Name: Edición del genoma CRISPR-Cas9 de embriones de rata mediante virus adenoasociados (AAV) y electroporación de embriones de 2 células (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-15T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Aprende a editar el genoma de embriones de rata mediante CRISPR-Cas9 utilizando virus adenoasociados y electroporación en embriones de dos células. Este método optimizado facilita la generación de modelos knock-in con alta eficiencia.

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Los autores desean agradecer a Nolan Davis por su ayuda con la videografía y la edición de video.

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Missouri (protocolo ACUC #25580) y se realizaron de acuerdo con las pautas establecidas en la Guía para el Uso y Cuidado de Animales de Laboratorio.
1. Entrega de plantillas de reparación de ADN mediada por AAV
<ol><li>Diseñe la construcción de ADN para que contenga la secuencia de knock-in deseada entre dos brazos de homología. Las longitudes típicas de los brazos de homología son de 300-500 pb de longitud. Asegúrese de que toda la plantilla de reparación del ADN (brazos de homología + secuencia de knock-in deseada) esté flanqueada por repeticiones terminales invertidas (ITR) mediante la clonación en una columna vertebral de plásmido adecuada y el empaquetado en ssAAV1 o ssAAV6 recombinantes (serotipos 1 o 6). NOTA: Si la secuencia diana del sgRNA está presente en la plantilla de reparación del ADN, es importante diseñar mutaciones silenciosas para interrumpir esta secuencia, evitando así la edición mediada por CRISPR-Cas9 del alelo al que se dirige correctamente. PRECAUCIÓN: Los vectores virales AAV recombinantes no se integran y se clasifican como BSL-1. Las técnicas asépticas estándar se utilizan para pipetear y manipular embriones que han estado expuestos al virus.</li>
	<li>Añadir ssAAV1 o ssAAV6 (envasado con plantilla de reparación de ADN) a 30 μL de KSOM-Rmedio 27,28 a una concentración final de 3 × 107 copias del genoma (GC)/μL bajo aceite mineral en una placa de Petri de 35 mm.</li>
	<li>Coloque cigotos con pronúcleos visibles en el medio KSOM-R que contiene ssAAV diseñado. NOTA: Con este protocolo no es necesario adelgazar la zona pelúcida, ya que los serotipos 1 y 6 de AAV pueden pasar fácilmente para una entrega eficiente de la plantilla de reparación del ADN.</li>
	<li>Incubar a 37 °C con 5% de CO2 y humedad máxima durante 18-20 h para permitir una transducción viral suficiente.</li>
</ol>2. Preparación de la electroporación
<ol><li>Al día siguiente, prepare una mezcla de electroporación que contenga 100 ng/μL de sgRNA y 100 ng/μL de proteína Cas9 diluida en medios Opti-MEM en un tubo estéril libre de RNasa. Mezcle suavemente.</li>
	<li>Incubar a temperatura ambiente durante 10 min para permitir la formación de RNP.</li>
	<li>Durante el tiempo de incubación, encienda el electroporador y conecte los cables a un electrodo deslizante de vidrio con un espacio de 1,5 mm.</li>
	<li>Establezca los parámetros de electroporación como se describe en la Tabla 1.</li>
</ol>3. Electroporación de embriones de 2 células
<ol><li>Pipetear suavemente 5 μL de la mezcla de electroporación CRISPR entre los dos electrodos en el portaobjetos de vidrio, teniendo cuidado de no introducir burbujas de aire en la solución.</li>
	<li>Retire el embrión en estadio de 2 células de la solución de AAV. Alinee los embriones en etapa de 2 células en la mezcla sin permitir que toquen los lados de los electrodos. Esto se hace para evitar la lisis.</li>
	<li>Presione el botón Ohm para medir la impedancia. Verifique que la impedancia esté entre 0.100 y 0.300 kΩ. El volumen de reacción alterará la impedancia (agregue volumen para disminuir la impedancia y reste volumen para aumentar la impedancia).</li>
	<li>Presione Inicio. El proceso tarda unos segundos en completarse.</li>
	<li>Extraer los embriones inmediatamente después de la electroporación y lavar 3 veces en gotas frescas de 30 μL de medio KSOM-R.</li>
	<li>Vuelva a colocar los embriones en una incubadora a 37 °C con 5% de CO2 y humedad máxima para el cultivo in vitro en gotas de 500 μL de medio KSOM-R bajo aceite mineral. Alternativamente, transfiere quirúrgicamente los embriones a una rata hembra pseudopreñada post-coito (dpc) de 1,5 días para producir descendencia viva.</li>
</ol><img alt="diagrama de administración de ADN mediado por rAAV; edición de genes CRISPR; electroporación embrionaria; Modelo de roedores." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66069/66069fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: Esquema de la entrega de ADN mediada por AAV y la tubería de electroporación de embriones de 2 células para la edición del genoma CRISPR-Cas9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66069/66069fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<ol><li>Lau, C. H., Tin, C., Suh, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+strategies+for+targeted+transgene+knock-in+and+gene+correction%5BTitle%5D)+AND+%22Fac+Rev%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based strategies for targeted transgene knock-in and gene correction.</a> Fac Rev. 9, 20(2020).</li>
<li>Gutschner, T., Haemmerle, M., Genovese, G., Draetta, G. F., Chin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+Regulation+of+Cas9+during+G1+Enhances+Homology-Directed+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Post-translational Regulation of Cas9 during G1 Enhances Homology-Directed Repair.</a> Cell Rep. 14 (6), 1555-1566 (2016).</li>
<li>Zhang, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+precise+knockin+with+a+double+cut+HDR+donor+after+CRISPR%2FCas9-mediated+double-stranded+DNA+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient precise knockin with a double cut HDR donor after CRISPR/Cas9-mediated double-stranded DNA cleavage.</a> Genome Biol. 18 (1), 35(2017).</li>
<li>Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easi-CRISPR+for+creating+knock-in+and+conditional+knockout+mouse+models+using+long+ssDNA+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors.</a> Nat Protoc. 13 (1), 195-215 (2018).</li>
<li>Gu, B., Posfai, E., Gertsenstein, M., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+large-fragment+knock-in+mouse+models+using+2-cell+%282C%29-homologous+recombination+%28HR%29-CRISPR%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mouse+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of large-fragment knock-in mouse models using 2-cell (2C)-homologous recombination (HR)-CRISPR.</a> Curr Protoc Mouse Biol. 10 (1), e67(2020).</li>
<li>Gu, B., Posfai, E., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+targeted+large+insertions+by+microinjection+into+two-cell-stage+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of targeted large insertions by microinjection into two-cell-stage mouse embryos.</a> Nat Biotechnol. 36 (7), 632-637 (2018).</li>
<li>Kurihara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+repair+protein+RAD51+enhances+the+CRISPR%2FCas9-mediated+knock-in+efficiency+in+brain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">DNA repair protein RAD51 enhances the CRISPR/Cas9-mediated knock-in efficiency in brain neurons.</a> Biochem Biophys Res Commun. 524 (3), 621-628 (2020).</li>
<li>Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+knockout+by+electroporation+of+engineered+endonucleases+into+intact+rat+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos.</a> Sci Rep. 4, 6382(2014).</li>
<li>Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y., Modzelewski, A. J., He, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+mouse+genome+editing+by+CRISPR+ribonucleoprotein+electroporation+of+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes.</a> J Biol Chem. 291 (28), 14457-14467 (2016).</li>
<li>Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+Cas9+protein%2FsgRNA+into+early+pronuclear+zygotes+generates+non-mosaic+mutants+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse.</a> Dev Biol. 418 (1), 1-9 (2016).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+Cas9+protein+into+mouse+zygotes+through+a+series+of+electroporation+dramatically+increases+the+efficiency+of+model+creation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Genet+Genomics%22%5BJournal%5D)">Delivery of Cas9 protein into mouse zygotes through a series of electroporation dramatically increases the efficiency of model creation.</a> J Genet Genomics. 43 (5), 319-327 (2016).</li>
<li>Troder, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+electroporation+approach+for+efficient+CRISPR%2FCas9+genome+editing+in+murine+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An optimized electroporation approach for efficient CRISPR/Cas9 genome editing in murine zygotes.</a> PLoS One. 13 (5), e0196891(2018).</li>
<li>Teixeira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+mice+zygotes+with+dual+guide+RNA%2FCas9+complexes+for+simple+and+efficient+cloning-free+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing.</a> Sci Rep. 8 (1), 474(2018).</li>
<li>Tanihara, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+GGTA1-deficient+pigs+by+electroporation+of+the+CRISPR%2FCas9+system+into+in+vitro-fertilized+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of GGTA1-deficient pigs by electroporation of the CRISPR/Cas9 system into in vitro-fertilized zygotes.</a> BMC Biotechnol. 20 (1), 40(2020).</li>
<li>Tanihara, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+CD163-edited+pig+via+electroporation+of+the+CRISPR%2FCas9+system+into+porcine+in+vitro-fertilized+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Generation of CD163-edited pig via electroporation of the CRISPR/Cas9 system into porcine in vitro-fertilized zygotes.</a> Anim Biotechnol. 32 (2), 147-154 (2021).</li>
<li>Camargo, L. S. A., Owen, J. R., Van Eenennaam, A. L., Ross, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+one-step+knockout+by+electroporation+of+ribonucleoproteins+into+zona-intact+bovine+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Efficient one-step knockout by electroporation of ribonucleoproteins into zona-intact bovine embryos.</a> Front Genet. 11, 570069(2020).</li>
<li>Lin, J. C., Van Eenennaam, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation-mediated+genome+editing+of+livestock+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Electroporation-mediated genome editing of livestock zygotes.</a> Front Genet. 12, 648482(2021).</li>
<li>Betters, E., Charney, R. M., Garcia-Castro, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+in+vitro+culture+of+early+rabbit+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Data+Brief%22%5BJournal%5D)">Electroporation and in vitro culture of early rabbit embryos.</a> Data Brief. 21, 316-320 (2018).</li>
<li>Miyasaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLICK%3A+one-step+generation+of+conditional+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">CLICK: one-step generation of conditional knockout mice.</a> BMC Genomics. 19 (1), 318(2018).</li>
<li>Epstein, B. E., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+engineered+nucleases+with+adeno-associated+viral+vectors+for+therapeutic+gene+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Combining engineered nucleases with adeno-associated viral vectors for therapeutic gene editing.</a> Adv Exp Med Biol. 1016, 29-42 (2017).</li>
<li>Gaj, T., Epstein, B. E., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+adeno-associated+virus%3A+basic+and+clinical+research+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using adeno-associated virus: basic and clinical research applications.</a> Mol Ther. 24 (3), 458-464 (2016).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-READI%3A+Efficient+generation+of+knockin+mice+by+CRISPR+RNP+electroporation+and+AAV+donor+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">CRISPR-READI: Efficient generation of knockin mice by CRISPR RNP electroporation and AAV donor infection.</a> Cell Rep. 27 (13), 3780-3789 (2019).</li>
<li>Mizuno, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-embryo+gene+cassette+knockin+by+CRISPR%2FCAS9-mediated+genome+editing+with+adeno-associated+viral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/CAS9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector.</a> iScience. 9, 286-297 (2018).</li>
<li>Davis, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+DNA+knock-in+using+AAV-mediated+delivery+with+2-cell+embryo+CRISPR-Cas9+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genome+Ed%22%5BJournal%5D)">Efficient DNA knock-in using AAV-mediated delivery with 2-cell embryo CRISPR-Cas9 electroporation.</a> Front Genome Ed. 5, 1256451(2023).</li>
<li>Smirnikhina, S. A., Zaynitdinova, M. I., Sergeeva, V. A., Lavrov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+homology-directed+repair+in+genome+editing+experiments+by+influencing+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Improving homology-directed repair in genome editing experiments by influencing the cell cycle.</a> Int J Mol Sci. 23 (11), (2022).</li>
<li>Takata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous+recombination+and+non-homologous+end-joining+pathways+of+DNA+double-strand+break+repair+have+overlapping+roles+in+the+maintenance+of+chromosomal+integrity+in+vertebrate+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Homologous recombination and non-homologous end-joining pathways of DNA double-strand break repair have overlapping roles in the maintenance of chromosomal integrity in vertebrate cells.</a> EMBO J. 17 (18), 5497-5508 (1998).</li>
<li>Men, H., Stone, B. J., Bryda, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Media+optimization+to+promote+rat+embryonic+development+to+the+blastocyst+stage+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Media optimization to promote rat embryonic development to the blastocyst stage in vitro.</a> Theriogenology. 151, 81-85 (2020).</li>
<li>Men, H., Amos-Landgraf, J. M., Bryda, E. C., Franklin, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KSOM-R+supports+both+mouse+and+rat+preimplantation+embryo+development+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">KSOM-R supports both mouse and rat preimplantation embryo development in vitro.</a> Theriogenology. 198, 69-74 (2023).</li>
<li>Romeo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV+diffuses+across+zona+pellucida+for+effortless+gene+delivery+to+fertilized+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">AAV diffuses across zona pellucida for effortless gene delivery to fertilized eggs.</a> Biochem Biophys Res Commun. 526 (1), 85-90 (2020).</li>
<li>Fulka, J., Moor, R. M., Fulka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrofusion+of+mammalian+oocytes+and+embryonic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Electrofusion of mammalian oocytes and embryonic cells.</a> Methods Mol Biol. 48, 309-316 (1995).</li>
<li>Rems, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+electrofusion+using+nanosecond+electric+pulses%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Cell electrofusion using nanosecond electric pulses.</a> Sci Rep. 3, 3382(2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

El sistema de edición genómica CRISPR-Cas ha revolucionado el campo de la ingeniería genética al permitir la producción eficiente de modificaciones genéticas personalizadas tanto sencillas como complejas en una variedad de especies animales. Los frecuentes refinamientos y mejoras en las técnicas asociadas con la edición del genoma aumentan su versatilidad. Aquí hemos descrito un nuevo enfoque que utiliza la entrega de ADN mediada por ssAAV junto con la electroporación embrionaria de 2 células de reactivos CRISPR-Cas9 en ...

El desarrollo de herramientas de edición genómica basadas en CRISPR ha acelerado nuestra capacidad para generar de manera eficiente modelos de ratas modificados genéticamente nuevos y más sofisticados. El ARN de guía única, junto con la nucleasa Cas9, se combina para formar complejos de ribonucleoproteína (RNP) que se dirigen a secuencias de ADN de interés dentro del genoma y dan lugar a roturas de ADN bicatenario. Debido a que los mecanismos de reparación del ADN celular son propensos a errores, se introducen inserciones y deleciones (INDEL) durante el proceso de reparación que pueden interrumpir la función de un gen diana. Cuando hay una entrega conjunta de una secuencia de ADN modificada deseada (plantilla de reparación) junto con reactivos de edición del genoma, la inserción de la plantilla de reparación en la región que contiene la rotura del ADN bicatenario se produce a través de un proceso llamado reparación dirigida por homología (HDR). Se trata de una estrategia eficaz para generar modelos animales con inserciones/sustituciones de ADN dirigidas (knock-ins). Una limitación es que las secuencias knock-in suelen ser de gran tamaño, lo que se ha demostrado que reduce la eficiencia de la edición de genes, lo que dificulta la generación del modelo deseado1. Las estrategias para aumentar la eficiencia de los knock-in han incluido la linealización de las plantillas de reparación de ADN bicatenario (dsDNA) y ADN monocatenario (ssDNA) y la modificación química de las plantillas de reparación del ADN 2,3,4. Además, se ha intentado la microinyección pronuclear junto con compuestos estimulantes HDR, la aplicación de pulsos eléctricos junto con la microinyección y la microinyección programada en embriones de 2 células 5,6,7. A pesar del éxito de algunos de estos enfoques, la incorporación de secuencias de ADN de más de 1,0 kb sigue siendo un reto técnico.
La electroporación, que es un método común para introducir reactivos en líneas celulares cultivadas, ofrece una alternativa a la microinyección para administrar componentes CRISPR-Cas9 en embriones. La electroporación embrionaria, demostrada por primera vez en embriones de rata8, se ha utilizado desde entonces con éxito como método de administración en ratones 9,10,11,12,13, cerdos14,15 y otros organismos modelo animal 16,17,18. Los embriones, suspendidos en el medio que contiene los reactivos CRISPR-Cas9, se colocan en una cubeta o en un portaobjetos de vidrio entre dos electrodos y se someten a pulsos directos de corrientes eléctricas. Esto crea aberturas transitorias en la zona pelúcida y en la membrana plasmática embrionaria a través de las cuales los componentes CRISPR-Cas9 entran en los embriones. Por lo general, se utilizan pulsos eléctricos de "poro" de nivel medio para crear las aberturas temporales seguidas de "pulsos de transferencia" eléctricos de nivel inferior que facilitan el movimiento de los componentes de edición del genoma cargados negativamente. La electroporación embrionaria es eficiente, tiene un alto rendimiento y es fácil de realizar. Sin embargo, mientras que la electroporación embrionaria ha demostrado ser muy exitosa para la introducción de plantillas de reparación de ADNs pequeñas (<200 pb), hay pocos informes de electroporación exitosa de plantillas de reparación más grandes (>1,0 kb)13,19. Esta restricción de tamaño representa una limitación importante de la electroporación embrionaria para generar modelos animales knock-in que requieren grandes inserciones.
En el contexto de la terapia génica, los virus adenoasociados (AAV) se han utilizado durante mucho tiempo como vehículos para entregar material genético debido a su eficiente infectividad in vivo de células en división y no división, falta de patogenicidad y rara integración genómica20,21. Recientemente, más estudios han combinado los AAV con la tecnología CRISPR-Cas9 para introducir plantillas de reparación de ADN y reactivos CRISPR 22,23,24. Este enfoque permite la entrega de plantillas de reparación de ADN más grandes sin necesidad de técnicas de microinyección.
La vía HDR es más activa en las fases tardías S y G2 del ciclo celular25,26. En estudios realizados in vitro, se lograron aumentos significativos en la eficiencia de knock-in mediante la administración de RNP CRISPR-Cas9 y plantillas de reparación de ADN en células sincronizadas con G2 o mediante la restricción de la presencia de la proteína Cas9 a las fases S y G2 tardías utilizando una proteína de fusión Cas9-Geminina2. Además, hay un evento importante de activación del genoma cigótico (ZGA) que ocurre durante la fase G2 extendida del embrión en etapa de 2 células, y esto se asocia con un estado de cromatina abierta. Se especula que esto proporciona a los RNPs CRISPR-Cas9 y a las plantillas de reparación una mayor accesibilidad al ADN genómico.
Nuestro objetivo era basarnos en todas estas observaciones, combinando el enfoque AAV con la electroporación embrionaria para introducir RNPs CRISPR-Cas9 en la etapa de 2 células del desarrollo embrionario. Esta estrategia aprovecha la mayor capacidad de entrega de plantillas de reparación de ADN de AAV, la facilidad técnica de la electroporación y el punto de tiempo más óptimo de 2 células para la accesibilidad genómica durante el desarrollo embrionario para crear un método eficiente para la ingeniería genética dirigida de las inserciones de ADN. Como se destaca en este protocolo, nuestro método optimizado permite la producción de modelos de ratas knock-in dirigidas que llevan inserciones de secuencias de ADN de 1,2 a 3,0 kb de tamaño sin necesidad de técnicas de microinyección.

<table><tbody><tr><td>Cables con pinzas de cocodrilo para electrodos</td><td>NepaGene</td><td>C117</td><td></td></tr><tr><td>Aceite mineral</td><td>MilliporeSigma</td><td>M5310</td><td></td></tr><tr><td>NepaGene21 Super Electroporator&nbsp;</td><td>NepaGene</td><td>NEPA21</td><td></td></tr><tr><td>Electrodos de placa de platino en portaobjetos de vidrio</td><td>NepaGene</td><td>CUY501P1-1.5</td><td></td></tr><tr><td>PURedit Cas9 Protein</td><td>MilliporeSigma</td><td>PECAS9</td><td></td></tr><tr><td>sgRNA (modificado químicamente)</td><td>Synthego</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ssAAV1 o ssAAV6 plantilla de reparación de ADN empaquetada</td><td>Vectorbuilder</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

edición del genoma crispr-cas9 de embriones de rata mediante virus adenoasociados (aav) y electroporación de embriones de 2 células

CRISPR-Cas9 Genome Editing of Rat Embryos using Adeno-Associated Virus (AAV) and 2-Cell Embryo Electroporation

La tecnología de edición genómica se utiliza ampliamente para producir animales modificados genéticamente, incluidas las ratas. La inyección citoplasmática o pronuclear de plantillas de reparación de ADN y reactivos CRISPR-Cas es el método de administración más común en embriones. Sin embargo, este tipo de micromanipulación requiere el acceso a equipos especializados, es laboriosa y requiere un cierto nivel de habilidad técnica. Además, las técnicas de microinyección a menudo dan como resultado una menor supervivencia embrionaria debido al estrés mecánico en el embrión. En este protocolo, desarrollamos un método optimizado para entregar grandes plantillas de reparación de ADN para que funcionen junto con la edición del genoma CRISPR-Cas9 sin necesidad de microinyección. Este protocolo combina la entrega de ADN mediada por AAV de plantillas de donantes de ADN monocatenario junto con la administración de ribonucleoproteína CRISPR-Cas9 (RNP) por electroporación para modificar embriones de 2 células. Utilizando esta novedosa estrategia, hemos producido con éxito modelos de ratas knock-in dirigidas que llevan la inserción de secuencias de ADN de 1,2 a 3,0 kb de tamaño con eficiencias entre el 42% y el 90%.

Siguiendo el protocolo, existe una administración efectiva mediada por AAV de la plantilla de reparación del ADN que permite un HDR altamente eficiente después de que los embriones de 2 células se electroporan con CRISPR-Cas9 RNP. Como se muestra en el video, un proceso de electroporación exitoso da como resultado la formación de burbujas en cada electrodo (Figura 2C) y la impedancia permanece dentro del rango de 0.100 y 0.300 kΩ. Después de la electroporació...

Este protocolo presenta un enfoque optimizado para la producción de modelos de ratas modificadas genéticamente. El virus adenoasociado (AAV) se utiliza para administrar una plantilla de reparación de ADN, y la electroporación se utiliza para administrar reactivos CRISPR-Cas9 para completar el proceso de edición del genoma en un embrión de 2 células.

Edición del genoma CRISPR-Cas9 de embriones de rata mediante virus adenoasociados (AAV) y electroporación de embriones de 2 células

Genome editing technology is widely used to produce genetically modified animals, including rats. Cytoplasmic or pronuclear injection of DNA repair ...

Las herramientas de edición genómica basadas en CRISPR han facilitado enormemente la producción de modelos de representación modificados genéticamente. El sistema CRISPR está compuesto por un único complejo de ARN guía a una nucleasa Cas9 y puede programarse para dirigirse a una secuencia de interés dentro del genoma para crear una ruptura de ADN de doble cadena. A través de la entrega conjunta de una plantilla de reparación de ADN, esta rotura de ADN se puede restaurar con precisión junto con la adición de cualquier secuencia de ADN diseñada deseada a través de un proceso llamado reparación dirigida por homología.Es mediante este proceso que podemos generar modelos de ratas knock-in con inserciones o sustituciones de ADN específicas. Utilizando este protocolo, presentamos un enfoque modificado que utiliza virus adenoasociados para administrar una plantilla de reparación de ADN a embriones de rata, junto con una posterior administración de complejos CRISPR Cas9 a través de la electroporación de dos embriones celulares. Los serotipos 1 o 6 de AAV están empaquetados con una plantilla de reparación de ADN diseñada para integrarse en el genoma de la rata a través del proceso de reparac

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

En la inyección intraventricular Utero y electroporación de embriones de rata E16

Fuente: Koza, P., et al. Generación de Ratones Transgénicos utilizando un Enfoque con Vector Lentiviral. J. Vis. Exp. (2020)Este video demuestra la administración asistida por microinyección de vectores lentivirales en embriones de rata fertilizados para lograr la integración estable de transgenes en la generación de ratas transgénicas.

Transducción de embriones fertilizados de rata mediante vectores lentivirales

Heterotopia nodular periventricular (PNH) es la forma más común de malformación del desarrollo cortical (MCD) en la edad adulta, pero su base genética sigue siendo desconocido en los casos más esporádicos. Recientemente hemos desarrollado una estrategia para identificar genes candidatos novela de MCDs y confirmar directamente su papel causativo en vivo.

Una nueva estrategia Array-CGH, secuenciación del exoma todo y electroporación en el útero en roedores para identificar los Genes causales de las malformaciones del cerebro

Se presenta un protocolo de microinyección simple y eficiente para la edición de genes en embriones de bagre de canal usando el sistema CRISPR/Cas9. En este protocolo, guía RNAs y proteínas Cas9 fueron microinyectados en la yema de una célula de embriones. Este protocolo ha sido validada por la anulación de dos genes relacionados con la inmune de bagre de canal.

Microinyección de la proteína CRISPR/Cas9 en bagre de canal, Ictalurus punctatus, embriones de Gene Editing

Utilizando un Cas9 Confecciones complejo de ribonucleoproteína (RNP) es un método eficaz para la edición del genoma exacto, eficiente. Aquí, podemos destacar su utilidad en una amplia gama de células y organismos, incluyendo las células humanas primarias y ambos clásicos y emergentes en organismos modelo.

Mayor genoma edición con Cas9 ribonucleoproteína en diversas células y organismos

Aquí proporcionamos un protocolo detallado para llevar a cabo en vivo gene cardiaco edición en ratones usando Virus de Adeno-Associated recombinante (rAAV)-mediado entrega de CRISPR. Este protocolo ofrece una estrategia terapéutica prometedora para tratar cardiomiopatía distrófica en distrofia muscular de Duchenne y puede utilizarse para generar nocaut cardiaco específico en los ratones postnatales.

Entrega de mediada por Virus adeno-asociado de CRISPR para Gene cardiaco en ratones

Aquí se presenta un protocolo para la edición eficiente de genes mediados por ribonucleoproteína CRISPR/Cas9 en células de mamíferos mediante electroporación de tubos.

CRISPR/Cas9 Edición génica precisa mediada por Ribonucleoproteína por electroporación de tubo

El desarrollo de modelos murinos con genes específicos mutados en pacientes con cáncer de cabeza y cuello es necesario para comprender la neoplasia. Aquí, presentamos un protocolo para la transformación in vitro de células de la lengua murina primaria utilizando un sistema adeno-asociado virus-Cas9 para generar líneas celulares HNC murinas con alteraciones genómicas específicas.

In Vitro Establecimiento de una línea celular de cáncer de cabeza y cuello de murine genéticamente diseñada utilizando un sistema de virus Cas9 asociado con Adeno

Aquí, presentamos un método modificado para la criopreservación de embriones unicelulares, así como un protocolo que combina el uso de embriones de congelación descongelado y electroporación para la generación eficiente de ratones modificados genéticamente.

Uso de embriones congelados descongelados para la producción de alta eficiencia de ratones modificados genéticamente

Aquí proporcionamos un protocolo detallado paso a paso para la ingeniería genómica basada en CRISPR/Cas9 de células B humanas primarias para el knockout genético (KO) y el knock-in (KI) para estudiar las funciones biológicas de los genes en las células B y el desarrollo de la terapia de células B.

Ingeniería genómica de células B humanas primarias usando CRISPR/Cas9

Aquí, describimos una técnica simple destinada a la generación eficiente de ratones genéticamente modificados llamada CRISPR RNP Electroporación de Cigotos (CRISPR-EZ). Este método proporciona reactivos de edición por electroporación en embriones con una eficiencia cercana al 100%. Este protocolo es efectivo para mutaciones puntuales, pequeñas inserciones genómicas y deleciones en embriones de mamíferos.

Edición eficiente del genoma de ratones mediante electroporación CRISPR de cigotos

Aprende a editar el genoma de embriones de rata mediante CRISPR-Cas9 utilizando virus adenoasociados y electroporación en embriones de dos células. Este método optimizado facilita la generación de modelos knock-in con alta eficiencia.

Edición del genoma CRISPR-Cas9 de embriones de rata mediante virus adenoasociados (AAV) y electroporación de embriones de 2 células (Video) | JoVE Journal

Edición del genoma CRISPR-Cas9 de embriones de rata mediante virus adenoasociados (AAV) y electroporación de embriones de 2 células

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