Cristalización y recopilación de datos a temperatura ambiente in situ utilizando la instalación de cristalización en Harwell y Beamline VMXi, fuente de luz de diamante
8 de marzo de 2024
Presentamos un protocolo para la cristalización de proteínas utilizando la instalación de cristalización en el Complejo de Investigación en Harwell y la posterior recopilación de datos cristalográficos de rayos X in situ de cristales dentro de las placas en la línea de luz de Cristalografía Macromolecular Versátil in situ (VMXi) de Diamond. Describimos los requisitos de la muestra, los protocolos de cristalización y las pautas de recopilación de datos.
La comprensión de las estructuras tridimensionales de las proteínas sustenta el diseño de fármacos, la biotecnología y nuestra comprensión de muchas enfermedades diferentes. VMXI determina las estructuras de las proteínas sin crioenfriamiento, por lo que están mucho más cerca de sus temperaturas naturales. VMXI también mide los datos de difracción de los cristales de proteínas mientras aún están en sus placas de cristalización, evitando cualquier daño por manipulación mecánica.
En el futuro, realmente queremos explotar el increíble rendimiento de VMXI para explorar grandes poblaciones de cristales para identificar muchos estados estructurales diferentes en lugar de la estructura única que las personas a menudo obtienen ahora. También queremos avanzar hacia el desarrollo de fármacos y llevar a cabo el cribado y la optimización de fragmentos dentro de las placas de cristalización. Un nuevo enfoque que promete enormemente.
Descripción general
Este artículo presenta un protocolo para la cristalización de proteínas y la recopilación in situ de datos cristalográficos por rayos X. El método utiliza la línea de luz VMXi para analizar estructuras proteicas a temperaturas naturales, mejorando así la comprensión del comportamiento de las proteínas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología Estructural
- Cristalografía
- Análisis de Proteínas
Antecedentes
- Comprender las estructuras de las proteínas es fundamental para el diseño de fármacos y la investigación de enfermedades.
- Los métodos tradicionales suelen implicar criorefrigeración, lo cual puede alterar los estados de las proteínas.
- VMXi permite la recopilación de datos directamente desde placas de cristalización.
- Este enfoque minimiza el daño mecánico por manipulación en los cristales.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un protocolo para la cristalización eficiente de proteínas.
- Aprovechar las capacidades de VMXi para el análisis estructural de alto rendimiento.
- Explorar múltiples estados estructurales de las proteínas para obtener mejores conocimientos.
Métodos Utilizados
- La cristalización de proteínas en placas NC2.
- La utilización del sistema ISPyB para gestionar propuestas y envíos.
- La recopilación de datos mediante la línea de luz VMXi a 20 grados Celsius.
- La imagen automatizada y el análisis de gotas de cristalización.
Resultados principales
- Recolección exitosa de datos de difracción sin criorefriado.
- Identificación de objetos cristalinos mediante la evaluación CHiMP.
- Gestión eficiente de grupos de muestras y procesos de recolección de datos.
- Mayor rendimiento para explorar diversas estructuras proteicas.
Conclusiones
- El protocolo facilita la cristalización y el análisis de proteínas de alto rendimiento.
- El enfoque de VMXi ofrece ventajas significativas frente a los métodos tradicionales.
- Este método tiene potencial para futuros desarrollos farmacéuticos e investigaciones en biología estructural.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La cristalografía in situ a temperatura ambiente en VMXi permite una interrogación estructural rápida y de alto rendimiento de proteínas, apoyando el descubrimiento temprano de fármacos y la reducción de riesgos mecanicistas. La recopilación directa de datos desde placas de cristalización minimiza los artefactos por manipulación de muestras y acelera la retroalimentación sobre los resultados de cristalización, mejorando la confianza predictiva en la investigación y desarrollo basada en estructuras. Esta metodología está diseñada para agilizar la validación de objetivos y el cribado basado en fragmentos, con acceso remoto global que apoya el avance de carteras a escala empresarial.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite el análisis estructural directo de proteínas a temperaturas cercanas a las fisiológicas para la validación funcional de objetivos.
- Apoya la prueba rápida de hipótesis al proporcionar retroalimentación inmediata sobre los estados de cristalización y unión de ligandos.
- Facilita la reducción de riesgos mecanicistas al capturar múltiples estados conformacionales a través de poblaciones cristalinas.
- Mejora la confianza predictiva para el diseño de fármacos posterior al minimizar los artefactos inducidos por la criogenización.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Prepara sistemas de cristalización validados para cribado y optimización de fragmentos dentro de placas.
- Normaliza los flujos de trabajo de imagen y recopilación de datos mediante la identificación automatizada de cristales basada en aprendizaje automático.
- Permite obtener resultados estructurales cuantitativos y reproducibles para la evaluación confiable de compuestos.
- Se escala a cribado de alto rendimiento con adquisición de datos basada en colas y fusión automatizada de datos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Alinea la recopilación de datos estructurales con condiciones relevantes para la enfermedad al evitar artefactos por criorefrigeración.
- Mantiene la continuidad traslacional desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al permitir cristalografía en serie.
- Proporciona un avance ajustado al riesgo al permitir una evaluación rápida de la unión de ligandos y la dinámica proteica.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este método integra desde el descubrimiento inicial hasta la identificación de compuestos líderes, apoyando el diseño basado en la estructura y la selección de fragmentos dentro de un flujo de trabajo unificado y accesible de forma remota.
- Biología del Descubrimiento: Acelera la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al permitir la determinación rápida y libre de artefactos de la estructura.
- Cribado: Proporciona plataformas de cristalización listas para ensayos, reproducibles, con imágenes automatizadas y recopilación de datos.
- Análisis: Ofrece datos cuantitativos de difracción y fusión automatizada para análisis comparativos robustos.
- Investigación Traducional: Apoya la continuidad preclínica mediante la obtención de estructuras proteicas en condiciones similares a las nativas.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una infraestructura escalable y accesible de forma remota para campañas estructurales repetidas en diversos programas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos.
- Valor operativo: Estandariza y automatiza los flujos de trabajo de cristalización, obtención de imágenes y recopilación de datos.
- Valor estratégico: Permite decisiones más rápidas de avance/no avance y un progreso eficiente en el uso del capital dentro de la cartera.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo y el avance rápido de objetivos validados estructuralmente.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cristalización de proteínas e interpretación de datos de biología estructural.
- Necesita acceso a sistemas automatizados de imagen, identificación de cristales basada en aprendizaje automático e infraestructura de líneas de luz de sincrotrón.
- Exige estandarización entre equipos para el seguimiento de muestras, gestión de datos y protocolos de acceso remoto.
- La adaptación a diversos blancos proteicos y condiciones de cristalización puede requerir optimización del protocolo.
- El rendimiento y la calidad de los datos dependen de la preparación de las muestras y la compatibilidad de las placas con los sistemas automatizados.
