20170022</td><td></td></tr><tr><td>Agente de enfriamiento autofluorescente Sudan Black B</td><td>Bioengineering Co., Ltd</td><td>A602008-0025</td><td></td></tr><tr><td>Cortadora</td><td>Thermo scientific</td><td>HM325</td><td></td></tr><tr><td>Máquina rebanadora</td><td>Thermo scientific</td><td>HM325</td><td></td></tr><tr><td>Slide</td><td>Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd</td><td>PC2-301</td><td></td></tr><tr><td>Sprague Dawley ratas</td><td>Sichuan Academia de Medicina Tradicional China</td><td>SYX <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/65937/65937eq01.jpg" style="margin: auto; "> 2023-0100</td><td></td></tr><tr><td>TICAM-1</td><td>Affinity Biosciences Co., Ltd</td><td>DF6289</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de tejido</td><td>Shanghai Medical Devices Co., Ltd</td><td>J22120</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de bandeja para hornear para esparcir pañuelos</td><td>Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd</td><td>JK-6</td><td></td></tr><tr><td>TYR-690 tintes fluorescentes</td><td>Shanghai Rutron Biotechnology Co., Ltd</td><td>RC0086-34RM</td><td></td></tr><tr><td>Mezclador de vórtice</td><td>SCILOGEX</td><td>SLK-O3000-S</td><td></td></tr><tr><td>Secador deslizante de baño de agua</td><td>Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd</td><td>JK-6</td><td></td></tr><tr><td>Recortadora de cera</td><td>Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd</td><td>JXL-818</td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd</td><td>2022051901</td><td></td></tr></tbody></table>

marcaje inmunofluorescente en secciones de tejido de la mucosa nasal de ratas con rinitis alérgica mediante inmunoensayo multicolor

Immunofluorescent Labeling in Nasal Mucosa Tissue Sections of Allergic Rhinitis Rats via Multicolor Immunoassay

La rinitis alérgica (RA) es una enfermedad inflamatoria crónica no infecciosa de la mucosa nasal, mediada principalmente por inmunoglobulina E (IgE) específica, que afecta aproximadamente al 10%-20% de la población mundial. Si bien la tinción por inmunofluorescencia (FI) ha sido durante mucho tiempo una técnica estándar para detectar la expresión de proteínas específicas de la enfermedad, las técnicas convencionales de FI tienen una capacidad limitada para detectar los niveles de expresión de tres o más proteínas en la misma muestra. En consecuencia, en los últimos años se han desarrollado técnicas de FI multicolor, que permiten el marcaje simultáneo de múltiples dianas en células o tejidos.
Este protocolo proporciona una visión general completa del proceso para establecer un modelo de RA en ratas, obtener muestras de mucosa nasal y los procedimientos técnicos para la inmunofluorescencia multicolor. Todas las ratas en el grupo de RA exhibieron síntomas típicos como estornudos, secreción nasal y picazón nasal, con observaciones de comportamiento que obtuvieron ≥5 puntos. La tinción con hematoxilina y eosina (H&E) reveló un aumento de los recuentos de células inflamatorias y una alteración de la integridad de la mucosa nasal en el grupo AR. La inmunofluorescencia multicolor (mIF) demostró un aumento de la expresión de RORγt y TICAM-1, mientras que la expresión de Foxp3 disminuyó en el tejido de la mucosa nasal de ratas AR.

Seis ratas SD fueron inducidas con éxito en el modelo AR mediante inyección intraperitoneal de OVA y provocación nasal. La RA fue inducida en todas las ratas del grupo AR, lo que representa el 100% del grupo. Todas las ratas del grupo AR mostraron síntomas típicos como estornudos, secreción nasal y picazón nasal. Todas las observaciones conductuales obtuvieron una puntuación de ≥5 puntos (Tabla 2).
Los resultados de la tinción de H&amp;E enel día 21 del modelado rev...

Este protocolo describe una técnica de inmunofluorescencia multicolor para evaluar el modelo de rinitis alérgica en ratas.

Marcaje inmunofluorescente en secciones de tejido de la mucosa nasal de ratas con rinitis alérgica mediante inmunoensayo multicolor

Allergic rhinitis (AR) is a chronic, non-infectious inflammatory disease of the nasal mucosa, primarily mediated by specific immunoglobulin E (IgE), ...

Nuestra investigación principal se basa en un estudio de rinitis alérgica. Nuestra investigación pretende analizar qué proteínas se asocian con la rinitis alérgica. La inmunofluorescencia multicolor se utiliza actualmente para avanzar en la investigación en nuestro campo.En futuros estudios, nos centraremos en los posibles mecanismos de la MTC en el tratamiento de la rinitis alérgica.

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Los modelos experimentales de ratón de asma alérgica ofrecen nuevas posibilidades para el estudio de patogénesis de la enfermedad y el desarrollo de nuevas terapias. Estos modelos se adaptan bien a los factores de medición que regulan la respuesta inmune alérgica, inflamación de las vías, y la fisiopatología pulmonar.

Modelo murino de asma inducida por alergenos

Se describe una estrategia para controlar la maduración y la migración de las células dendríticas pulmonares en respuesta a la ovoalbúmina en la configuración de las vías respiratorias inflamación inducida por ovalbúmina alérgica. Esta estrategia se puede modificar para evaluar la migración de las células dendríticas pulmonares en la configuración de la infección.

El análisis de la maduración pulmonar de células dendríticas y migración durante la inflamación de las vías alérgica

Este video demuestra la cuantificación de los niveles de mediadores inmunológicos en el extracto de líquido del revestimiento de la mucosa nasal humana neonatal. Un sistema de ensayo múltiplex basado en electroquimioluminiscencia mide estos mediadores evaluando la intensidad de la luz emitida cuando se excitan.

Cuantificación de los niveles de mediadores inmunitarios en el líquido de revestimiento de la mucosa humana

Aquí presentamos un protocolo optimizado y detallado para la inmunotinción doble en secciones de tejido del sistema nervioso central (SNC) y de los ganglios linfáticos periféricos (LN) de rata fijadas en formol, incluidas en parafina.

El análisis inmunohistoquímico en el sistema nervioso central y periférico de la rata de nodo linfático secciones de tejido

Este protocolo de nivel introductorio describe los reactivos, el equipo y las técnicas necesarias para completar la tinción inmunohistoquímica de cerebros de roedores, utilizando marcadores para la microglía y los elementos neuronales como ejemplo.

Primer para inmunohistoquímica en el tejido cryosectioned cerebro de rata: Ejemplo de tinción de microglía y neuronas

Este manuscrito describe el uso de técnicas de absorción nasal y bronquial, específicamente utilizando matrices absorbentes sintéticos (SAM) para el líquido de la mucosa de revestimiento (MLF) de la vía aérea superior e inferior de la muestra. Estos métodos proporcionan mejor estandarización y tolerabilidad que técnicas de muestreo respiratorias existentes.

Absorción de fluidos nasales y bronquiales: precisión muestras de la Mucosa respiratoria humana y laboratorio de procesamiento de muestras

Las trampas extracelulares de neutrófilos (NET) son estructuras tridimensionales generadas por granulocitos neutrófilos estimulados. En los últimos años ha quedado claro que los NET están implicados en una amplia variedad de enfermedades. La detección de NETs en el tejido puede tener relevancia diagnóstica, por lo que se requieren protocolos estandarizados para etiquetar los componentes NET.

Etiquetado de inmunofluorescencia de trampas extracelulares de neutrófilos humanos y murinos en tejido incrustado por parafina

Las células linfoides innatas del grupo 2 (ILC2), implicadas en la inflamación tipo 2, participan principalmente en la respuesta a la infección por helmintos, enfermedades alérgicas, homeostasis metabólica y reparación de tejidos. En este estudio, se demuestra un procedimiento para aislar ILC2s de la mucosa nasal murina y detectar la expresión de CD226.

Aislamiento de células linfoides innatas del grupo 2 de la mucosa nasal del ratón para detectar la expresión de CD226

Este protocolo detalla el procedimiento para la excavación de puntos de acupuntura y demuestra su eficacia en el tratamiento de la rinitis alérgica.

Terapia de incorporación de catgut de acupuntura en la medicina tradicional china para el manejo de la rinitis alérgica

El presente protocolo describe un método novedoso para evitar la contaminación sanguínea en el líquido de lavado nasal (FLN) murino. Dado que este método garantiza la recolección de NLF sin contaminación de la sangre, permite detecciones más precisas de componentes inmunológicos y diversos patógenos respiratorios.

Recolección de líquido de lavado nasal murino sin contaminación de sangre

El blanqueo iterativo espectral extiende la multiplexidad (IBEX) se basa en la técnica IBEX base al agregar bloqueo de heparina para minimizar la unión inespecífica y aprovechar la detección espectral con desmezcla computacional para suprimir la autofluorescencia. Este enfoque acelera la adquisición de imágenes al tiempo que reduce las fuentes de fondo, lo que permite análisis proteómicos espaciales robustos de múltiples rondas y altos parámetros.

Imágenes de alta plexación mediante microscopía confocal espectral para minimizar la fluorescencia tisular inespecífica

Aprende inmunofluorescencia multicolor para evaluar proteínas asociadas a la rinitis alérgica en secciones de mucosa nasal de ratas. Esta técnica permite identificar marcadores clave y explorar mecanismos terapéuticos.

Marcaje inmunofluorescente en secciones de tejido de la mucosa nasal de ratas con rinitis alérgica mediante inmunoensayo multicolor (Video) | JoVE Journal

Marcaje inmunofluorescente en secciones de tejido de la mucosa nasal de ratas con rinitis alérgica mediante inmunoensayo multicolor

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