Name: Reutilización de tubos ultracentrífugos de policarbonato en análisis proteómicos de vesículas extracelulares (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-08T13:40:00.000+00:00
Duration: 2 min 36 s
Description: Aprenda a reutilizar tubos de ultracentrifugación de policarbonato para el aislamiento de vesículas extracelulares en análisis proteómicos de baja entrada. Este protocolo validado reduce costos y residuos sin comprometer la integridad de las muestras cardiovasculares.

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Este estudio contó con el apoyo de una beca de investigación de los Institutos Nacionales de Salud (NIH, por sus siglas en inglés) R01HL147095, R01HL141917 y R01HL136431, Kowa Company, Ltd., y el Programa de Investigación e Innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea en el marco del Acuerdo de Subvención Marie Skłodowska-Curie n.º 101023041 (R. Cahalane). La Figura 1 se creó con Biorender.com. El protocolo de limpieza actual se desarrolló modificando un protocolo de limpieza de tubos recomendado presentado en el Día de la Educación (https://www.youtube.com/watch?v=DOebcOes6iI) de la Sociedad Internacional de Vesículas Extracelulares 2023. Muchas gracias a la Dra. Kathryn Howe y a la Dra. Sneha Raju de la Red de Salud Universitaria (Universidad de Toronto, Canadá) por las muestras originales de EV de tejido carotídeo.

1. Limpieza de tubos
NOTA: El procedimiento de aislamiento de EV utiliza tubos UC de policarbonato con tapa y sin tapa (detallados a continuación). Se siguió el mismo procedimiento para los tubos tapados y sin tapa. En el caso de los tubos tapados, las piezas de la tapa se limpiaron individualmente y se volvieron a montar después del secado y el almacenamiento previo.
<ol><li>Después del uso inicial de los tubos de policarbonato y la extracción de la muestra, sumerja inmediatamente los tubos de UC en agua del grifo para evitar que la muestra se seque hacia el costado del tubo.</li>
	<li>Transfiera y sumerja los tubos en dodecil sulfato de sodio (SDS) al 0,1% en agua del grifo durante 10 minutos.</li>
	<li>Un tubo a la vez, decanta la mayor parte, pero no toda, la solución SDS del tubo y usa un hisopo de algodón para limpiar a fondo el área del tubo donde se encontraba el pellet EV. NOTA: No use nada con cerdas. Este protocolo utilizó bastoncillos de algodón normales; Sin embargo, se pueden usar hisopos de algodón especializados con poca pelusa para limpiar los tubos.</li>
	<li>Enjuague al menos 3 veces con agua caliente del grifo (~50 °C). Asegúrese de llenar y decantar el tubo por completo.</li>
	<li>Enjuague 1 vez con agua desmineralizada usando una botella rociadora o una botella de lavado de boca estrecha.</li>
	<li>Enjuague 1 vez con etanol al 70% usando una botella rociadora.</li>
	<li>Deje el tubo boca abajo para que se seque. NOTA: Las gradillas de tubos para la clasificación de células activadas por fluorescencia funcionan bien para secar los tubos UC.</li>
	<li>Coloque los tubos completamente secos en un frasco limpio; Están listos para su reutilización. NOTA: Actualmente, el protocolo está validado para su reutilización hasta 2 veces.</li>
</ol>2. Enriquecimiento de vehículos eléctricos
NOTA: Se utilizó el siguiente protocolo de aislamiento de EV y proteómica tanto para el aislamiento de EV de tejido original, como para las "muestras simuladas" utilizadas para obtener las muestras de tubo en blanco (nunca usadas) y limpias. Las muestras originales eran VE atrapadas en tejido resuspendido de placas carotídeas de pacientes que se sometieron a endartectomías carotídeas. Los especímenes quirúrgicos fueron recolectados de la Red Universitaria de Salud (Toronto, Canadá) y fueron aprobados por el comité de ética institucional. Todos los pacientes dieron su consentimiento informado para la toma de muestras y el análisis de los datos, de acuerdo con la Declaración de Helsinki. Las muestras simuladas eran pseudo-pellets obtenidos a partir del tratamiento de tubos en blanco y limpios con las mismas soluciones y pasos de procesamiento que las muestras de aislamiento EV.
<ol><li>Descongele muestras de EV o muestras simuladas en PBS con hielo.</li>
	<li>Hacer tampón NTE (10 mM de Tris-HCl, 1 mM de EDTA, 0,137 M de NaCl pH 7,4) y filtro estéril.</li>
	<li>Centrifugar las muestras a 10.000 × g durante 10 min a 4 °C.</li>
	<li>Mueva el sobrenadante a un tubo de policarbonato abierto de 1 mL.</li>
	<li>Centrifugar el sobrenadante a 100.000× g durante 1 h a 4 °C.</li>
	<li>Vuelva a suspender el pellet en 150 μL de tampón NTE filtrado estéril con inhibidor de la proteasa.</li>
	<li>Transfiera a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y agregue tampón NTE para alcanzar un volumen total de muestra de 1,5 mL.</li>
	<li>Mantenga las muestras en hielo.</li>
</ol>3. Preparación de gradientes de densidad y separación de gradientes de densidad
NOTA: Este protocolo de aislamiento de EV ha sido descrito previamente por Blaser et al.9 En resumen:
<ol><li>Prepare cinco soluciones de medio de gradiente de densidad de yodixanol (10%, 15%, 20%, 25% y 30%) con tampón NTE como diluyente.</li>
	<li>Coloque las soluciones de cinco densidades secuencialmente en tubos de ultracentrífuga tapados con un 30% en la parte inferior y un 10% en la parte superior.</li>
	<li>Asegure los tapones en los tubos y muévalos suavemente a una posición horizontal estable durante 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Después de 1 hora, mueva los tubos suavemente a una posición vertical sobre hielo durante 30 minutos para enfriar el gradiente.</li>
	<li>Añada 1,5 ml de la muestra o de la muestra simulada (tampón NTE) a la parte superior de los tubos de gradiente de densidad preparados.</li>
	<li>Tubo (s) de ultracentrífuga a 250.000 × g durante 40 min a 4 °C.</li>
	<li>Retire las fracciones superiores del gradiente de densidad (2,4 mL) y coloque los tubos de ultracentrífuga sin tapar. Llene hasta 9 ml con tampón NTE filtrado estéril.</li>
	<li>Granular los vehículos eléctricos por ultracentrifugación a 100.000 × g durante 1 h a 4 °C. NOTA: Encierre en un círculo la ubicación del perdigón EV visible o la ubicación esperada con un marcador. Esto le permitirá limpiar el área del pellet con el hisopo directamente.</li>
	<li>Aspire el sobrenadante mientras mueve el tubo a una posición invertida durante 3 min. Retire las gotas restantes con un hisopo de algodón antes de girar el tubo con el lado derecho hacia arriba.</li>
	<li>Vuelva a suspender el pellet EV en 12 μL de tampón de lisis en el kit de referencia.</li>
</ol>4. Preparación de péptidos para proteómica
NOTA: La preparación de la muestra proteómica se realizó de acuerdo con el protocolo del kit con modificaciones internas para muestras de proteínas de baja abundancia. El protocolo modificado es el siguiente:
<ol><li>Lisar, desnaturalizar, reducir y alquilar las muestras calentándolas en tampón de lisa a 95 °C durante 10 min.</li>
	<li>Digirir las muestras con la solución de digestión Lys-C/tripsina durante 2 h a 37 °C utilizando 10 μL de solución de lisa de la muestra y 10 μL de la solución de digestión.</li>
	<li>Purifique los péptidos a través de un cartucho lavando los contaminantes hidrófilos e hidrofóbicos y eluyendo los péptidos purificados utilizando soluciones de kit.</li>
	<li>Secar los péptidos purificados en vacío rápido a 45 °C durante 45 min o hasta que se sequen. NOTA: Evite el secado excesivo de los péptidos.</li>
	<li>Almacene las muestras a -80 °C hasta el momento de la secuenciación por espectrometría de masas.</li>
	<li>Añadir 17 μL de solución de carga LC a los péptidos secos.</li>
	<li>Deje las muestras en hielo durante 1 h.</li>
	<li>Agite las muestras brevemente y luego sonique en un baño de agua ultrasónico durante 5 minutos.</li>
	<li>Centrifugar las muestras de carga LC a 16.000 × g durante 1 min, aspirar 15 μL desde la parte superior y separarlas en un nuevo tubo.</li>
</ol>5. Cromatografía líquida y secuenciación por espectrometría de masas en tándem
<ol><li>Inyecte 2 μL de solución peptídica de carga LC en un espectrómetro de masas.</li>
	<li>Fraccione los péptidos utilizando una configuración de doble columna.</li>
	<li>Calentar la columna a una temperatura constante de 45 °C.</li>
	<li>Ejecute el gradiente analítico a 300 nL/min de 5% a 21% de solvente B (acetonitrilo/0,1% de ácido fórmico) durante 60 min, seguido de 10 min de 21% a 30% de solvente B y otros 10 min de un lavado de sierra de calar al 95%-5%.</li>
	<li>Ajuste el MS1 a una resolución de 120 K (tiempo máximo de inyección, 25 ms), someta los iones precursores superiores (dentro de un tiempo de ciclo de 3,0 s) a un ancho de aislamiento HCD de 1,2 m/z, exclusión dinámica habilitada (60 s), y ajuste la resolución del MS2 a 60 K (tiempo máximo de inyección, automático; energía de colisión normalizada, 24%, 26% y 28%).</li>
	<li>Establezca el rango de adquisición de MS1 y MS2 en 400 m/z-1.200 m/z y 120 m/z-1.200 m/z, respectivamente.</li>
</ol>6. Identificación de péptidos/proteínas
<ol><li>Busque los espectros de péptidos adquiridos con un software de búsqueda proteómica utilizando un algoritmo de búsqueda comercial contra una base de datos uniProt humana.</li>
	<li>Ajuste la enzima de digestión a tripsina y permita hasta dos escisiones perdidas.</li>
	<li>Establezca la tolerancia precursora en 10 ppm y la ventana de tolerancia de fragmentos en 0,02 Da.</li>
	<li>Establezca la oxidación de metionina y la acetilación N-terminal como modificaciones variables y la carbamidometilación de cisteína como modificación fija.</li>
	<li>Filtre los péptidos en función de un umbral de tasa de detección falsa (FDR) del 1,0 % calculado por el algoritmo Percolator.</li>
	<li>Considere únicamente los péptidos asignados a un grupo de proteínas determinado y no detectados en ningún otro grupo de proteínas como únicos y utilícelos para análisis posteriores.</li>
	<li>Incluya solo un mínimo de dos péptidos únicos para cada proteína en los análisis.</li>
	<li>Maximice las identificaciones con la detección de iones precursores.</li>
	<li>Realice la alineación cromatográfica con un cambio de tiempo de retención máximo de 10 min, una tolerancia de masa de 10 ppm y un mínimo de señal-ruido de 5.</li>
	<li>Normalizar la abundancia de péptidos por la cantidad total de péptidos.</li>
</ol>

Reciclaje eficiente de tubos de ultracentrífuga de policarbonato para proteómica

<ol><li>van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shedding+light+on+the+cell+biology+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).</li>
<li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+sample+collection%2C+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360(2013).</li>
<li>Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+extracellular+vesicles%3A+general+methodologies+and+latest+trends%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends.</a> BioMed Research International. 2018, e854347(2018).</li>
<li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), E968-E977 (2016).</li>
<li>Karimi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+analysis+of+the+plasma+extracellular+vesicle+proteome+after+separation+from+lipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Detailed analysis of the plasma extracellular vesicle proteome after separation from lipoproteins.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (15), 2873-2886 (2018).</li>
<li>Lischnig, A., Bergqvist, M., Ochiya, T., Lässer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomics+identifies+proteins+enriched+in+large+and+small+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomics identifies proteins enriched in large and small extracellular vesicles.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 21 (9), 100273(2022).</li>
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<li>Blaser, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiomics+of+tissue+extracellular+vesicles+identifies+unique+modulators+of+atherosclerosis+and+calcific+aortic+valve+stenosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Multiomics of tissue extracellular vesicles identifies unique modulators of atherosclerosis and calcific aortic valve stenosis.</a> Circulation. 148 (8), 661-678 (2023).</li>
<li>Kristensen, K., Henriksen, J. R., Andresen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adsorption+of+cationic+peptides+to+solid+surfaces+of+glass+and+plastic%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Adsorption of cationic peptides to solid surfaces of glass and plastic.</a> PLOS ONE. 10 (5), e0122419(2015).</li>
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<li>Wang, L., Zhang, J., Hou, S., Sun, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+quantifying+polycarbonate+and+polyethylene+terephthalate+microplastics+in+environmental+samples+by+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology+Letters%22%5BJournal%5D)">A simple method for quantifying polycarbonate and polyethylene terephthalate microplastics in environmental samples by liquid chromatography-tandem mass spectrometry.</a> Environmental Science & Technology Letters. 4 (12), 530-534 (2017).</li>
<li>Schittek, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dermcidin%3A+a+novel+human+antibiotic+peptide+secreted+by+sweat+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dermcidin: a novel human antibiotic peptide secreted by sweat glands.</a> Nature Immunology. 2 (12), 1133-1137 (2001).</li>
<li>Blaydon, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+CSTA%2C+encoding+Cystatin+A%2C+underlie+exfoliative+ichthyosis+and+reveal+a+role+for+this+protease+inhibitor+in+cell-cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mutations in CSTA, encoding Cystatin A, underlie exfoliative ichthyosis and reveal a role for this protease inhibitor in cell-cell adhesion.</a> American Journal of Human Genetics. 89 (4), 564-571 (2011).</li>
<li>Henry, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hornerin+is+a+component+of+the+epidermal+cornified+cell+envelopes%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Hornerin is a component of the epidermal cornified cell envelopes.</a> FASEB Journal. 25 (5), 1567-1576 (2011).</li>
<li>Bolling, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generalized+ichthyotic+peeling+skin+syndrome+due+to+FLG2+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Generalized ichthyotic peeling skin syndrome due to FLG2 mutations.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 138 (8), 1881-1884 (2018).</li>
<li>Jin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DAMP+molecules+S100A9+and+S100A8+activated+by+IL-17A+and+house-dust+mites+are+increased+in+atopic+dermatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Dermatology%22%5BJournal%5D)">DAMP molecules S100A9 and S100A8 activated by IL-17A and house-dust mites are increased in atopic dermatitis.</a> Experimental Dermatology. 23 (12), 938-941 (2014).</li>
<li>Gläser, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antimicrobial+protein+psoriasin+%28S100A7%29+is+upregulated+in+atopic+dermatitis+and+after+experimental+skin+barrier+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">The antimicrobial protein psoriasin (S100A7) is upregulated in atopic dermatitis and after experimental skin barrier disruption.</a> Journal of Investigative Dermatology. 129 (3), 641-649 (2009).</li>
<li>Molhave, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((House+dust+in+seven+Danish+offices%5BTitle%5D)+AND+%22Atmospheric+Environment%22%5BJournal%5D)">House dust in seven Danish offices.</a> Atmospheric Environment. 34, 4767-4779 (1999).</li>
<li>Buschow, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+class+II-associated+proteins+in+B-cell+exosomes+and+potential+functional+implications+for+exosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">MHC class II-associated proteins in B-cell exosomes and potential functional implications for exosome biogenesis.</a> Immunology and Cell Biology. 88 (8), 851-856 (2010).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Aquí describimos y validamos un protocolo para la limpieza de tubos UC de policarbonato para aplicaciones proteómicas y de enriquecimiento de EV. Demostramos la eliminación exitosa de la proteína residual de la muestra de tubo UC anterior en comparación con un análisis de pseudo-gránulos limpios por debajo del límite de detección de este protocolo de adquisición de espectrometría de masas y mostramos la similitud proteómica del tubo de UC en blanco nunca utilizado en comparación con los pseudo gránulos de tubo de UC limpios.
En primer lugar, para evitar la adsorción inadvertida de proteínas a la pared interna de policarbonato, los tubos de UC se sumergieron inmediatamente enH2O10. Los fabricantes recomiendan lavar a mano los tubos de policarbonato UC11. Otros detergentes, como Lipsol, deben usarse con precaución. Es un detergente de laboratorio patentado compuesto por una mezcla de detergente, tensioactivo y agentes quelantes con un pH no neutro. Por lo tanto, para este paso, se utilizó un detergente compatible con espectrometría de masas, SDS al 0,1%, y no se realizó el lavado durante más de 10 min11. En nuestra experiencia, el uso de herramientas de limpieza de cerdas puede provocar arañazos en los tubos si no se tiene precaución. Para mitigar los posibles arañazos, que podrían proporcionar un depósito para la proteína residual, se utilizó un bastoncillo de algodón para limpiar el interior del tubo de policarbonato, centrándose en el área de formación de gránulos de EV. El autoclave repetido puede reducir la vida útil del tubo de policarbonato11; En su lugar, se realizaron tres breves enjuagues con agua caliente. También debe tenerse en cuenta que, aunque los fabricantes sugieren métodos de esterilización no térmicos, no se describe una temperatura específica que deba evitarse. Los tubos siempre deben inspeccionarse en busca de signos de deformación o agrietamiento antes de volver a utilizarlos, según las recomendaciones de los fabricantes. No se recomienda el uso de sustancias inflamables cerca de centrífugas en funcionamiento; Por lo tanto, secamos los tubos durante la noche después del paso final de enjuague con etanol al 70%.
No se observó contaminación significativa del polímero mediante la evaluación manual de los cromatogramas. No se espera que el SDS degrade el policarbonato, y las exposiciones breves al agua caliente (<60 °C) no tienen ningún efecto, mientras que las exposiciones más prolongadas sílo hacen 12. Además, estudios previos han indicado que las especies de policarbonato eluyen en un tiempo de retención antes de la recolección basado en nuestro gradiente de acetonitrilo13. Si bien no podemos estar seguros de que los polímeros no estén presentes, con nuestros métodos de adquisición, estamos seguros de que el proteoma no se verá afectado sustancialmente.
Al reutilizar material de laboratorio para experimentos de proteómica sin etiquetas, se deben considerar específicamente los contaminantes proteicos residuales del uso anterior. Además, la proteómica EV a menudo se lleva a cabo con muestras de muy bajo rendimiento, a veces produciendo cantidades de proteínas en el rango de <100 ng. Estas cantidades de proteína de partida son adecuadas para la espectrometría de masas, pero aumentan sustancialmente el impacto, incluso pequeñas cantidades de proteína residual, en el proteoma general. Dada la sensibilidad del avance de la secuenciación por espectrometría de masas, se identificarán los contaminantes procedentes de la manipulación y fabricación humana. En este protocolo, mostramos una reducción sustancial en el número de proteínas identificadas en un 98% después de la limpieza. Las proteínas restantes se compartieron casi exclusivamente entre los tubos en blanco nunca utilizados y los tubos limpios. Estos resultados sugieren que las proteínas identificadas eran contaminantes de la propia preparación proteómica o elementos residuales de la fabricación de tubos, no remanentes del uso anterior. Con diferencia, las tres proteínas identificadas más abundantes por órdenes de magnitud en los tubos en blanco y limpios fueron la queratina humana tipo I (KRT1, KRT10, KRT9), que se encuentra en el cabello y la piel, generalmente reconocida en este tipo de preparaciones como contaminantes de la manipulación humana (https://www.thegpm.org/crap/). Nueve de las 18 proteínas compartidas eran otras queratinas. También se incluye como contaminante humano reconocido la dermcidina (DCD), una proteína que se encuentra en el sudor humano14. Otras proteínas identificadas también se encuentran en la epidermis (CSTA15, HRNR16, FLG217) o previamente identificadas en ácaros del polvo (S100A7, S100A8, S100A9)18,19. Cabe señalar que un componente sustancial del "polvo" es la piel humana20. Las dos proteínas únicas identificadas en los tubos limpios han sido implicadas en las VE, sin embargo, son muy menores en comparación con otras proteínas EV identificadas 1,21. Las proteínas identificadas en las muestras son consistentes con la preparación e indican una superposición muy clara entre los tubos en blanco y los limpios, lo que favorece la reutilización.
Los VE tienen un papel importante en los procesos biológicos, que incluyen, entre otros, la comunicación célula-célula y la formación de mineralización biológica. Los VE son omnipresentes en el cuerpo humano y son un área de rápido crecimiento de la ciencia básica debido a su potencial como biomarcadores, terapéuticos y fuentes de información sobre la fisiología (patológica). El enriquecimiento de estas partículas para la experimentación mediante UC diferencial involucra tubos de policarbonato especializados. El uso único y la eliminación de estos termoplásticos contribuyen a aumentar los costos de los consumibles experimentales y la carga mundial de contaminación plástica. En este trabajo, presentamos y validamos un protocolo para la limpieza y reutilización de tubos UC de policarbonato para realizar el aislamiento de EV adecuado para experimentos de proteómica. En última instancia, esto reducirá los residuos producidos por los laboratorios de vehículos eléctricos y disminuirá el coste asociado a dichos experimentos.

Las vesículas extracelulares (VE) son partículas delimitadas por bicapas lipídicas liberadas por las células que transportan carga biológicamente activa, como proteínas, y participan en diversos procesos biológicos, incluida la comunicación célula-célula y la formación demineralización biológica. Estas partículas se encuentran en todos los fluidos y tejidos corporales, y sus actividades y usos biológicos son un campo de investigación científica en rápida evolución. El aislamiento y la validación de estas nanopartículas presentan varios desafíos debido a su pequeño tamaño y biosimilitud con otras partículas, como liposomas y agregados de proteínas. Las directrices más recientes de la Sociedad Internacional de Vesículas Extracelulares, Información mínima para estudios de vesículas extracelulares 2018 (MISEV2018), son el estándar reconocido para la investigación científica de VE2.
Se deben utilizar varios métodos, a menudo en tándem, para el aislamiento de vehículos eléctricos en función de la fuente ascendente y las aplicaciones posteriores. A partir de 2015, el método de aislamiento primario más común para los VE fue la ultracentrifugación diferencial (UC)2. En principio, la centrifugación inicial a baja velocidad separa los componentes no deseados más grandes o más densos, como las células y los restos de células, dejando los EV en el sobrenadante. Posteriormente, la UC utiliza una fuerza centrífuga muy alta para granular y, por lo tanto, separar y purificar los EV de otras partículas que son más pequeñas o menos densas, pero que también pueden contener partículas densas no EV. La mayoría de los protocolos suelen utilizar, en un paso u otro, la UC para aislar los VE de un fluido3. Además, la UC se utiliza en otros métodos de aislamiento de VE, como la ultracentrifugación en gradiente de densidad (DGUC), que utiliza medios como el yodixanol OptiprepTM y la fuerza centrífuga para separar los VE de acuerdo con su densidad de flotación4. Existen otros métodos de aislamiento de EV3.
Teniendo en cuenta la rápida evolución de la comprensión de los procesos biológicos dictados por los VE y su potencial como biomarcadores e información sobre la fisiopatología, los análisis basados en descubrimientos, como la proteómica, han ganado terreno 5,6,7,8. Los VE son pequeños y, dependiendo de la fuente, tienen un bajo rendimiento de proteína (<1 μg) en comparación con el tejido entero o el lisado celular. El aislamiento de EV para el análisis proteómico requiere consideraciones especiales, como la eliminación de contaminantes de proteínas no EV del líquido o tejido aguas arriba, la consideración de la degradación de la proteína EV durante el proceso de aislamiento y la utilización de métodos que creen soluciones proteicas que sean químicamente compatibles con la preparación de péptidos y los análisis de espectrometría de masas.
Los consumibles de los laboratorios de investigación suelen ser de plástico y desechables por naturaleza. Estos materiales de un solo uso contribuyen a la crisis mundial de contaminación plástica y a los costes de los consumibles. Los tubos UC especializados de policarbonato y poliestireno están diseñados para soportar las altas fuerzas centrífugas necesarias para granular los EV en aplicaciones de laboratorio. Si bien es posible esterilizar y desinfectar los tubos de UC para su reutilización, el análisis proteómico, especialmente aquellos de bajo rendimiento proteico, como los EV, requiere una atención especial. No solo es primordial la eliminación suficiente de proteínas residuales del uso anterior, sino que también se debe considerar la compatibilidad química con la espectroscopia de masas y la contaminación por polímeros derivados del plástico.
Aquí presentamos un protocolo de limpieza de tubos de policarbonato utilizando detergentes adecuados para espectrometría de masas y realizamos experimentos para validar su eliminación exitosa de proteínas residuales por debajo de los límites de detección y la ausencia de contaminantes poliméricos detectables. Con el fin de validar el protocolo de limpieza para aplicaciones proteómicas de VE utilizando fines UC y DGUC, obtuvimos tubos a partir de aislamientos de EV de tejido de vasculatura humana con un protocolo combinado de UC y DGUC. Los tubos se limpiaron utilizando el protocolo descrito, y el proceso experimental se repitió sin muestras comparando un tubo de UC en blanco nunca utilizado y un tubo de UC limpio. En última instancia, la validación de un protocolo de limpieza de tubos UC adecuado para el enriquecimiento de vehículos eléctricos reducirá los residuos producidos por los laboratorios de vehículos eléctricos y disminuirá el costo asociado con dichos experimentos.

<table><tbody><tr><td>Tubo de policarbonato de pared gruesa abierto de 10 mL</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>355630</td><td>tubo(s) de ultracentrífuga sin tapa;</td></tr><tr><td>Botella de policarbonato de 10,4 ml con conjunto de tapa</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>355603</td><td>tubo(s) de ultracentrífuga con tapa;</td></tr><tr><td>una Acclaim PepMap 100 C18 Columnas de HPLC, 75 y micro; m x 70 mm; y una columna de HPLC EASY-Spray, 75 &micro; m x 250 mm</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>164946 y ES902</td><td>Configuración de doble columna</td></tr><tr><td>Hisopo crítico, cabeza de algodón</td><td>VWR</td><td>89031-270</td><td>hisopo de algodón</td></tr><tr><td>Exploris 480 con frente con fuente EASY-Spray, acoplado a una bomba de HPLC Easy-nLC1200.</td><td>Espectrómetro de masas</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>BRE725533</td></tr><tr><td>Base de datos Human UniProt (101043 entradas, actualizada en enero de 2022)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Base de datos humana</td></tr><tr><td>MilliQ agua</td><td></td><td></td><td>agua</td></tr><tr><td>PreOmics iST kit &nbsp;</td><td>PreOmics</td><td>P.O.00027</td><td>kit de preparación de muestras de proteínas comerciales&nbsp;</td></tr><tr><td>Descubridor del proteoma &nbsp; paquete (PD, versión 2.5)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NA</td><td>Software de búsqueda proteómica</td></tr><tr><td>Algoritmo de búsqueda SEQUEST-HT&nbsp;</td><td>NA</td><td>NA Algoritmo</td> de <td>búsqueda</td></tr><tr><td>Dodecil Sulfato de sodio (20%)</td><td>Boston BioProducts</td><td>BM-230</td><td>detergente</td></tr></tbody></table>

reutilización de tubos ultracentrífugos de policarbonato en análisis proteómicos de vesículas extracelulares

Polycarbonate Ultracentrifuge Tube Re-Use in Proteomic Analyses of Extracellular Vesicles

Los plásticos de laboratorio de un solo uso agravan la crisis de contaminación y contribuyen a los costes de los consumibles. En el aislamiento de vesículas extracelulares (EV), se utilizan tubos de ultracentrífuga (UC) de policarbonato para soportar las altas fuerzas centrífugas asociadas. La proteómica de los vehículos eléctricos es un campo en avance y faltan protocolos de reutilización validados para estos tubos. La reutilización de consumibles para protocolos de aislamiento de proteínas de bajo rendimiento y proteómica posterior requiere compatibilidad de reactivos con las adquisiciones de espectroscopia de masas, como la ausencia de contaminación por polímeros sintéticos derivados del tubo de centrífuga y la eliminación suficiente de proteínas residuales.
Este protocolo describe y valida un método para limpiar tubos de UC de policarbonato para su reutilización en experimentos de proteómica de vehículos eléctricos. El proceso de limpieza implica la inmersión inmediata de los tubos de UC enH2Opara evitar el secado de las proteínas, el lavado con detergente dodecil sulfato de sodio (SDS) al 0,1%, el enjuague con agua caliente del grifo, agua desmineralizada y etanol al 70%. Para validar el protocolo de reutilización de tubos de UC para la proteómica de EV aguas abajo, se obtuvieron tubos usados después de un experimento en el que se aislaron VE del tejido cardiovascular utilizando CU diferencial y separación por gradiente de densidad. Los tubos se limpiaron y el proceso experimental se repitió sin muestras de EV, comparando tubos de UC en blanco nunca utilizados con tubos de UC limpios. Los gránulos de pseudo-EV obtenidos de los procedimientos de aislamiento se lisaron y se prepararon para cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem utilizando un kit comercial de preparación de muestras de proteínas con modificaciones para muestras de proteínas de baja abundancia.
Después de la limpieza, el número de proteínas identificadas se redujo en un 98% en el pseudo-pellet en comparación con la muestra de aislamiento EV anterior del mismo tubo. Al comparar un tubo limpio con un tubo en blanco, ambas muestras contenían un número muy pequeño de proteínas (≤20) con un 86% de similitud. Se confirmó la ausencia de picos poliméricos en los cromatogramas de los tubos limpios. En última instancia, la validación de un protocolo de limpieza de tubos UC adecuado para el enriquecimiento de los VE reducirá los residuos producidos por los laboratorios de VE y reducirá los costes experimentales.

Para validar el protocolo de limpieza (Figura 1), se realizaron dos experimentos. En primer lugar, se comparó el proteoma de la "muestra simulada" del tubo limpio con el proteoma de la muestra de tejido EV del uso inicial del tubo para determinar el arrastre de las proteínas identificadas. Los cromatogramas representativos muestran una reducción en la heterogeneidad de los picos después de la limpieza de los tubos (Figura 2). En el aislamiento original de EV, se identificaron 806 proteínas con dos o más péptidos únicos. Después de la limpieza, el número de proteínas identificadas se redujo en un 98% a 19 proteínas. Doce proteínas fueron compartidas en ambos, y siete proteínas eran únicas para el tubo limpio (Figura 3A). A partir de una revisión de la literatura, se elaboró una lista de proteínas EV características publicadas anteriormente9. De las 24 proteínas EV características identificadas en la muestra original, solo una se identificó después de la limpieza (Tabla 1). De las proteínas compartidas, MFGE8, una proteína EV característica, fue la proteína más enriquecida diferencialmente en la muestra de EV. En comparación, dos proteínas contaminantes, KRT14 y KRT5, fueron las más enriquecidas diferencialmente en la muestra poslimpiada (Figura 3B).
Para confirmar la eliminación de proteínas de los tubos después del lavado, se realizó un gel SDS-PAGE con una curva estándar BSA de 1 μg (límite inferior típico del rendimiento de aislamiento de EV) a 16,5 ng, y luego se utilizaron gránulos de EV "simulados" de tubo en blanco y limpios por triplicado. Todas las bandas de curva estándar eran visibles, sin embargo, las muestras no lo eran, lo que indica la eliminación de limpieza de al menos el 98% de la proteína y no hay diferencia observable entre el tubo en blanco y el limpio (Figura 4A). Para evaluar más a fondo las proteínas específicas identificadas en los tubos limpios en comparación con un tubo en blanco nunca utilizado, se realizó una comparación directa (N = 4, grupo). Los cromatogramas de los tubos en blanco y limpios fueron muy similares (Figura 4B). En los tubos en blanco, nunca utilizados, se identificaron 19 proteínas. Del mismo modo, en el tubo limpio se identificaron 20 proteínas, de las cuales 18 se compartían entre los dos grupos (Figura 4C). Al clasificar todas las proteínas por su abundancia, las proteínas de queratina contaminantes KRT1, KRT9 y KRT10 son las más abundantes en ambos grupos (Figura 4D). En el tubo limpio, se identificó una proteína EV característica: lactadherina (MFGE8). Hubo una gran similitud entre los tubos limpios frente a los tubos en blanco en el número de eventos de secuenciación de MS2 desencadenados en cada intervalo de tiempo de retención de 5 minutos (Figura 4E), el número de péptidos secuenciados y la confianza en la que se secuenciaron (Figura 4F), así como una gran superposición entre los péptidos (Figura 4G). Tomados en conjunto, estos resultados indican que no hay un impacto discernible de la reutilización del tubo con este protocolo de limpieza en el proteoma.
El monómero del policarbonato es 254,3 MH1+, que está por debajo del rango de adquisición MS1. Los cromatogramas se evaluaron para detectar la presencia de dímeros y trímeros cargados individualmente, que no se detectaron (datos no mostrados, N = 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66126/66126fig01.jpg"> Figura 1: Esquema del protocolo de limpieza de tubos de ultracentrífuga de policarbonato. Abreviaturas: UC = ultracentrífuga; SDS = dodecil sulfato de sodio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66126/66126fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66126/66126fig02.jpg"> Figura 2: Comparación representativa del proteoma de la muestra EV anterior con la "muestra simulada" del tubo limpio (N = 2). Abreviaturas: EV = vesícula extracelular; TIC-MS = cromatografía iónica total-espectrometría de masas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66126/66126fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66126/66126fig03v2.jpg"> Figura 3: Comparación de las proteínas identificadas en la muestra de EV con la muestra "simulada" obtenida de los tubos limpios. (A) Identificaciones de proteínas del diagrama de Venn en el proteoma de la muestra EV anterior con la "muestra simulada" del tubo limpio (N = 2). (B) Enriquecimiento diferencial de proteínas compartidas clasificadas por un cambio logarítmico de 2 veces. Abreviatura: EV = vesícula extracelular, FC = cambio <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66126/66126fig03largev2.jpg" target="_blank">de pliegue Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66126/66126fig04.jpg"> Figura 4: Comparación de tubos en blanco nunca usados con tubos limpios. (A) Se realizó un gel SDS-PAGE con una curva estándar BSA de 1 μg a 16,5 ng, y luego se utilizaron gránulos EV "simulados" de tubo en blanco y limpios por triplicado. (B) Cromatogramas representativos para tubos en blanco y limpios. (C) Diagrama de Venn de las proteínas compartidas o únicas de tubos en blanco y limpios (N = 4). (D) Todas las proteínas identificadas en cada grupo se clasificaron de acuerdo con la abundancia para (i) tubos en blanco y (ii) tubos limpios. Se trazan los valores medianos. (E) Histograma de todos los eventos MS2 desencadenados por tiempo de retención sumado por grupo (N = 4). (F) Número de identificaciones de péptidos en cada grupo por confianza, donde los péptidos de alta confianza son distintos de los péptidos emparejados intragrupo, donde la confianza en la identificación es menor pero reforzada por la coincidencia con otros espectros, media/DE. (G) Número de péptidos únicos y compartidos entre grupos. Abreviaturas: EV = vesícula extracelular; TIC-MS = cromatografía iónica total-espectrometría de masas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66126/66126fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tabla 1: Proteínas EV características encontradas en el análisis de limpieza de tubos pre versus post UC. Abreviaturas: UC = ultracentrífuga; EV = vesícula extracelular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66126/Table%201.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>

Se proporciona un protocolo detallado para la limpieza y reutilización de los tubos de ultracentrífuga de policarbonato para realizar el aislamiento de vesículas extracelulares adecuado para experimentos de proteómica.

Reutilización de tubos ultracentrífugos de policarbonato en análisis proteómicos de vesículas extracelulares

Single-use laboratory plastics exacerbate the pollution crisis and contribute to consumable costs. In extracellular vesicle (EV) isolation, polycarbonate ...

Estudiamos las enfermedades cardiovasculares, concretamente el papel de las vesículas extracelulares en la calcificación patológica de los tejidos cardiovasculares, como válvulas y vasos sanguíneos. Los investigadores de nuestro grupo han definido recientemente métodos para extraer tejido y vesículas extracelulares atrapadas del tejido cardiovascular fibrocalcificado para determinar su perfil proteómico. Nuestro grupo ha demostrado que estas vesículas extracelulares contienen una importante carga proteica para iniciar la calcificación en los tejidos enfermos.Los tubos especializados utilizados en la etapa de ultracentrifugación del aislamiento de vesículas extracelulares se pueden limpiar y esterilizar para su reutilización. Sin embargo, el análisis proteómico requiere una consideración especial, ya que cualquier contaminación podría afectar en gran medida los resultados posteriores. Aquí validamos un protocolo para la reutilización de consumibles, específicamente tubos de ultracentrífuga de policarbonato para el aislamiento de vesículas extracelulares que es adecuado para aplicaciones de proteómica de baja entrada aguas abajo.Nuestro protocolo es sencillo y eficaz, y permitirá a los investigadores reducir tanto los costes de consumibles como los residuos típicamente asociados a estos protocolos de aislamiento.

polycarbonate-ultracentrifuge-tube-re-use-proteomic-analyses

Research

Investigación

JoVE Journal

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Biología

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Análisis eucariotas perfil Polyribosome

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Digestión de proteínas, ultrafiltración y cromatografía por exclusión de tamaño para optimizar el aislamiento de exosomas de suero y Plasma de sangre humana

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Análisis Cytometric del vesículas extracelulares de medios acondicionado de célula de flujo

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Evaluación de la estabilidad del almacenamiento de vesículas extracelulares

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Aislamiento y caracterización de vesículas extracelulares cianobacterianas

Aprenda a reutilizar tubos de ultracentrifugación de policarbonato para el aislamiento de vesículas extracelulares en análisis proteómicos de baja entrada. Este protocolo validado reduce costos y residuos sin comprometer la integridad de las muestras cardiovasculares.

Reutilización de tubos ultracentrífugos de policarbonato en análisis proteómicos de vesículas extracelulares

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