Name: Fabricación y caracterización de organoides de cáncer colorrectal de la línea celular SW1222 en matriz de péptidos autoensamblables ultracortos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-03T13:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Aprende a fabricar organoides de cáncer colorrectal con péptidos autoensamblables ultracortos. Este método optimiza matrices de péptidos para evaluar morfología, viabilidad y proliferación celular.

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Este trabajo contó con el apoyo financiero de la Universidad de Ciencia y Tecnología Rey Abdullah. Los autores agradecen la Subvención del Fondo Semilla de KAUST y el Fondo de Innovación de KAUST otorgados por el Departamento de Innovación y Desarrollo Económico de KAUST. Los autores desean agradecer a los Laboratorios Centrales de Biociencia e Imagen de KAUST por apoyar la caracterización biológica y los análisis de microscopía.

1. Preparación del tampón y de la solución
NOTA: Todas las concentraciones indicadas son concentraciones finales.
<ol><li>Añadir suero fetal bovino (FBS) y penicilina-estreptomicina a una concentración final de 10% y 1%, respectivamente, para preparar el Medio de Dulbecco Modificado de Iscove (IMDM) completo. Almacenar en la oscuridad a 4 °C hasta por 1 mes.</li>
	<li>Mezcle MgCl2 (3 mM), sacarosa (300 mM) y Triton X-100 (0,5%) en solución salina tampón de fosfato (PBS) para preparar el tampón de permeabilización. Almacene esta solución a 4 °C durante un máximo de 2 meses.</li>
	<li>Combine la albúmina sérica bovina (BSA, 1%), la glicina (0,3 M) y la Tween-20 (0,1%) en PBS para preparar un tampón de bloqueo. Almacene esta solución a 4 °C durante un máximo de 2 meses.</li>
	<li>Diluya de 10 a 2 veces PBS con agua ultrapura en condiciones estériles. Guarde esta solución a temperatura ambiente durante más de 6 meses.</li>
	<li>Esterilice 3 mg del polvo peptídico bajo luz ultravioleta durante 30 min. Añadir 500 μL de agua ultrapura para disolver con un mezclador de vórtice. NOTA: La concentración final debe ser el doble de la concentración objetivo, es decir, 6 mg/mL, ya que la concentración 1x será de 3 mg/mL.</li>
</ol>2. Fabricación de organoides de cáncer colorrectal a partir de SW1222 en péptido
<ol><li>Descongele una alícuota durante la noche a 4 °C y manténgala en hielo hasta que sea necesario para preparar el control de la matriz del basamento.</li>
	<li>Coloque una gota de 10 μL de solución peptídica 2x en el centro de cada pocillo en una placa de 24 pocillos. Deje que la placa se incube a temperatura ambiente durante 10 minutos. Alternativamente, deposite de 8 a 10 gotas por pocillo en una placa de 6 pocillos. NOTA: Las muestras destinadas a ser utilizadas en microscopía confocal y electrónica son más accesibles para manipular si se siembran sobre un cubreobjetos estéril.</li>
	<li>Agregue 10 μL de 2x PBS. Mezcle la solución de PBS suavemente con la punta. Deje que los geles se estabilicen durante al menos 20 minutos, asegurándose de que las gotas permanezcan casi intactas. NOTA: El objetivo de la adición de PBS y la mezcla suave es mantener la integridad de la gota y evitar que el hidrogel se extienda en una capa.</li>
	<li>Separe las células SW1222 con una solución de tripsina-EDTA al 0,125% (5 ml). Incubar las células con tripsina a 37 °C durante 5-10 min hasta que se desprendan del matraz. Abstente de golpear el matraz para evitar la aglomeración de células.</li>
	<li>Añadir 5 mL de medio completo para inactivar la tripsina. Filtre la suspensión celular con un filtro celular de 30 μm. Alternativamente, use una jeringa con una aguja de 25 G para romper los agregados.</li>
	<li>Prepare una suspensión celular de 0,4 × 106 células/ml e inyecte 2 μL de la suspensión celular en cada gota de péptido utilizando una micropipeta de 10 μL.</li>
	<li>Incubar las gotas durante 30 min a 37 °C, 5% de CO2. Agregue 0,5 mL de medio suplementado a cada pocillo después de la incubación.</li>
	<li>Mientras espera, prepare el control de la matriz de la membrana basal diluyendo el stock principal (8-12 mg/mL, dependiendo del lote) hasta una concentración final de 3 mg/mL utilizando el medio suplementado. Agregue células a esta solución (800 células por 25 μL). NOTA: La manipulación de la membrana basal debe realizarse en hielo en todo momento. Las puntas deben enjuagarse con PBS helado antes de tocar el hidrogel. De lo contrario, se producirá polimerización dentro de las puntas.</li>
	<li>Coloque 20 μL de gotas de la solución de membrana basal en cada pocillo. Deje que las gotas se gelifiquen incubando durante 20 minutos a 37 °C. Después de gelificar el material, agregue 0,5 mL de medio completo.</li>
	<li>Cambie el medio cada 3-4 días. Observe las células organizándose y mostrando señales de formación de lúmenes ya el día 4.</li>
	<li>Tome imágenes de las células en campo claro el día 1, el día 4 y el día 7 para evaluar el crecimiento de organoides.</li>
</ol>3. Viabilidad y proliferación
<ol><li>Prepare tres placas de pocillos negros para el ensayo de viabilidad y tres placas de pocillos negros para el ensayo de proliferación. Añadir 25 μL de solución peptídica 2x por pocillo y gelar utilizando el mismo volumen de 2x PBS. Siembra las células como se ha descrito anteriormente.</li>
	<li>Prepare tres pocillos para cada formulación de hidrogel peptídico que se utilizará como blancos en la placa de proliferación. No siembre células en estos.</li>
	<li>Retire el medio de la placa del pozo de viabilidad y lave con 1x PBS durante 3 x 5 min.</li>
	<li>Diluir Calceína-AM y homodímero de etidio a 8 μM del kit de viabilidad/citotoxicidad para células de mamíferos (ver Tabla de Materiales) en el mismo tubo cónico protegido contra la luz. Para preparar 2 mL de esta solución a 2 mL de PBS en un tubo cónico protegido contra la luz, agregue 4 μL de la solución madre de Calceína-AM y 8 μL de la solución madre de Ethidium homodimer-1.</li>
	<li>Agregue la solución de homodímero de calceína/etidio preparada en el paso 3.4 a la placa de 96 pocillos. Añadir 100 μL por pocillo. Proteger de la luz e incubar a temperatura ambiente durante 30 min.</li>
	<li>Lavar durante 3 x 5 min con 1x PBS. Visualice un mínimo de tres campos (centro, arriba, abajo) cuando se utiliza un objetivo de 4x o un mínimo de cinco campos (centro, arriba a la izquierda, arriba a la derecha, abajo a la izquierda, abajo a la derecha) cuando se utiliza un objetivo de 10x y 20x bajo un microscopio de fluorescencia.</li>
	<li>Retire el medio de la placa de pocillo de proliferación para asegurar un volumen final de 90 μL.</li>
	<li>Añadir 10 μL de solución de Azul Alamar (ver Tabla de Materiales) hasta alcanzar una concentración final del 10%.</li>
	<li>Proteger de la luz e incubar durante 2-4 h a 37 °C, 5% de CO2</li>
	<li>Utilice un lector de placas de pocillos para medir la fluorescencia (Ex/Em = 530-560/590 nm/nm) o la absorbancia (570 nm). Promedie los valores obtenidos para los espacios en blanco y réstelos de los valores de cada pocillo que contenga celdas.</li>
	<li>Calcule los valores de proliferación promediando la señal de cada condición y restando el promedio de sus respectivos espacios en blanco. Cree gráficos generando un diagrama de caja indexado de la señal relativa de absorbancia/fluorescencia en función del tiempo.</li>
</ol>4. Ensayo de adherencia de las células a la matriz
<ol><li>Prepare 100 μL de hidrogeles peptídicos en dos placas independientes de 96 pocillos.</li>
	<li>Siembre 20.000 células en cada pocillo y agregue 100 μL de medio. Incubar las placas durante 90 min a 37 °C, 5% de CO2.</li>
	<li>Después de la incubación, tome solo una placa y vuelva a suspender cuidadosamente el medio con una micropipeta P200 durante 20-30 s. Tenga cuidado de no alterar el hidrogel manteniendo la punta alejada del gel. Alternativamente, si las propiedades mecánicas del hidrogel lo permiten (G' > 8.000 Pa), se golpean los cuatro lados de la placa del pozo utilizando un vórtice móvil. NOTA: La resuspensión del medio (o el golpeteo de la placa de pocillo con el vórtice) eliminará tanto las células no adheridas como las células con una adhesión tenue a la superficie de la matriz. La unión celular se producirá en 90 minutos, aunque la fuerza de esta unión variará en función de los hidrogeles peptídicos específicos y de sus propiedades adhesivas y aglutinantes. Se sabe que el crecimiento de organoides colorrectales se ve favorecido en matrices con valores de rigidez inferiores a 2.000 Pa. Por lo tanto, debido a que los hidrogeles presentados en este protocolo son blandos y quebradizos, nos esforzamos por utilizar un estrés mecánico suave.</li>
	<li>Retire 100 μL de medio de ambas placas de pocillos y agregue el lavado una vez con 1x PBS.</li>
	<li>Prepare una solución de DAPI de 1 μg/mL. Añadir 100 μL de la solución DAPI a todos los pocillos e incubar durante 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Obtenga imágenes de un número representativo de campos bajo un microscopio de fluorescencia. Asegúrese de que todas las imágenes se obtengan con el mismo objetivo para mantener constante la relación píxel/distancia. NOTA: Imagine nueve campos para un objetivo de 10x o 15 campos con un objetivo de 20x.</li>
	<li>Cargue las imágenes de fluorescencia en el software de análisis de imágenes (por ejemplo, ImageJ) y analice las partículas en todas las imágenes.<ol><li>En el menú Imagen , seleccione Tipo y haga clic en 8 bits.</li>
		<li>En el menú Imagen , selecciona Ajustar y haz clic en Brillo/Contraste. Haga clic en el botón Auto | Aplicar.</li>
		<li>En el menú Imagen , seleccione Ajustar y haga clic en Umbral. Haga clic en el botón Auto y cierre la ventana.</li>
		<li>En el menú Analizar , haga clic en Analizar partículas. Marque la opción de resumen y haga clic en Aceptar.</li>
		<li>En la ventana Resumen , coloque el cursor sobre el menú Archivo y haga clic en Guardar para guardar los valores de resumen.</li>
	</ol></li>
	<li>Exporte los resultados de todas las imágenes a un software de estadísticas estándar.</li>
	<li>Calcule el porcentaje de área cubierta por las células antes y después del estrés. Elabore un diagrama de caja indexado del porcentaje de área con respecto a cada condición.</li>
</ol>5. Inmunotinción de organoides en hidrogel peptídico
<ol><li>Siembre 800 células en gotas de 20 μL de hidrogel peptídico durante 4 días, como se describe en los pasos 2.1-2.10.</li>
	<li>El día 4, retire el medio y lave cada pocillo 2 veces con 1x PBS.</li>
	<li>Añadir 400 μL de una solución de formaldehído al 4%. Incubar la placa de pocillos durante 30 minutos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Retire la solución de formaldehído con un P1000 y lave una vez con 1x PBS.</li>
	<li>Añadir 1 mL de tampón de permeabilización e incubar durante 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Retire el tampón de permeabilización con un P1000 y lave una vez con 1x PBS.</li>
	<li>Añadir 0,5 mL de tampón de bloqueo e incubar durante 30 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Retire el tampón de bloqueo con un P1000 y lave con 1x PBS.</li>
	<li>Diluya el anticuerpo primario en el tampón de bloqueo de acuerdo con las instrucciones del fabricante (consulte la tabla de materiales). Agregue 200 μL a dos pocillos.</li>
	<li>Incubar durante la noche a 4 °C.</li>
	<li>Retire la solución de tinción con un P200 y lávese una vez con 1x PBS.</li>
	<li>Diluir el anticuerpo secundario en tampón de bloqueo, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (ver Tabla de Materiales). Añadir el conjugado de faloidina en una proporción de 1:40 en la solución de anticuerpos secundarios.</li>
	<li>Proteger de la luz e incubar a temperatura ambiente durante no más de 3 h. Retire la solución de tinción con un P200 y lávese una vez con 1x PBS.</li>
	<li>Prepare una solución de DAPI de 1 μg/mL en el tampón de bloqueo. Agregue 300 μL de la solución de DAPI a cada pocillo.</li>
	<li>Proteger de la luz e incubar durante 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Retire la solución de tinción con un P200 y lávese una vez con 1x PBS.</li>
	<li>Proteger de la luz y almacenar a 4 °C durante un máximo de 7 días.</li>
</ol>6. Imagen y análisis de imágenes de organoides en matriz
<ol><li>Obtenga imágenes de las muestras teñidas utilizando un microscopio de epifluorescencia a 10x. Utilice únicamente los canales de faloidina y DAPI.</li>
	<li>Abra el software Cellopose y presione ctrl + L para cargar una imagen. Como el software tendrá acceso a todos los archivos en la ubicación de la imagen seleccionada, asegúrese de guardar todas las imágenes de fluorescencia en la ubicación exacta sin tener ninguna subcarpeta.</li>
	<li>Escriba el diámetro medio de las colonias en el panel Segmentación y haga clic en INTRO.</li>
	<li>Seleccione un modelo personalizado para los organoides del colon y haga clic en el botón Ejecutar modelo . NOTA: Aquí, sugerimos usar dos modelos desde cero en Cellpose2.029,30</li>
	<li>Presione ctrl + s para guardar las máscaras como un archivo .npy.</li>
	<li>Utilice las flechas del teclado para desplazarse por las imágenes de la carpeta y ejecute el modelo de organoides de dos puntos en todas las imágenes de la carpeta.</li>
	<li>Haga una copia de la carpeta y repita los pasos 6.2-6.6 utilizando un modelo para el lumen del organoide del colon.</li>
	<li>Abre ImageJ y haz clic en Plugin | Macros | Correr... para ejecutar el archivo imagej_roi_converter.py disponible en el sitio de Github de Cellpose y esperar a que aparezca una ventana.</li>
	<li>Seleccione el primer archivo de la carpeta de organoides de dos puntos y haga clic en Abrir.</li>
	<li>Seleccione el archivo seg.npy correspondiente al primer archivo y haga clic en Abrir. NOTA: ImageJ convertirá las máscaras en regiones de interés y las superpondrá con las imágenes de fluorescencia correspondientes.</li>
	<li>Haga clic en Seleccionar todo en la ventana Administrador de ROI y haga clic en Medir.</li>
	<li>Haga clic en Archivo | Guardar como... en la ventana Resultados y guarde los resultados. NOTA: Esto dará como resultado un archivo .csv que contiene todas las propiedades de forma de cada colonia en el campo.</li>
	<li>Repita los pasos 6.8-6.12 para la misma imagen en la carpeta para el lumen del organoide del colon.</li>
	<li>Cargue OriginPro y presione ctrl + 3 para abrir el Asistente de importación. Haga clic en el botón de tres puntos y seleccione ambos archivos de .csv correspondientes a las propiedades de organoide y forma de lúmenes para la misma imagen.</li>
	<li>Copie y pegue los resultados de las propiedades de forma de lúmenes en una columna junto a los resultados de la colonia para asegurarse de que cada medición de lúmenes esté emparejada con su colonia respectiva.</li>
	<li>En una nueva columna, divida las áreas del lumen y la colonia para obtener el área relativa del lumen de la colonia que la contiene.</li>
	<li>Seleccione la columna correspondiente a la circularidad de cada colonia y el área de lúmenes. Haga clic en Parcela | 2D básico | Dispersión.</li>
	<li>Haga clic con el botón derecho en la ventana de trazado y seleccione Detalles del trazado. Haga clic en la pestaña Centroide (PRO) y marque las opciones que dicen Mostrar punto de centroide para subconjunto, Conectar a puntos de datos y Mostrar elipse.</li>
</ol>

Evaluación de péptidos biofuncionales autoensamblables para la adhesión y morfología celular

<ol><li>Susapto, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrashort+peptide+bioinks+support+automated+printing+of+large-scale+constructs+assuring+long-term+survival+of+printed+tissue+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Ultrashort peptide bioinks support automated printing of large-scale constructs assuring long-term survival of printed tissue constructs.</a> Nano Letters. 21 (7), 2719-2729 (2021).</li>
<li>Loo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemically+well-defined%2C+self-assembling+3D+substrate+for+long-term+culture+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Bio+Materials%22%5BJournal%5D)">A chemically well-defined, self-assembling 3D substrate for long-term culture of human pluripotent stem cells.</a> ACS Applied Bio Materials. 2 (4), 1406-1412 (2019).</li>
<li>Loo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+proteins+and+peptides+as+scaffolds+for+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Self-assembled proteins and peptides as scaffolds for tissue regeneration.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (16), 2557-2586 (2015).</li>
<li>Loo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+bioink%3A+self-assembling+nanofibrous+scaffolds+for+three-dimensional+organotypic+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Peptide bioink: self-assembling nanofibrous scaffolds for three-dimensional organotypic cultures.</a> Nano Letters. 15 (10), 6919-6925 (2015).</li>
<li>Ho, B. X., Pek, N. M. Q., Soh, B. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+modeling+using+3D+organoids+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Disease modeling using 3D organoids derived from human induced pluripotent stem cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), 936(2018).</li>
<li>Li, Y., Tang, P., Cai, S., Peng, J., Hua, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+based+personalized+medicine%3A+from+bench+to+bedside%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Organoid based personalized medicine: from bench to bedside.</a> Cell Regeneration. 9 (1), 21(2020).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+extracellular+matrix+hydrogels+as+alternatives+to+Matrigel+for+culturing+gastrointestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Tissue extracellular matrix hydrogels as alternatives to Matrigel for culturing gastrointestinal organoids.</a> Nature Communications. 13 (1), 1692(2022).</li>
<li>Kaushik, G., Ponnusamy, M. P., Batra, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+current+status+of+three-dimensional+organoids+as+preclinical+models%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: current status of three-dimensional organoids as preclinical models.</a> Stem Cells. 36 (9), 1329-1340 (2018).</li>
<li>Gjorevski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+matrices+for+intestinal+stem+cell+and+organoid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture.</a> Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).</li>
<li>Hauser, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+tri-+to+hexapeptides+self-assemble+in+water+to+amyloid+beta-type+fiber+aggregates+by+unexpected+alpha-helical+intermediate+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Natural tri- to hexapeptides self-assemble in water to amyloid beta-type fiber aggregates by unexpected alpha-helical intermediate structures.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1361-1366 (2011).</li>
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</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

El enorme potencial de los SAP en la investigación biomédica se subraya por su maleabilidad y adaptabilidad a través de la biofuncionalización. Con una gama tan extensa de permutaciones, surge el desafío de probar y determinar de manera eficiente las configuraciones más prometedoras para aplicaciones específicas, especialmente en la investigación de organoides. Una solución rápida y rentable es primordial. La línea celular SW1222, derivada del adenocarcinoma colorrectal humano, emerge como un candidato fundamental para una evaluación intensiva de este tipo. Aquí, presentamos un método para la evaluación y caracterización de organoides cultivados en una matriz basada en péptidos. Este protocolo promete una estrategia integradora y rentable que se centra en el seguimiento y el análisis de los organoides mediante evaluaciones de viabilidad y proliferación, ensayos de adhesión, análisis de formas e inmunocitoquímica. La selección de diferentes concentraciones de péptidos en nuestros experimentos de cultivo celular está respaldada por una lógica cuidadosamente considerada que se alinea con objetivos experimentales específicos y contribuye significativamente a avanzar en nuestra comprensión del cultivo de organoides dentro del contexto de las matrices peptídicas. Nuestro viaje de investigación ha evolucionado con el tiempo, lo que requiere un enfoque diverso para explorar diferentes formulaciones. En primer lugar, la utilización de un rango de concentraciones de péptidos, de 1,5 mg/mL a 4,5 mg/mL, estuvo motivada por el deseo de investigar un espectro de resultados potenciales. Al emplear concentraciones más bajas, nuestro objetivo fue evaluar la concentración mínima de péptidos necesaria para apoyar el crecimiento y desarrollo de los organoides de manera efectiva. Esta información es vital para comprender la viabilidad de aplicaciones rentables y con recursos mínimos. Por el contrario, se eligieron concentraciones más altas para examinar los límites superiores de la concentración de péptidos y su posible impacto en el comportamiento de los organoides, abordando las cuestiones relativas a los efectos de la saturación y los posibles inconvenientes de las concentraciones excesivas de péptidos.
En segundo lugar, los objetivos experimentales específicos guiaron nuestras elecciones. Por ejemplo, al investigar la adhesión celular, se emplearon concentraciones de péptidos para disminuir la fractura del hidrogel bajo estrés. Por el contrario, en los estudios centrados en la viabilidad a largo plazo y la maduración de los tejidos, se utilizaron concentraciones más bajas para lograr los valores reológicos más bajos posibles sin dejar de proporcionar un gel. Además, se eligieron los valores de proliferación para mostrar los diversos perfiles obtenidos a lo largo del tiempo en el cultivo de organoides al emplear formulaciones similares. La importancia de este enfoque diverso radica en su capacidad para producir un conjunto de datos completo que abarca un amplio espectro de condiciones y resultados. Al examinar los efectos de diferentes concentraciones de péptidos en el cultivo de organoides, podemos comprender mejor la interacción matizada entre las propiedades de la matriz y el comportamiento de los organoides.
La evaluación inicial implica el monitoreo de la progresión de las células SW1222 durante una semana en una placa de 24 pocillos utilizando imágenes de campo claro. El análisis general de la morfología y la densidad celular es una técnica rutinaria para las líneas de organoides9 que se está aplicando a la línea celular. La naturaleza no invasiva de este protocolo permite la observación ininterrumpida del cultivo celular, lo que nos permite capturar datos cruciales sobre los cambios morfológicos y la densidad celular de cada colonia en particular. Este análisis inicial puede proporcionar información valiosa sobre la idoneidad de la matriz peptídica autoensamblable ultracorta. Estas observaciones sientan las bases para nuevos análisis en profundidad, demostrando la idoneidad de la matriz peptídica como andamiaje eficaz para apoyar el desarrollo y el crecimiento de los organoides del cáncer colorrectal. Además, pueden surgir observaciones interesantes del seguimiento del crecimiento y los cambios en cada colonia. Por ejemplo, en la Figura 4, podemos observar que las colonias que crecen en Matrigel pueden chocar entre sí, pero parece que un límite se mantiene consistentemente. Sin embargo, las células cultivadas en péptidos reorganizan el péptido de tal manera que para el día 7, las ubicaciones de las células no son exactamente las mismas que antes. Esto es algo a tener en cuenta si este protocolo se exportara a un sistema automatizado que etiquetara y siguiera el crecimiento de los organoides.
El escrutinio posterior implica la evaluación de la viabilidad y proliferación celular mediante un ensayo de viabilidad basado en calceína y homodímero de etidio. El ensayo de viabilidad proporcionará información cualitativa sobre la población de células vivas en comparación con las células muertas. El ensayo de proliferación proporcionará información cuantitativa sobre el estado metabólico de las células para evaluar la división celular31. Se trata de ensayos estándar ampliamente utilizados en el cultivo celular y proporcionan una visión general del estado proliferativo de las células. Si bien se ha demostrado ampliamente que las matrices de SAP son biocompatibles, se sabe que los organoides exhiben una viabilidad reducida debido a condiciones de cultivo subóptimas, incluida la matriz en la que están incrustados. Además, las propiedades mecánicas de las matrices peptídicas pueden influir en la viabilidad celular. Si la matriz es demasiado rígida o rígida, puede someter a las células a un estrés mecánico, lo que puede provocar daños celulares. Por el contrario, si la matriz es demasiado blanda o inestable, es posible que no proporcione suficiente apoyo para la adhesión y la supervivencia de las células. Además, los motivos bioactivos o grupos funcionales presentes en los péptidos pueden interactuar con receptores celulares específicos o vías de señalización, lo que puede provocar la muerte celular. Por lo tanto, es crucial monitorear la viabilidad y proliferación celular de manera continua.
En estudios previos25, el péptido 1 y el péptido 2 mostraron niveles similares de muerte celular en comparación con Matrigel (Figura 5). Sin embargo, se observaron fluctuaciones en los perfiles de proliferación de las células del péptido original con concentraciones variables. En particular, la tasa de proliferación desde el día 4 hasta el día 7 se mantuvo constante en lugar de aumentar, lo que sugiere que las células pueden estar entrando en una etapa menos activa. Además, los cambios en la viabilidad celular observados entre el día 4 y el día 7 también se mantuvieron relativamente constantes, lo que sugiere una posible meseta en el crecimiento y la reproducción.
Para proceder a la evaluación y caracterización, empleamos un ensayo de adhesión adaptado para el cultivo 3D, que se basa en el estrés mecánico para evaluar los efectos del desprendimiento celular32. El método para inducir el estrés mecánico debe elegirse en función de las propiedades mecánicas del hidrogel. La eficacia del método está inherentemente ligada al sistema modelo elegido, y los conocimientos obtenidos dependen de lo bien que represente el contexto biológico. La variabilidad en la adhesión y las características de los organoides puede ser el resultado de numerosas interacciones físicas y químicas, que pueden estar influenciadas por factores como la composición del hidrogel y las propiedades adhesivas de las nanofibras. Estos factores tienen el potencial de afectar la generalización de nuestros hallazgos33. Sin embargo, si el lector tuviera que adaptar este protocolo para hidrogeles más rígidos o altamente dúctiles, considere usar un método de estrés más robusto.
Utilizamos esta técnica para evaluar la adhesividad general proporcionada al SAP por el motivo biofuncional (Figura 6). Observamos dos fenómenos. En primer lugar, los péptidos exhibieron diferentes propiedades adhesivas iniciales. En concreto, se descubrió que el motivo IKVAV y los hidrogeles que contienen una alta concentración del péptido biofuncionalizado se adhieren a las células en más del 40% de su superficie. En segundo lugar, después de la aplicación de estrés inducido, algunos péptidos experimentaron una pérdida significativa de células adheridas. En particular, la capacidad de retención fue relativamente alta en los péptidos que contenían altas concentraciones del péptido no biofuncionalizado. Así, el ligando IKVAV y el SAP ofrecen diferentes tipos de adherencia de las células a la matriz. Este método permite encontrar patrones y dilucidar el mecanismo de adherencia del material. Se podrían utilizar otras técnicas, como la medición de la adhesividad mediante microscopía de fuerza atómica, que se puede utilizar para sondear las fuerzas adhesivas entre la punta de una sonda y la superficie de una muestra a nivel nanométrico, proporcionando información valiosa sobre las propiedades de adhesión de los materiales y las muestras biológicas.
Se evaluó la capacidad de varios materiales peptídicos para inducir la formación de organoides mediante la circularidad de las colonias y el área relativa del lumen de los organoides cultivados en dichos hidrogeles peptídicos. La circularidad se refiere a la redondez o forma de un objeto. En el contexto de los organoides, la circularidad se puede utilizar para evaluar la morfología y la simetría de la estructura. Varios estudios han mencionado las morfologías circulares de los organoides. Por ejemplo, los organoides del cáncer de mama tienden a tener morfologías circulares estrictas con periferias basolaterales en forma de cordón34. Esto sugiere que la circularidad se puede utilizar como parámetro para evaluar la forma de los organoides. El tamaño del lumen se refiere a la cavidad central o espacio dentro de un organoide. Es una característica esencial ya que refleja la diferenciación y maduración del organoide. Durante el proceso de diferenciación, los organoides experimentan una disminución en el tamaño del lumen y un aumento en el grosor de la capa epitelial35. Esto indica que el tamaño del lumen se puede utilizar como indicador de la etapa de desarrollo del organoide. La evaluación de la circularidad y el tamaño del lumen puede proporcionar información valiosa sobre las características estructurales y funcionales de los organoides. Los organoides circulares con lúmenes bien definidos son más representativos de la arquitectura del tejido nativo y pueden imitar mejor la función de los órganos36.
Estas propiedades pueden evaluarse mediante la obtención de imágenes de fluorescencia del citoesqueleto y de los núcleos a partir de las muestras previamente teñidas. Las imágenes se segmentaron utilizando Cellpose, y las mediciones de forma de las máscaras resultantes se obtuvieron utilizando ImageJ. El análisis de la forma de las muestras teñidas con citoesqueleto después de 4 días de cultivo reveló aún más las características de los organoides. Se han empleado métodos similares, centrados principalmente en imágenes de campo claro, para determinar las respuestas de los organoides a su entorno basándose en el análisis de la forma y la determinación de las características del organoide mediante el análisis de imágenes 36,37,38. Por último, utilizamos la inmunocitoquímica para evaluar la polaridad celular con varios marcadores de polaridad. En particular, el uso de un hidrogel peptídico reducirá la manipulación de la muestra, ya que no requiere la extracción de la matriz y la recuperación de los organoides39.
La importancia de este método radica en la versatilidad de los hidrogeles SAP biofuncionales en comparación con otras matrices de origen animal para desarrollar métodos que permitan la traducción de hidrogeles peptídicos en matrices para el cultivo de organoides. La comparación de la matriz peptídica ultracorta autoensamblable con matrices tradicionales como Matrigel o colágeno revela numerosas ventajas. En primer lugar, la matriz peptídica ofrece una reproducibilidad superior, ya que la secuencia peptídica puede controlarse y sintetizarse con precisión, lo que garantiza propiedades y rendimiento consistentes en diferentes lotes40. Además, exhibe una alta estabilidad en términos de propiedades mecánicas y resistencia a la degradación, manteniendo la integridad estructural durante períodos prolongados y proporcionando un microambiente estable para el crecimiento de organoides41. Además, la matriz peptídica ultracorta permite un control preciso y un ajuste fino del microambiente. La secuencia peptídica puede modificarse para incorporar motivos bioactivos específicos o grupos funcionales, presentando las señales deseadas para la diferenciación celular42.
En resumen, la importancia del método radica en su potencial para informar el diseño racional de hidrogeles basados en péptidos para fomentar el cultivo de organoides. A través de la evaluación sistemática de los comportamientos celulares, este protocolo facilita la identificación de composiciones de péptidos prometedoras para optimizar el crecimiento de los organoides. Estos conocimientos están a punto de extenderse a áreas de investigación más amplias, contribuyendo al avance de los estudios basados en organoides y los enfoques de medicina regenerativa.

En los últimos años, los péptidos autoensamblables (SAP) han surgido como biomateriales prometedores para aplicaciones de ingeniería de tejidos. Los SAP poseen propiedades únicas, incluida la formación espontánea de nanofibras, la biocompatibilidad, la biodegradabilidad y la no inmunogenicidad, lo que los convierte en candidatos atractivospara el desarrollo de andamios. Los SAP se han utilizado previamente junto con varios tipos de células y, en particular, los SAP ultracortos reportados han facilitado la encapsulación de células madre mientras mantienen su pluripotencia durante períodos prolongados que abarcan más de 30 pasajes y con una incidencia mínima de aberraciones cromosómicas 2,3,4. Por lo tanto, la adaptación de los SAP para su uso en el cultivo de organoides constituyó un paso racional posterior.
Los organoides son estructuras tridimensionales complejas que surgen de células pluripotentes individuales. Estas estructuras dan lugar a varios tipos de células, que luego se autoorganizan para replicar los procesos de desarrollo del crecimiento embrionario y tisular in vitro5. Este marco innovador se ha convertido en una herramienta formidable para investigaciones in vitro, conservando eficientemente los atributos genéticos, fenotípicos y de comportamiento característicos de los órganos in vivo 6. Sin embargo, un obstáculo principal en la transición del laboratorio a la cabecera del paciente de los hallazgos basados en organoides es la necesidad de reproducibilidad7. Esta variación en los resultados se atribuye principalmente a la dificultad de diferenciar completamente las células madre pluripotentes humanas en linajes celulares especializados, agravada por la ausencia de una arquitectura tisular auténtica y la complejidad inherente que se encuentra en los modelos de organoides. Dado el aumento de la popularidad de los estudios basados en células madre y organoides8, ha habido una creciente demanda de biomateriales con propiedades mecánicas dinámicas y sitios de adhesión similares a las integrinas o andamios con degradabilidad controlada 7,9. Estos atributos se pueden ajustar de manera efectiva a través de la utilización estratégica de SAP biofuncionalizados.
Los SAP son secuencias cortas de aminoácidos con la capacidad inherente de organizarse espontáneamente en estructuras bien definidas10. Estos péptidos a menudo contienen residuos hidrofóbicos e hidrofílicos alternados, que impulsan su autoensamblaje a través de interacciones no covalentes, incluidos los enlaces de hidrógeno, las interacciones electrostáticas y los efectos hidrofóbicos11,12. El proceso de autoensamblaje de estos péptidos está impulsado principalmente por la necesidad de minimizar la energía libre del sistema. Cuando se encuentran en un ambiente acuoso, los residuos hidrofóbicos tienden a agruparse para minimizar su exposición al agua, mientras que los residuos hidrófilos interactúan con las moléculas de agua circundantes. Este fenómeno conduce a la formación de varias nanoestructuras. En este caso, los péptidos ultracortos autoensamblables forman nanofibras con características que dependen de la secuencia peptídica y de las condiciones ambientales 2,12,13,14,15,16. Estos péptidos adoptan una conformación de β vueltas, donde las hebras de péptidos individuales se alinean paralelas o antiparalelas entre sí, estabilizadas por enlaces de hidrógeno (Figura 1). La presencia de iones positivos acelera los procesos de autoensamblaje que conducen a la formación de nanofibras.
Se ha identificado que las nanofibras peptídicas poseen una capacidad innata para atrapar volúmenes significativos de agua. Esta característica facilita la generación de un hidrogel, que posteriormente se manifiesta como un espacio tridimensional biocompatible y biodegradable propicio para la proliferación y el crecimiento celular. Estas nanofibras peptídicas autoensamblables emulan intrincadamente las características topográficas inherentes al entorno natural de la matriz extracelular (ECM)1. Esta semejanza dota a las células de un entorno que imita su hábitat fisiológico, promoviendo aún más las actividades celulares óptimas17. Además, la versatilidad inherente a estos péptidos permite un grado considerable de sintonización4. Dicha adaptabilidad permite cambios en las propiedades de la matriz, como la rigidez, la cinética de gelificación y la porosidad. Estas adaptaciones se logran a través de modificaciones en la secuencia peptídica. En consecuencia, los péptidos autoensamblables (SAP) han surgido como componentes fundamentales en la ciencia contemporánea de los biomateriales, ampliamente utilizados como andamios para la regeneración de tejidos y el cultivo celular13,17.
Una de las ventajas críticas de los péptidos autoensamblables es su capacidad para sintetizarse y modificarse fácilmente a nivel molecular. Esta ventaja permite la incorporación de grupos funcionales específicos o motivos bioactivos en la secuencia peptídica, permitiendo el diseño de péptidos con propiedades y funcionalidades personalizadas 18,19,20 (Figura 1B). Por ejemplo, los SAP biofuncionalizados pueden diseñarse para imitar la MEC y promover la diferenciación utilizando el péptido RGD19,21. También se ha informado que el péptido Ben-IKVAV aumenta significativamente la expresión de marcadores neuronales específicos debido a su motiedad específica del ligando22. Estos péptidos también pueden diseñarse para mostrar moléculas bioactivas, como los péptidos de unión a integrinas, para mejorar la supervivencia celular23. Por último, se han desarrollado otros SAPs biofuncionalizados para promover la angiogénesis mediante la inclusión de los motivos IKVAV y YIGSR en sus estructuras24.
Los SAP biofuncionalizados reportados en una publicación anterior muestran que el autoensamblaje puede modificarse aún más mediante la inclusión del péptido ingenuo del que se derivó el SAP biofuncionalizado25. Estas mezclas de SAP también pueden proporcionar una amplia gama de formulaciones de SAP que varían en su actividad bioquímica y propiedades fisicoquímicas. Por ejemplo, el péptido anfifílico IIFK es un SAP ultracorto que puede soportar la biofuncionalización con varios motivos, ejemplificado por la incorporación del motivo IKVAV (Figura 1B). Ambos péptidos pueden formar nanofibras, tanto solos como combinados. Cada formulación da como resultado hidrogeles con diferentes propiedades físicas (Figura 2)
Sin embargo, debido a la amplia gama de posibles permutaciones y alternativas obtenidas de la biofuncionalización de los SAP, existe la necesidad de proporcionar una opción rápida y rentable para las pruebas de organoides. Un candidato para esta evaluación intensiva y rentable de organoides es la línea celular SW1222, derivada del adenocarcinoma colorrectal humano 26,27. Las células SW1222 poseen características que permiten su agregación en estructuras 3D que se asemejan a organoides, lo que las convierte en un modelo ideal para estudiar el desarrollo de tejidos y las aplicaciones de medicina regenerativa. Las células SW1222 han sido identificadas como capaces de generar organoides debido a su sobreexpresión intrínseca del gen LGR5 27. La creación de organoides a partir de células madre LGR5+ individuales se ha demostrado de manera convincente antes, así como la propensión de las células SW1222 a alcanzar las características morfológicas de un organoide de cáncer colorrectal28.
En este artículo de métodos, presentamos protocolos detallados para evaluar y caracterizar los efectos de varios péptidos biofuncionales sobre la adhesión celular y la formación de lúmenes utilizando células SW1222 (Figura 3). Al proporcionar procedimientos paso a paso y métodos de análisis de imágenes, esperamos ofrecer información valiosa sobre la biofabricación de organoides y la evaluación de matrices SAP simplistas para el cultivo de organoides.

<table><tbody><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>placa de 6 pocillos, tratamiento con cultivo</td><td>de tejidos Corning</td><td>07-200-83</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS, sin calcio, sin magnesio</td><td>Gibco</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>16% de formaldehído (c/v), sin metanol</td><td>Thermo Scientific</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 24 pocillos, tratamiento con cultivo de tejidos</td><td>Corning</td><td>09-761-146</td><td></td></tr><tr><td>Placa negra de 96 pocillos, tratamiento</td><td>con cultivo de tejidos Corning</td><td>07-200-565</td><td></td></tr><tr><td>alamarBlue Reactivo de viabilidad celular</td><td>Invitrogen DAL1025</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-Ezrina, monoclonal de conejo</td><td>Abcam</td><td>ab40839</td><td>Uso secundario: anti-conejo Dylight 633</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-pan Cadherin, policlonal de conejo</td><td>Abcam</td><td>ab16505</td><td>Uso secundario: anti-conejo Alexa 488</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-ZO1 de unión estrecha, policlonal de cabra</td><td>Abcam</td><td>ab190085</td><td>Uso secundario: anti-cabra Alexa 488</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Cellpose 2.0</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Obtenido de https://github.com/MouseLand/cellpose</td></tr><tr><td>microscopio de barrido láser confocal con Airyscan</td><td>ZEISS</td><td>LSM 880</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Burro anti-Cabra Anticuerpo Secundario IgG (H+L), Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11055</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Cytiva</td><td>GE17-1323-01</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario anti-Conejo IgG (H+L) para cabras, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario IgG (H+L) anti-Conejo para cabras, DyLight 633</td><td>Invitrogen</td><td>35562</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino inactivado por calor (HI FBS)</td><td>Gibco</td><td>16140071</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 1.54f</td><td>NIH</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco</td><td>12440079</td><td></td></tr><tr><td>VIVO/MUERTO Kit de Viabilidad/Citotoxicidad, para células de mamíferos</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio, hexahidrato (MgCl2 6 H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel para cultivo de organoides, libre de rojo fenol</td><td>Corning</td><td>356255</td><td>Referido en el manuscrito como Matrigel o matriz de membrana basal.</td></tr><tr><td>Microscopio,</td> Microscopio de campo <td></td><td></td><td></td>claro</tr><tr><td>, EVOS</td><td>Thermo Scientific</td><td>EVOS M7000</td><td></td></tr><tr><td>OriginPro 2023 (64 bits) 10.0.0.154</td><td>OriginLab Corp</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Péptido P (Ac,Ile,Ile,Phe,Lys,NH2)</td><td>NA</td> <td>hecho</td><td>en laboratorio Se puede personalizar con péptido fabricantes como Bachem.</td></tr><tr><td>Péptido P1 (Ac, Ile, Ile, Phe, Lys, Gly, Gly, Gly, Arg, Gly, Asp, Ser, NH2)</td><td>NA</td> <td>hecho en</td><td>laboratorio Puede ser hecho a medida por fabricantes de péptidos como Bachem.</td></tr><tr><td>Péptido P2 (Ac, Ile, Ile, Phe, Lys, Gly, Gly, Gly, Ile, Lys, Val, Ala, Val, NH2)</td><td>NA</td> <td>hecho en</td><td>laboratorio Puede ser hecho a medida por fabricantes de péptidos como Bachem.</td></tr><tr><td>Rhodamine Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos redondos, 10 mm de diámetro</td><td>VWR</td><td>631-0170</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio electrónico de barrido</td><td>Thermo Fisher - FEI</td><td>TENEO VS</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 30 &mu; m filtro</td><td>Sysmex</td><td>04-004-2326</td><td></td></tr><tr><td>sacarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1888</td><td></td></tr><tr><td>SW1222 línea celular</td><td>ECACC</td><td>12022910</td><td></td></tr><tr><td>Triton x-100</td><td>Thermo Scientific</td><td>85111</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA 0.25%</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Agua ultrapura</td><td>Invitrogen</td><td>10977015</td><td></td></tr></tbody></table>

fabricación y caracterización de organoides de cáncer colorrectal de la línea celular sw1222 en matriz de péptidos autoensamblables ultracortos

Fabrication and Characterization of Colorectal Cancer Organoids from SW1222 Cell Line in Ultrashort Self&#45;Assembling Peptide Matrix

Los péptidos autoensamblables ultracortos (SAP) pueden formar espontáneamente nanofibras que se asemejan a la matriz extracelular. Estas fibras permiten la formación de hidrogeles que son biocompatibles, biodegradables y no inmunogénicos. Hemos demostrado previamente que los SAPs, cuando se biofuncionalizan con motivos derivados de proteínas, pueden imitar las características de la matriz extracelular que apoyan la formación de organoides colorrectales. Estos hidrogeles de péptidos biofuncionales conservan las propiedades mecánicas, la capacidad de ajuste y la capacidad de impresión del péptido original al tiempo que incorporan señales que permiten que las interacciones entre la célula y la matriz aumenten la adhesión celular. Este artículo presenta los protocolos necesarios para evaluar y caracterizar los efectos de varios hidrogeles peptídicos biofuncionales sobre la adhesión celular y la formación de lúmenes utilizando una línea celular de cáncer de adenocarcinoma capaz de formar organoides de cáncer colorrectal de manera rentable. Estos protocolos ayudarán a evaluar los efectos del hidrogel de péptidos biofuncionales en la adhesión celular y la formación luminal mediante inmunotinción y análisis de imágenes de fluorescencia. La línea celular utilizada en este estudio se ha utilizado previamente para generar organoides en matrices de origen animal.

Primero, evaluamos las células cultivadas en una placa de 24 pocillos durante 7 días utilizando imágenes de campo claro. Identificamos pequeños grupos de células que se ensamblaban en organoides durante la semana, como se ve en la Figura 4. Un método de escaneo controlado puede seguir la movilidad de las células y los organoides entre diferentes días. En general, observamos la evolución de la morfología de las células durante toda la semana. Los organoides derivados de SW1222 deben tener una morfología redonda y una apariencia clara. Una apariencia más oscura indica una mayor densidad celular no deseada, como se observa en algunas de las colonias cultivadas en el péptido P, día 7 (Figura 4).
En la Figura 5 se muestran los resultados de los ensayos de viabilidad celular (Figura 5A) y proliferación (Figura 5B), que apuntan hacia la cantidad de células muertas y vivas y la actividad metabólica, respectivamente. Aquí, utilizamos un ensayo de viabilidad basado en homodímeros de calceína y etidio y observamos que estas células mostraban una pequeña población de células muertas en el día 7 cuando se cultivaron en Matrigel. Este fenómeno también estaba presente en todos los hidrogeles basados en péptidos, pero no en el cultivo 2D. Los resultados de proliferación mostraron un aumento total de la actividad metabólica entre el día 1 y el día 7. Además, encontramos ligeras disminuciones en la actividad entre el día 4 y el día 7 para varias afecciones. Esta observación se correlaciona con el aumento de la población de células muertas observado en el ensayo de viabilidad (Figura 5A).
Para una evaluación preliminar de la interacción entre las células y la biofuncionalización de los hidrogeles peptídicos, realizamos un ensayo de adhesión basado en estrés mecánico para inducir el desprendimiento celular. Como se puede observar en la Figura 6, el uso de diferentes concentraciones del péptido biofuncional P2 afectó significativamente el número de células retenidas antes y después del proceso de desprendimiento. En este caso, utilizamos un péptido que contiene solo el motivo biofuncional del péptido P2 como control positivo. También se utilizó el péptido no biofuncional P como control negativo. Como se puede observar en el gráfico, las células sembradas en el péptido P tuvieron una adhesión inicial relativamente baja, así como un valor de retención bajo. Además, el cambio en la proporción del péptido biofuncional P2 se correlacionó con la cantidad de células retenidas después del estrés. Por lo tanto, utilizando este ensayo, podemos concluir que el péptido P2 afectó la adhesión celular que puede o no ser impulsada por el motivo biofuncional, pero se correlacionó con la cantidad de péptido biofuncional presente en la mezcla.
Luego, investigamos el efecto de las matrices en los organoides fabricados. Se evaluó la circularidad de la colonia y el tamaño relativo del lumen con respecto al tamaño de la colonia mediante el análisis de forma de muestras teñidas con citoesqueleto cultivadas durante 4 días. Los puntos de datos tenían una distribución particular a lo largo de los ejes x e y, y cada condición tenía un centroide con un valor particular para la circularidad y el área relativa del lumen. La Figura 7 muestra que las células cultivadas en 2D tenían una variación muy alta en la circularidad de la colonia. Por el contrario, las células cultivadas en Matrigel tenían una distribución más extensa para el tamaño relativo del lumen.
Curiosamente, los valores de centroide para todos los hidrogeles que contienen péptidos tenían una posición muy similar. Sin embargo, la distancia entre los puntos de datos mostró diferentes perfiles de distribución. Por ejemplo, el péptido P3 tenía una distribución más pequeña entre los tres hidrogeles peptídicos, mientras que los puntos de datos del péptido no biofuncional P parecían tener una distribución mayor. Estos datos sugieren que tanto los hidrogeles con P1 como los P3 tienen el potencial de optimizarse para el cultivo de organoides.
Finalmente, evaluamos la expresión de marcadores específicos mediante inmunocitoquímica en una muestra teñida para los marcadores apicales ZO-1 y ezrin. Estos marcadores permitieron evaluar la polarización de las células dentro de cada organoide. También evaluamos marcadores de cadherina pan, para visualizar las uniones célula-célula, y un marcador específico del citoesqueleto (faloidina) para visualizar la luz. La figura 8A muestra los organoides encontrados en el péptido no biofuncional P, el péptido biofuncionalizado P1 y Matrigel en el día 4 y el día 7. Los marcadores ZO-1 y ezrin deben localizarse dentro de las membranas apical y basolateral del organoide; La polarización celular adecuada nos permitirá observar la expresión de ambas moléculas en el día 4 cerca del área del lumen, que de otro modo sería invisible. De hecho, como se observa en la Figura 8, los marcadores ZO-1 y ezrin se localizaron en las membranas apicales de los organoides cultivados en Matrigel. Curiosamente, los marcadores de ezrina apenas eran visibles en el péptido no biofuncional P. A partir de esto, inferimos que la polarización ineficiente de las células resultó en una baja expresión de estas moléculas en el péptido P.
Además, la dispersión de los núcleos tendía a ser irregular en los hidrogeles peptídicos, mientras que los organoides incrustados en Matrigel formaban una sola capa asimétrica de núcleos. Esta descripción coincide con la morfología ideal para un organoide colorrectal; sin embargo, aunque la orientación de los núcleos no fue completamente asimétrica en los hidrogeles peptídicos, se encontraron colonias más densas con multicapas de núcleos principalmente en el péptido P no biofuncional. Por el contrario, las uniones célula-célula deben localizarse perpendiculares a las membranas apical y basolateral (Figura 8B). Este marcador nos permitió observar los bordes de todas las células ubicadas dentro de la colonia. Cuando crecieron en Matrigel, las células tenían una distribución radial casi perfecta de pan-cadherina (uniones célula-célula) para el día 7. Por el contrario, las colonias no polarizadas, como las del péptido P, presentaron una disposición desordenada de las células y expresión de uniones célula-célula cerca de la membrana basal y apical.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig01.jpg"> Figura 1: Péptidos ultracortos autoensamblables formando nanofibras. (A) Representación del proceso de autoensamblaje de péptidos alifáticos ultracortos. (B) Estructura química de SAP IIFK ultracorto biofuncionalizado con el ligando IKVAV. Esta cifra fue modificada con respecto a Loo et al.4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig02.jpg"> Figura 2: Estructura y propiedades de los péptidos. (A) Se ilustran las estructuras químicas del péptido original IIFK y el péptido biofuncional P2. (B) Los resultados de la prueba del vial invertido revelan diferencias críticas en la concentración de gelificación y el tiempo de gelificación. P2 forma un gel translúcido con un CGC más alto que el péptido original IIFK. En particular, la mezcla IIFK:P2 (1:1) exhibe un CGC aún más alto y un tiempo de gelificación más largo que cualquiera de los péptidos solos. (C) Las micrografías electrónicas de barrido proporcionan información visual sobre las características estructurales de IIFK, P2 y la mezcla IIFK:P2 (1:1). (D) Las imágenes topográficas de altura de microscopía de fuerza atómica muestran los péptidos gelificados a una concentración de 8 mM, ofreciendo una vista detallada de las características de su superficie. (E) La espectroscopia de dicroísmo circular revela los cambios conformacionales de la mezcla IIFK:P2 a varias concentraciones, arrojando luz sobre sus alteraciones estructurales secundarias. (F) Los análisis reológicos miden la rigidez de los péptidos gelificados a diferentes concentraciones, lo que proporciona información valiosa sobre sus propiedades mecánicas. Esta figura es una reproducción de Pérez-Pedroza et al.25. Barras de escala = 1 μm (C), 200 nm (D). Abreviatura: CGC = concentración crítica de gelificación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig03.jpg"> Figura 3: Diagrama que representa la preparación de péptidos y la siembra de células para la fabricación y caracterización de organoides por viabilidad, adhesión, capacidad de formación de organoides e inmunotinción en hidrogeles peptídicos. Haga <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig03large.jpg" target="_blank">clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig04.jpg"> Figura 4: Imágenes de microscopía de campo claro capturadas de células SW1222 cultivadas dentro de hidrogeles peptídicos marcados como P y P1 en comparación con el control Matrigel . Curiosamente, los organoides cultivados en los hidrogeles peptídicos manifiestan una morfología predominantemente esférica al séptimo día. Por el contrario, los situados dentro de la Matrigel parecen exhibir una densidad celular reducida, lo que se puede decir por su cuerpo brillante, en comparación con el cuerpo oscurecido del cultivo de organoides en SAP (puntas de flecha negras). Sin embargo, exhiben un aparente agrupamiento entre colonias adyacentes. Además, se hace evidente que la capacidad migratoria de las células dentro del entorno Matrigel está comparativamente disminuida. Barras de escala = 650 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig05.jpg"> Figura 5: Ensayos de viabilidad y proliferación de células SW1222 en SAP biofuncionalizado a varias concentraciones. (A) Evaluación de la viabilidad de células cultivadas en péptidos biofuncionales P1 y P2, en comparación con Matrigel y 2D. (B) Evaluación de la proliferación de cultivos celulares en péptidos no biofuncionales P1 y péptidos biofuncionales P2, en comparación con Matrigel y controles 2D. Aquí, vemos un comportamiento similar al de las células que crecen en Matrigel para el ensayo vivo/muerto. Un ligero aumento de células muertas (puntas de flecha amarillas) se encuentra en varias afecciones, principalmente Matrigel. En el caso de la proliferación, las tendencias varían en función del tipo y la concentración del péptido, pero en general, hay una tendencia positiva. Barras de escala = 250 μm. Esta figura fue adaptada de Pérez-Pedroza et al.25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig06.jpg"> Figura 6: Efectos del péptido sobre el número de células desprendidas. (A) Imágenes de fluorescencia de células teñidas con DAPI antes y después del estrés mecánico. En este caso, utilizamos el péptido P, el péptido P2 modificado y el motivo IKVAV. (B) El cambio en la adhesión celular se determinó midiendo el área cubierta en la Imagen J. El análisis comparativo reveló que el péptido biofuncionalizado P2 tenía una mayor capacidad de retención en comparación con el péptido no biofuncional P. Barras de escala = 100 μm. Esta figura fue adaptada de Pérez-Pedroza, et al.25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig07.jpg"> Figura 7: Evaluación de la capacidad de formación de organoides mediante el cálculo del centroide del área relativa del lumen frente a la circularidad. El centroide y la dispersión de los datos variaron entre los tratamientos. Como era de esperar, la condición de peor rendimiento fue la de las mediciones 2D, que se expandieron en una amplia gama de valores de circularidad y tenían el área relativa más baja del lumen. Matrigel no solo tenía la circularidad más alta, sino también el lumen más grande. Las condiciones peptídicas variaron ligeramente en ambos valores, pero la condición P3 mantuvo la variación más insignificante de los datos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig08.jpg"> Figura 8: Imágenes de microscopía confocal de organoides en el día 4 y el día 7 para varios marcadores. (A) Los marcadores ZO-1 (verde), ezrin (rojo) y DAPI (azul) se utilizan para encontrar la distribución apical de las células dentro de los organoides. Como se ha visto en el control Matrigel, estas moléculas se localizan típicamente en las membranas apical y basolateral. El péptido P no biofuncional muestra la expresión de estas moléculas solo en el día 7. (B) Los marcadores de unión célula-célula teñidos con anticuerpos pan-cadherina (verde) deben ser perpendiculares a las membranas basolateral y apical de los organoides. Los núcleos celulares (azul) y el citoesqueleto (rojo) se utilizan como contratinción. El péptido no biofuncional P indujo la expresión de la unión célula-célula en la membrana basolateral, a diferencia de los otros dos tratamientos (P3 y Matrigel). Barras de escala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig08large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Este protocolo tiene como objetivo evaluar péptidos biofuncionales autoensamblables para la adhesión celular, la morfología de organoides y la expresión génica mediante inmunotinción. Utilizaremos una línea celular de cáncer colorrectal para proporcionar una forma rentable de obtener organoides para pruebas intensivas.

Fabricación y caracterización de organoides de cáncer colorrectal de la línea celular SW1222 en matriz de péptidos autoensamblables ultracortos

Ultrashort self-assembling peptides (SAPs) can spontaneously form nanofibers that resemble the extracellular matrix. These fibers allow the formation of ...

Nuestra investigación tiene como objetivo evaluar péptidos ultracortos autoensamblables como matrices para cultivos de organoides de cáncer colorrectal. Abordamos cuestiones sobre la morfología de los organoides, la viabilidad, la proliferación, la adhesión y el impacto de la biofuncionalización. El objetivo es optimizar las composiciones de las matrices peptídicas para un crecimiento eficaz de organoides y contribuir a la medicina regenerativa.Las tecnologías de vanguardia en nuestro campo incluyen la bioimpresión 3D para la fabricación orgánica precisa, plataformas microfluídicas para entornos de cultivo dinámicos y herramientas de imagen avanzadas como la microscopía de fuerza atómica y la microscopía multifotónica. La edición genética CRISPR-Cas9 refina la modificación genética, mientras que la secuenciación de ARN de una sola célula proporciona información molecular en profundidad. Los desafíos experimentales actuales incluyen mejorar la reproducibilidad de los organoides, refinar la vascularización para construcciones más grandes e imitar la arquitectura de tejidos complejos.La superación de estas limitaciones en el cultivo a largo plazo y la incorporación de componentes inmunes en los modelos son áreas activas. Lograr protocolos estandarizados y abordar las preocupaciones éticas que se oponen a los desafíos actuales en este campo. Los hallazgos significativos en nuestro campo incluyen la demostración de la idoneidad de péptidos autoensamblables ultracortos para cultivos de organoides.Hemos demostrado la versatilidad, reproducibilidad y estabilidad de estos péptidos, proporcionando una plataforma para el ajuste fino de los microentornos. Esto contribuye al avance de los estudios basados en organoides, la medicina regenerativa y la investigación de hidrogeles biofuncionales. Nuestro protocolo cierra la brecha y la investigación, proporcionando un enfoque sistemático para evaluar organoides en matrices peptídicas autoensamblables ultracortas.Aborda la necesidad de métodos estandarizados para evaluar el comportamiento celular dentro de estas matrices, ayudando en el diseño duradero de hidrogeles basados en péptidos para un crecimiento óptimo de organoides y avanzando en los estudios de medicina regenerativa.

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Fabricación y caracterización de organoides de cáncer colorrectal de la línea celular SW1222 en matriz de péptidos autoensamblables ultracortos

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