Análisis cuantitativo de la estabilización de la membrana del retículo endoplásmico (MAM) asociada a mitocondrias en un modelo neural de la enfermedad de Alzheimer (EA)

Estamos tratando de medir cuantitativamente la estabilidad de las membranas del RE asociadas a las mitocondrias de varios espesores o anchos de espacio, lo cual es importante para regular la fisiopatología de varias enfermedades neurodegenerativas, incluida la EA. Estudios recientes sobre las membranas del RE asociadas a las mitocondrias, a menudo llamadas MAM, las han descrito como uno de los factores clave en el inicio de la patología amiloide en la etapa temprana de la EA. Los hallazgos llevaron al desarrollo de una nueva hipótesis llamada hipótesis MAM, que sugiere que la EA es exclusivamente una enfermedad relacionada con MAM.

Nuestro protocolo es el primero en proporcionar una herramienta cuantitativa para medir la estabilización de MAM en células vivas, lo que ha seguido siendo un desafío hasta ahora. La mayor ventaja de nuestro protocolo es que utiliza la propiedad dinámica intrínseca de las mitocondrias para medir cuantitativamente los cambios en la estabilización de MAM al apretar o aflojar los anchos de espacio de MAM en células vivas.

Nuestro enfoque en el futuro inmediato es mejorar y emplear nuestra técnica kymográfica y de imágenes de células vivas de última generación para detectar una serie de moduladores de moléculas pequeñas sintéticos o naturales aprobados por la FDA de MAM o receptores sigma one unidos a MAM, utilizando una plataforma de detección de fármacos para la EA recientemente desarrollada y comprender su mecanismo de acción.

[Narrador] Para transfectar las células con estabilizadores MAM, reemplace la mezcla mononuclear de médula ósea con dos mililitros de medio DMEM-F12 a temperatura ambiente en cada pocillo. Combine el reactivo nucleofector con el suplemento uno en una proporción de 4,5 a uno. Agregue 100 microlitros del reactivo nucleofector a la mezcla. Luego agita la solución de ADN. Agregue de uno a cinco microgramos de ADN por tratamiento en tubos de microcentrífuga separados de un mililitro para cada transfección. Después de aspirar el medio existente de las células, lave las células una vez con 10 mililitros de PBS. Aspire el PBS y agregue un mililitro de accutasa directamente a las células. Incube las células durante cinco a 10 minutos a 37 grados centígrados. Luego, golpee suavemente el costado del plato para desalojar las células. Bajo un microscopio, verifique que las células estén sueltas y fluyan libremente. Neutralice los líquidos con 10 mililitros de medio DMEM-F12 y transfiera la suspensión celular a un tubo limpio de 15 mililitros. A continuación, tome 10 microlitros de las células suspendidas y agréguelas al lado A de una cámara de recuento de células. Luego inserte el lado A de la cámara llena en la ranura principal en la parte frontal del contador de celdas. Presione medir y registrar el número de celdas por mililitro. Centrifugar el número requerido de células a 300 G durante cinco minutos. Luego aspire el sobrenadante con cuidado y vuelva a suspender el sedimento en 100 microlitros de mezcla de nucleofectores para cada electroporación. A continuación, agregue 100 microlitros de la suspensión celular resuspendida a uno de los tubos que contienen ADN. Mezclar pipeteando la solución varias veces. Luego transfiera la mezcla de células de ADN a una cubeta de electroporación y séllela con la tapa provista. Seleccione el programa de nucleofector apropiado en el dispositivo. Agregue inmediatamente aproximadamente 500 microlitros de DMEM de una placa precargada de seis pocillos en la cubeta con pipetas estériles. Mezclar suavemente una vez y transferir las celdas electroporosas y el medio al pozo correspondiente. Para comenzar, coloque la placa de seis pocillos que contiene células en la cámara del microscopio y ajuste el enfoque del microscopio hasta que las células se vuelvan visibles. Para capturar la señal de la proteína fluorescente roja, excite el fluoróforo con un láser de 594 nanómetros y establezca la emisión en 570 a 640 nanómetros. Para proteínas fluorescentes verdes, use un láser de 488 nanómetros para excitación con emisión de 510 a 540 nanómetros. Recorte el área de escaneo para que quepa alrededor del axón. Un área de escaneo más pequeña reducirá el tiempo de procesamiento y simplificará la generación de quimografía. Establezca el intervalo en un fotograma por segundo y la duración total en 181 segundos. Haga clic en ejecutar para iniciar el proceso. La velocidad axonal de las mitocondrias unidas a ER marcadas con MAM 1X se redujo en un 50% en comparación con las mitocondrias libres y unidas a MAM 9X. El 26,6% de las mitocondrias MAM 1X eran móviles frente al 53,82% de las mitocondrias libres y el 44,79% de las mitocondrias MAM 9X. El movimiento retrógrado fue menor para las mitocondrias MAM 1X que para las mitocondrias Mito-RFP y las mitocondrias MAM 9X. El movimiento anterógrado de las mitocondrias MAM 1X también se redujo frente a Mito-RFP. El porcentaje estacionario de las mitocondrias MAM 1X fue significativamente mayor que el de las mitocondrias MAM 9X, lo que refleja una reducción de la motilidad, mientras que la velocidad general de las mitocondrias MAM 1X fue significativamente menor que la de las mitocondrias MAM 9X.