Seccionamiento automatizado de vibratomo de tejido pulmonar incluido en agarosa para obtener imágenes de fluorescencia multiplex
6 de octubre de 2023
Hemos desarrollado una técnica de procesamiento tisular que utiliza un vibratomo y tejido pulmonar incluido en agarosa para generar secciones pulmonares, lo que permite la adquisición de imágenes de alta resolución de la arquitectura pulmonar. Empleamos la tinción de inmunofluorescencia para observar la expresión espacial de proteínas utilizando marcadores estructurales pulmonares específicos.
Este protocolo es especialmente útil en modelos animales grandes de trasplante y regeneración pulmonar, como los cerdos, donde podemos tomar muestras de pequeñas piezas a lo largo del tiempo. Esta técnica puede ayudarnos a comprender mejor la biología espacial en juego en estos modelos. Esta técnica produce cortes pulmonares mínimamente procesados adecuados para la obtención de imágenes de inmunofluorescencia sin necesidad de recuperación de antígenos, y ha sido eficaz con todos los anticuerpos probados hasta la fecha.
Este procedimiento se puede adaptar para cortar secciones ligeramente más gruesas, digamos alrededor de un milímetro, que luego se pueden usar en microscopía de fluorescencia de lámina de luz para estudiar la expresión espacial de proteínas en un volumen más tridimensional. Nuestra investigación está investigando los factores que influyen en el rechazo del trasplante de pulmón y desarrollando terapias para reducir el rechazo utilizando nuestro modelo porcino. Esta técnica ayuda a comprender los cambios espaciales en las proteínas que afectan los resultados del trasplante después de la cirugía.
Actualmente estamos utilizando esta técnica para explorar el panorama espacial de la expresión de proteínas en nuestro modelo de trasplante de pulmón de cerdo. Esperamos que nos ayude a comprender mejor los mecanismos que subyacen a nuestras terapias experimentales. La clave para tener éxito aquí radica en los avistamientos de vibrátomos, las altas amplitudes de las cuchillas y las velocidades de fuerza más bajas son cosas clave a tener en cuenta si el seccionamiento sale mal.
Descripción general
Este estudio presenta una técnica novedosa de procesamiento de tejidos que utiliza un vibrátomo y tejido pulmonar embebido en agarosa para generar secciones pulmonares de alta resolución. El método permite la tinción por inmunofluorescencia para observar la expresión espacial de proteínas en la arquitectura pulmonar.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología
- Trasplante pulmonar
Antecedentes
- Comprender la biología espacial en modelos pulmonares es fundamental para estudiar el trasplante pulmonar.
- La técnica produce cortes pulmonares mínimamente procesados, adecuados para imágenes.
- Ha sido eficaz con diversos anticuerpos sin requerir recuperación de antígenos.
- Adaptable a secciones más gruesas para técnicas de imagen avanzadas.
Objetivo del estudio
- Investigar los factores que influyen en el rechazo del trasplante pulmonar.
- Desarrollar terapias dirigidas a reducir el rechazo en los trasplantes pulmonares.
- Explorar la expresión espacial de proteínas en un modelo porcino de trasplante pulmonar.
Métodos Utilizados
- Inclusión de tejido pulmonar en agarosa para su seccionamiento.
- Uso de un vibrátomo para crear cortes pulmonares de espesor especificado.
- Tinción de inmunofluorescencia para visualizar la expresión proteica.
- Análisis comparativo de la distribución de los neumocitos tipo dos en muestras humanas.
Resultados principales
- Generación exitosa de cortes pulmonares de alta resolución.
- Identificación de cambios espaciales en proteínas que afectan los resultados del trasplante.
- Mayor recuento de neumocitos tipo dos y mayor cobertura del andamio en muestras infantiles en comparación con adultos.
- Uso efectivo de la técnica en diferentes muestras de tejido pulmonar.
Conclusiones
- La técnica de vibrátomo mejora la comprensión de la arquitectura pulmonar.
- Proporciona información sobre la expresión espacial de proteínas relevante para la biología del trasplante.
- Este método podría facilitar investigaciones futuras en trasplante y regeneración pulmonar.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El corte automatizado con vibrátomo de tejido pulmonar embebido en agarosa permite obtener cortes de pulmón reproducibles y mínimamente procesados para imágenes de fluorescencia múltiple a través de especies. Este protocolo aborda el desafío de preservar la arquitectura pulmonar nativa y la antigenicidad, facilitando un análisis espacial de proteínas de alto contenido, crítico para la investigación traslacional del pulmón. El enfoque mejora la confianza predictiva en modelos pulmonares preclínicos e informa estudios mecanicistas sobre lesión, regeneración y resultados de trasplantes.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la evaluación de la expresión espacial de proteínas en tejido pulmonar nativo para la reducción de riesgos mecanicistas.
- Apoya la validación funcional de dianas al preservar la antigenicidad sin necesidad de recuperación de antígenos.
- Facilita estudios comparativos entre muestras de ratón, cerdo y humano para obtener confianza en las dianas a través de especies.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Proporciona cortes pulmonares estandarizados y reproducibles adecuados para ensayos de inmunofluorescencia múltiple.
- Ofrece lecturas cuantitativas espaciales sobre la localización y abundancia de proteínas.
- Permite la escalabilidad del ensayo y la reutilización de la plataforma para la validación y cribado de anticuerpos.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Se alinea con modelos relevantes para la enfermedad, incluyendo el trasplante pulmonar y lesiones en animales grandes.
- Apoya el descubrimiento traslacional de biomarcadores al permitir la obtención de mapas espaciales de alta resolución de los cambios proteicos.
- Facilita el avance ajustado al riesgo de terapias experimentales mediante la comprensión mecanicista de la remodelación tisular y el rechazo.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este método integra desde el descubrimiento inicial hasta la validación preclínica, apoyando flujos de trabajo en la investigación de lesión pulmonar, regeneración y trasplante.
- Biología del Descubrimiento: Avanza en la prueba de hipótesis sobre la dinámica espacial de proteínas en la arquitectura pulmonar intacta.
- Selección: Proporciona resultados de imágenes cuantitativas y reproducibles para la evaluación de anticuerpos y biomarcadores.
- Análisis: Permite la comparación estadística de la distribución de proteínas y la abundancia de tipos celulares entre diferentes condiciones y etapas de desarrollo.
- Investigación Traducional: Conecta hallazgos preclínicos en modelos animales con el análisis de tejido humano para la alineación de biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable de procesamiento de tejidos y obtención de imágenes, adaptable a múltiples programas de investigación pulmonar.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en los estudios de tejido pulmonar.
- Valor operativo: Estandariza el procesamiento del tejido y la obtención de imágenes para garantizar la reproducibilidad y escalabilidad entre proyectos.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al permitir un análisis espacial robusto de proteínas en modelos traslacionales.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de terapias dirigidas al pulmón y programas de biomarcadores.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo del vibrátomo y en la obtención de imágenes de inmunofluorescencia.
- Necesita acceso a equipos de vibrátomo y microscopía de fluorescencia múltiple.
- Exige la estandarización entre equipos de los protocolos de corte y tinción para garantizar la reproducibilidad.
- Adaptable a diversos modelos pulmonares, aunque puede requerir optimización según el grosor del tejido y la compatibilidad de los anticuerpos.
- Los parámetros de corte y el manejo del tejido deben controlarse cuidadosamente para preservar la estructura nativa y la antigenicidad.
