Name: Obtención de imágenes de calcio en vivo de monocapas de organoides intestinales humanos infectadas por virus utilizando indicadores de calcio codificados genéticamente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-19T14:05:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Aprende a realizar imágenes de calcio en vivo en organoides intestinales humanos infectados con virus utilizando indicadores codificados genéticamente. Este método permite estudiar la disrupción de la señalización en el epitelio intestinal.

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones R01DK115507 y R01AI158683 (PI: J. M. Hyser) de los Institutos Nacionales de Salud (NIH). El apoyo de los aprendices fue proporcionado por el F30DK131828 de subvenciones de los NIH (PI: J.T. Gebert), F31DK132942 (PI: F. J. Scribano) y F32DK130288 (PI: K.A. Engevik). Nos gustaría agradecer al Centro Enteroide de Enfermedades Digestivas del Centro Médico de Texas por proporcionar los medios de mantenimiento de organoides.

Imágenes de calcio de monocapas de organoides intestinales humanos infectados por virus

<ol><li>Bootman, M. D., Bultynck, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+of+cellular+calcium+signaling%3A+A+primer%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Fundamentals of cellular calcium signaling: A primer.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (1), a038802(2020).</li>
<li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling.</a> Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).</li>
<li>Danese, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+as+a+result+of+calcium+signaling+modulation%3A+A+cancer-centric+prospective%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Cell death as a result of calcium signaling modulation: A cancer-centric prospective.</a> Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1868 (8), 119061(2021).</li>
<li>Harr, M. W., Distelhorst, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+and+autophagy%3A+Decoding+calcium+signals+that+mediate+life+or+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Apoptosis and autophagy: Decoding calcium signals that mediate life or death.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (10), a005579(2010).</li>
<li>Barak, P., Parekh, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+through+Ca2%2B+microdomains+from+store-operated+CRAC+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Signaling through Ca2+ microdomains from store-operated CRAC channels.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (7), a035097(2020).</li>
<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca%282%2B%29+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).</li>
<li>Erofeev, A. I., Vinokurov, E. K., Vlasova, O. L., Bezprozvanny, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GCaMP%2C+a+family+of+single-fluorophore+genetically+encoded+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22J+Evol+Biochem+Phys%22%5BJournal%5D)">GCaMP, a family of single-fluorophore genetically encoded calcium indicators.</a> J Evol Biochem Phys. 59 (4), 1195-1214 (2023).</li>
<li>Suzuki, J., Kanemaru, K., Iino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+fluorescent+indicators+for+organellar+calcium+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded fluorescent indicators for organellar calcium imaging.</a> Biophys J. 111 (6), 1119-1131 (2016).</li>
<li>Nászai, M., Cordero, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+stem+cells%3A+Got+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Intestinal stem cells: Got calcium.</a> Curr Biol. 26 (3), R117-R119 (2016).</li>
<li>Barrett, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-mediated+chloride+secretion+in+the+intestinal+epithelium%3A+Significance+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Membr%22%5BJournal%5D)">Calcium-mediated chloride secretion in the intestinal epithelium: Significance and regulation.</a> Curr Top Membr. 53, 257-282 (2002).</li>
<li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-sensing+receptor+regulates+intestinal+dipeptide+absorption+via+Ca2%2B+signaling+and+IKCa+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rep%22%5BJournal%5D)">Calcium-sensing receptor regulates intestinal dipeptide absorption via Ca2+ signaling and IKCa activation.</a> Physiol Rep. 8 (1), e14337(2020).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+development+and+disease+with+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Lin, S. C., Haga, K., Zeng, X. L., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+CRISPR%E2%80%93Cas9-mediated+genetic+knockout+human+intestinal+tissue%E2%80%93derived+enteroid+lines+by+lentivirus+transduction+and+single-cell+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of CRISPR–Cas9-mediated genetic knockout human intestinal tissue–derived enteroid lines by lentivirus transduction and single-cell cloning.</a> Nat Protoc. 17 (4), 1004-127 (2022).</li>
<li>Crawford, S. E., Ramani, S., Blutt, S. E., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+to+dissect+gastrointestinal+virus-host+interactions%3A+What+have+we+learned%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Organoids to dissect gastrointestinal virus-host interactions: What have we learned.</a> Viruses. 13 (6), 999(2021).</li>
<li>Lambert, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FPbase%3A+a+community-editable+fluorescent+protein+database%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">FPbase: a community-editable fluorescent protein database.</a> Nat Methods. 16 (4), 277-278 (2019).</li>
<li>Lai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+calcium-triggered+secretion+by+hydrocarbon-stapled+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inhibition of calcium-triggered secretion by hydrocarbon-stapled peptides.</a> Nature. 603 (7903), 949-956 (2022).</li>
<li>Chang-Graham, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotavirus+induces+intercellular+calcium+waves+through+ADP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rotavirus induces intercellular calcium waves through ADP signaling.</a> Science. 370 (6519), eabc3621(2020).</li>
<li>Lee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anoctamin+1%2FTMEM16A+controls+intestinal+Cl%E2%88%92+secretion+induced+by+carbachol+and+cholera+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Anoctamin 1/TMEM16A controls intestinal Cl− secretion induced by carbachol and cholera toxin.</a> Exp Mol Med. 51 (8), 1-14 (2019).</li>
<li>Saha, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+TMEM16A+control+luminal+chloride+secretion+in+a+NHERF1+dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Rep%22%5BJournal%5D)">Intestinal TMEM16A control luminal chloride secretion in a NHERF1 dependent manner.</a> Biochem Biophys Rep. 25, 100912(2021).</li>
<li>Mroz, M. S., Keely, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+chronically+upregulates+Ca2%2B-dependent+Cl%E2%88%92+conductance+and+TMEM16A+expression+in+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor chronically upregulates Ca2+-dependent Cl− conductance and TMEM16A expression in intestinal epithelial cells.</a> J Physiol. 590 (8), 1907-1920 (2012).</li>
<li>Sui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+role+of+Ca2%2B-activated+Cl%E2%88%92+channel+transmembrane+member+16A+in+lipopolysaccharide-induced+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Dual role of Ca2+-activated Cl− channel transmembrane member 16A in lipopolysaccharide-induced intestinal epithelial barrier dysfunction in vitro.</a> Cell Death Dis. 11 (5), 404(2020).</li>
<li>Bellono, N. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterochromaffin+cells+are+gut+chemosensors+that+couple+to+sensory+neural+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Enterochromaffin cells are gut chemosensors that couple to sensory neural pathways.</a> Cell. 170 (1), 185-198.e16 (2017).</li>
<li>Paradis, T., Bègue, H., Basmaciyan, L., Dalle, F., Bon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+junctions+as+a+key+for+pathogens+invasion+in+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Tight junctions as a key for pathogens invasion in intestinal epithelial cells.</a> Int J Mol Sci. 22 (5), 2506(2021).</li>
<li>Samak, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium%2FAsk1%2FMKK7%2FJNK2%2Fc-Src+signalling+cascade+mediates+disruption+of+intestinal+epithelial+tight+junctions+by+dextran+sulfate+sodium%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Calcium/Ask1/MKK7/JNK2/c-Src signalling cascade mediates disruption of intestinal epithelial tight junctions by dextran sulfate sodium.</a> Biochem J. 465 (3), 503-515 (2015).</li>
<li>Deng, H., Gerencser, A. A., Jasper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+integration+by+Ca2%2B+regulates+intestinal+stem+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Signal integration by Ca2+ regulates intestinal stem cell activity.</a> Nature. 528 (7581), 212-217 (2015).</li>
<li>Saurav, S., Tanwar, J., Ahuja, K., Motiani, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+host+cell+calcium+signaling+during+viral+infections%3A+Emerging+paradigm+with+high+clinical+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Aspects+Med%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of host cell calcium signaling during viral infections: Emerging paradigm with high clinical relevance.</a> Mol Aspects Med. 81, 101004(2021).</li>
<li>Chang-Graham, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotavirus+calcium+dysregulation+manifests+as+dynamic+calcium+signaling+in+the+cytoplasm+and+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Rotavirus calcium dysregulation manifests as dynamic calcium signaling in the cytoplasm and endoplasmic reticulum.</a> Sci Rep. 9 (1), 10822(2019).</li>
<li>Hyser, J. M., Collinson-Pautz, M. R., Utama, B., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotavirus+disrupts+calcium+homeostasis+by+NSP4+viroporin+activity%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Rotavirus disrupts calcium homeostasis by NSP4 viroporin activity.</a> mBio. 1 (5), e00265-e00310 (2010).</li>
<li>Pham, T., Perry, J. L., Dosey, T. L., Delcour, A. H., Hyser, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rotavirus+NSP4+viroporin+domain+is+a+calcium-conducting+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The Rotavirus NSP4 viroporin domain is a calcium-conducting ion channel.</a> Sci Rep. 7, 43487(2017).</li>
<li>Crawford, S. E., Hyser, J. M., Utama, B., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+hijacked+through+viroporin-activated+calcium%2Fcalmodulin-dependent+kinase+kinase-%CE%B2+signaling+is+required+for+rotavirus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Autophagy hijacked through viroporin-activated calcium/calmodulin-dependent kinase kinase-β signaling is required for rotavirus replication.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (50), E3405-E3413 (2012).</li>
<li>Crawford, S. E., Criglar, J. M., Liu, Z., Broughman, J. R., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COPII+vesicle+transport+is+required+for+Rotavirus+NSP4+interaction+with+the+autophagy+protein+LC3+II+and+trafficking+to+viroplasms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">COPII vesicle transport is required for Rotavirus NSP4 interaction with the autophagy protein LC3 II and trafficking to viroplasms.</a> J Virol. 94 (1), e01341(2019).</li>
<li>Pando, V., Iša, P., Arias, C. F., Ló Pez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+calcium+on+the+early+steps+of+Rotavirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Influence of calcium on the early steps of Rotavirus infection.</a> Virology. 295 (1), 190-200 (2002).</li>
<li>Hyser, J. M., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiological+consequences+of+calcium-conducting+viroporins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Virol%22%5BJournal%5D)">Pathophysiological consequences of calcium-conducting viroporins.</a> Annu Rev Virol. 2 (1), 473-496 (2015).</li>
<li>Strtak, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovirus+NS1-2+has+viroporin+activity+that+induces+aberrant+cellular+calcium+signaling+to+facilitate+virus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Recovirus NS1-2 has viroporin activity that induces aberrant cellular calcium signaling to facilitate virus replication.</a> mSphere. 4 (5), e00506-e00519 (2019).</li>
<li>In, J. G., Foulke-Abel, J., Clarke, E., Kovbasnjuk, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+colonoid+monolayers+to+study+interactions+between+pathogens%2C+commensals%2C+and+host+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Human colonoid monolayers to study interactions between pathogens, commensals, and host intestinal epithelium.</a> J Vis Exp. (146), 59357(2019).</li>
<li>Hirota, A., AlMusawi, S., Nateri, A. S., Ordóñez-Morán, P., Imajo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials+for+intestinal+organoid+technology+and+personalized+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Biomaterials for intestinal organoid technology and personalized disease modeling.</a> Acta Biomater. 132, 272-287 (2021).</li>
<li>Cevallos Porta, D., López, S., Arias, C. F., Isa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+rotavirus+entry+and+release+from+differentiated+small+intestinal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Polarized rotavirus entry and release from differentiated small intestinal cells.</a> Virology. 499, 65-71 (2016).</li>
<li>Mirabelli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Norovirus+efficiently+replicates+in+differentiated+3D-human+intestinal+enteroids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Human Norovirus efficiently replicates in differentiated 3D-human intestinal enteroids.</a> J Virol. 96 (22), e0085522(2022).</li>
<li>Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototoxicity+in+live+fluorescence+microscopy%2C+and+how+to+avoid+it%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it.</a> Bioessays. 39 (8), 28749075(2017).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+NEMO+as+calcium+indicators+with+large+dynamics+and+high+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Engineering of NEMO as calcium indicators with large dynamics and high sensitivity.</a> Nat Methods. 20 (6), 918-924 (2023).</li>
</ol>

Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos que revelar.

Las alteraciones en los niveles citosólicos de Ca2+ pueden ser tanto causa como efecto de patologías dentro del epitelio 10,16,17. Los aumentos en el calcio citosólico pueden impulsar directamente la secreción a través de la activación del canal de cloruro dependiente de calcio TMEM16A18,19. La activación de TMEM16A en respuesta a Ca2+ permite el eflujo apical de cloruro, estableciendo un gradiente osmótico que promueve la secreción de líquidos20,21. Además, los aumentos de Ca2+ dentro de las células enteroendocrinas desencadenan la liberación de serotonina, que estimula las neuronas sensoriales aferentes que pueden modular la actividad dentro del sistema nervioso entérico22. Las señales de Ca2+ también pueden modular las uniones estrechas para influir en la función de barrera23,24 y regular la proliferación en las células madre intestinales25. Por lo tanto, la desregulación del Ca2+ puede tener efectos amplios y de gran alcance.
Muchos virus manipulan el Ca2+ citosólico para crear un entorno celular propicio para la replicación26. El rotavirus es un excelente ejemplo de esto dentro del epitelio intestinal27. La proteína no estructural 4 (NSP4) del rotavirus es un canal conductor de Ca2+ que permite el flujo de Ca2+ desde el retículo endoplásmico hacia el citosol28,29. Esto estimula la autofagia y ayuda al ensamblaje de la cápside externa 30,31,32. La infección por rotavirus también induce la liberación de ADP, desencadenando ondas intercelulares de Ca2+ que contribuyen a la patogénesis17. Otros virus entéricos, incluidos los calicivirus y los enterovirus, codifican viroporinas conductoras de Ca2+ que desencadenan una desregulación similar de Ca2+ dentro de las células infectadas33,34.
Las imágenes de células vivas de Ca2+ de organoides intestinales humanos ofrecen una plataforma versátil para estudiar la señalización inducida por virus dentro del epitelio. Sin embargo, la solidez de las conclusiones extraídas de los datos de las imágenes depende, inextricablemente, de la salud y la calidad de las HIO, de los parámetros de imagen apropiados y de un enfoque analítico sólido.
La transducción lentiviral eficiente es a menudo el paso limitante cuando se establecen nuevas líneas de OHIO, pero el lentivirus de alto título y las transducciones múltiples ayudan a garantizar una expresión suficiente del transgén. Es importante destacar que esto tendrá que equilibrarse con el potencial de estrés celular significativo en la transducción. En la mayoría de los casos, esto es temporal y desaparece después de la selección y múltiples pasajes. No obstante, es fundamental que las OHIO diseñadas para expresar GECI muestren un crecimiento y proliferación normales antes de comenzar los experimentos. Del mismo modo, dispersar HIOs tridimensionales y reformarlos como monocapas induce estrés celular. Es una buena práctica dejar pasar tres o más días para que las monocapas se adapten después del enchapado. El recubrimiento de las placas con colágeno IV es fundamental para la integridad de la monocapa35,36. Aliquotar el colágeno IV y almacenarlo a -80 °C entre usos ayuda a garantizar la adherencia de la monocapa. Determinar la densidad de siembra óptima para cada línea HIO también puede ayudar a mejorar la consistencia. Por último, incluir los controles adecuados, y compararlos entre experimentos, es indispensable para garantizar que cualquier observación represente una respuesta a la variable en cuestión, en lugar de un factor de confusión técnico.
Si bien la puntuación de una monocapa puede causar daño celular no deseado, mejora en gran medida la infección por RV de las OHIO 2D. La Figura 2 ilustra esto, ya que casi todas las células infectadas están directamente adyacentes al rasguño. La evidencia experimental sugiere que el VD infecta de manera más eficiente en la superficie basolateral de las células epiteliales intestinales37. Por lo tanto, se predice que la puntuación de una monocapa mejora la infectividad al exponer la superficie basolateral. También se puede lograr una infección monocapa eficiente mediante la siembra de HIO en membranas de policarbonato suspendidas en pocillos que contienen medio de cultivo, que permiten el acceso a la superficie basolateral. Sin embargo, la distancia relativamente larga entre la placa y la membrana de policarbonato, la propia membrana de policarbonato y la superficie plástica en la base del pocillo las hacen inapropiadas para la obtención de imágenes de epifluorescencia. Por lo tanto, el método de puntuación descrito en este protocolo sigue siendo el enfoque preferido. Dado que la puntuación en sí misma puede conducir a perturbaciones de señalización, la inclusión del control no infectado y puntuado es fundamental para la interpretación. En el caso de los virus, como el norovirus humano, que infectan eficientemente a través de la membrana apical, no es necesario marcar la monocapa38.
Al igual que con cualquier sistema de imágenes en vivo, la fototoxicidad puede confundir fácilmente los experimentos que utilizan monocapas de HIO. A lo largo de un experimento de imagen, es importante monitorear la vacuolización inesperada, la formación de ampollas en la membrana u otros indicadores morfológicos de estrés39. Si se detecta alguno de estos signos, se debe reducir la duración, la frecuencia o la potencia de excitación. El aumento de la relación señal-ruido a menudo se produce a expensas de la salud celular a largo plazo, por lo que la optimización empírica de los parámetros es crucial. El fotoblanqueo, indicado por una disminución de la intensidad de fluorescencia basal a lo largo del tiempo, es un presagio de estrés celular y debe evitarse.
La visualidad de los datos de imagen puede llevar a los investigadores a favorecer los análisis cualitativos, en lugar de los cuantitativos. Sin embargo, como ocurre con cualquier modalidad, las conclusiones reproducibles requieren cuantificación. El análisis cuantitativo de imágenes contiene mucha más complejidad de la que se puede cubrir en un solo manuscrito, pero vale la pena destacar algunos puntos clave. En primer lugar, una cuantificación coherente requiere una adquisición coherente. Es posible que una canalización de análisis desarrollada para un conjunto determinado de parámetros de adquisición no sea eficaz para imágenes adquiridas a diferentes frecuencias, tiempos de exposición, potencias láser o longitudes de onda. En segundo lugar, la multiplicidad de infecciones tiene una influencia descomunal en la frecuencia de las señales de calcio inducidas por virus. Por lo tanto, es importante evaluar el número de células infectadas por campo de visión y garantizar la coherencia en todas las condiciones de tratamiento. Alternativamente, normalizar la frecuencia de la señal al número de células infectadas por campo de visión puede ayudar a reducir el error. Por último, mientras que el indicador de calcio basado en mNG (NEMO) recientemente desarrollado ofrece un enfoque prometedor para determinar las concentraciones absolutas de Ca2+ en las células40, la mayoría de los biosensores sólo transmiten información relativa sobre los sistemas biológicos. Por lo tanto, la sustracción de fondo, la normalización y la comparación con un control son fundamentales.
Si bien este protocolo se centra en las imágenes de calcio durante la infección viral, el enfoque general es fácilmente adaptable. La infección viral puede sustituirse fácilmente por una afección de tratamiento alternativa, y existe una letanía cada vez mayor de biosensores para monitorear muchas vías y procesos celulares diferentes. Con cualquier adaptación del protocolo, los investigadores deben tener en cuenta el análisis, diseñando experimentos con resultados claros y cuantificables.
En general, las imágenes en vivo proporcionan una resolución temporal inigualable, lo que mejora la caracterización de procesos altamente dinámicos. La incorporación de organoides en experimentos de imágenes en vivo permite la observación de estos procesos en un modelo fiel al tejido y fisiológicamente relevante. Esperamos que el protocolo descrito aquí facilite el diseño experimental y la optimización, permitiendo a los investigadores descubrir nuevos aspectos de la señalización celular y tisular.

El calcio es un segundo mensajero ampliamente conservado que desempeña un papel fundamental en laregulación de la fisiología celular. Dada su fuerte carga, su pequeño tamaño y su alta solubilidad en condiciones fisiológicas, el calcio es un manipulador ideal de la conformación de las proteínas. Esto hace que el calcio sea un medio poderoso para transducir señales electroquímicas en alteraciones enzimáticas, transcripcionales o postranscripcionales. Los estrictos gradientes de concentración de calcio a través del retículo endoplásmico (RE) y las membranas plasmáticas crean una alta fuerza impulsora que permite cambios rápidos en la concentración de calcio citosólico. Múltiples mecanismos, incluyendo tanto la amortiguación como el transporte activo, mantienen estrechamente este gradiente. Si bien es necesario para las funciones celulares normales, este mantenimiento es energéticamente costoso, lo que lo hace particularmente susceptible en estados de estrés 2.
Como tal, la desregulación del calcio dentro del citosol es una señal casi universal de muchos tipos de estrés celular. Las alteraciones metabólicas, las toxinas, los patógenos, los daños mecánicos y las perturbaciones genéticas pueden alterar la señalización del calcio. Independientemente del estímulo, a nivel de toda la célula, los aumentos sostenidos e incontrolados del calcio citosólico pueden promover la apoptosis y, finalmente, la necrosis 3,4. Sin embargo, las alteraciones en los niveles citosólicos de calcio de menor amplitud o mayor frecuencia tienen efectos variables2. Del mismo modo, los resultados de las fluctuaciones de calcio pueden diferir en función del microdominio espacial en el que se producen5. Por lo tanto, el monitoreo de los niveles de calcio puede ofrecer información sobre los procesos de señalización dinámica, pero esto requiere un muestreo con una resolución temporal y espacial relativamente alta.
Los indicadores de calcio codificados genéticamente (GECI) son herramientas poderosas para el muestreo continuo en sistemas de células vivas6. Algunos de los GECI más utilizados son las proteínas fluorescentes sensibles al calcio basadas en GFP conocidas como GCaMPs7. El GCaMP canónico es una fusión de tres dominios proteicos distintos: una GFP permutada circularmente (cpGFP), calmodulina y M136. El dominio calmodulina sufre un cambio de conformación al unirse al calcio, lo que permite su interacción con M13. La interacción calmodulina-M13 induce un cambio conformacional en el cpGFP que aumenta su emisión fluorescente tras la excitación. Como tal, un aumento en la concentración de calcio se correlaciona con un aumento en la intensidad de fluorescencia de GCaMP. Estos sensores pueden ser citosólicos o dirigidos a orgánulos específicos8.
Al igual que la mayoría de los tejidos, el calcio regula una variedad de funciones dentro del epitelio gastrointestinal. El epitelio intestinal es fundamental para la absorción de nutrientes y líquidos, pero también debe formar una barrera hermética y una interfaz inmunitaria para evitar la invasión de patógenos o las agresiones tóxicas. Las vías dependientes del calcio influyen en casi todas estas funciones vitales 9,10,11. Sin embargo, la señalización del calcio dentro del epitelio intestinal sigue siendo una frontera poco explorada con un potencial prometedor como diana terapéutica. Si bien el monitoreo de la dinámica del calcio dentro del epitelio intestinal in vivo sigue presentando desafíos, los organoides intestinales humanos (HIO) ofrecen un sistema ex vivo adaptable para la experimentación12. Los HIO son esferoides tridimensionales (3D) derivados de células madre intestinales humanas y, al diferenciarse, recapitulan gran parte de la diversidad celular del epitelio intestinal nativo12.
Este protocolo describe métodos integrales para diseñar HIO que expresan GECI y luego preparar HIO diseñadas como monocapas para la obtención de imágenes de calcio de células vivas. Ofrece la infección viral como ejemplo de una manipulación patológica que interrumpe la señalización del calcio y proporciona un enfoque analítico para cuantificar estos cambios.

<table><tbody><tr><td>DMEM Avanzado F12</td><td>Gibco</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>[Leu15]-Gastrin I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9145</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Tripsina EDTA&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>25300054</tr><tr><td>0.05% Tripsina EDTA&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>25300054</tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml</td><td>Fisherbrand 5408137</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tubos cónicos de 15 ml</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>0553859A</td><td></td></tr><tr><td>16% de formaldehído</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>1M HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>1M HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Corning&nbsp;</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de calibre 25</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>1482113D</td><td></td></tr><tr><td>A-83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>ADP</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A2754</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM F12</td><td>Gibco 12634028</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-antimicocítico&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-antimicótico&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>B27 Suplemento</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>FisherScientific&nbsp;</td><td></td><td></td>BP1600100</tr><tr><td>Portaobjetos de cultivo celular CellView, PS, 75/25 MM, fondo de cristal, 10 compartimentos</td><td>Greiner</td><td>543979</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno IV</td><td>Sigma</td><td>Aldrich C5533</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Corning 46-034-CI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>35010CV</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>35010CV</td><td></td></tr><tr><td>Fluorobrito</td><td>Gibco</td><td>A1896701</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>35050079</tr><tr><td>GlutaMAX&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>35050079</tr><tr><td>Factor de crecimiento epidérmico humano</td><td>ProteinTech</td><td>HZ-1326</td><td></td></tr><tr><td>Lentivirus</td><td>VectorBuilder</td><td>(variable)</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosceicen</td><td>356231/CB40230C</td><td></td></tr><tr><td>N2 Suplemento</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>N-acetilcisteína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Placas de 24 pocillos tratadas</td> con cultivo celular <td>Thermofisher Scientific</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>MilliporeSigma</td><td>TR1003G</td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S70767</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher BioReactivos</td><td>BP151100</td><td></td></tr><tr><td>Enzima TrypLE Express, rojo sin fenol</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Worthington Biochemical</td><td>NC9811754</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

obtención de imágenes de calcio en vivo de monocapas de organoides intestinales humanos infectadas por virus utilizando indicadores de calcio codificados genéticamente

Live Calcium Imaging of Virus-Infected Human Intestinal Organoid Monolayers Using Genetically Encoded Calcium Indicators

La señalización del calcio es un regulador integral de casi todos los tejidos. Dentro del epitelio intestinal, el calcio está involucrado en la regulación de la actividad secretora, la dinámica de la actina, las respuestas inflamatorias, la proliferación de células madre y muchas otras funciones celulares no caracterizadas. Como tal, el mapeo de la dinámica de señalización del calcio dentro del epitelio intestinal puede proporcionar información sobre los procesos celulares homeostáticos y revelar respuestas únicas a diversos estímulos. Los organoides intestinales humanos (HIO) son un modelo de alto rendimiento derivado del ser humano para estudiar el epitelio intestinal y, por lo tanto, representan un sistema útil para investigar la dinámica del calcio. Este artículo describe un protocolo para transducir de manera estable HIOs con indicadores de calcio codificados genéticamente (GECIs), realizar microscopía de fluorescencia en vivo y analizar datos de imágenes para caracterizar significativamente las señales de calcio. Como ejemplo representativo, las OHIO tridimensionales se transducieron con lentivirus para expresar de forma estable GCaMP6s, una GECI citosólica verde fluorescente basada en proteínas. A continuación, las OHIO modificadas se dispersaron en una suspensión unicelular y se sembraron como monocapas. Después de la diferenciación, las monocapas de HIO se infectaron con rotavirus y/o se trataron con fármacos que se sabe que estimulan una respuesta de calcio. Un microscopio de epifluorescencia equipado con una cámara de imágenes en vivo humidificada y con temperatura controlada permitió obtener imágenes a largo plazo de monocapas infectadas o tratadas con medicamentos. Después de la obtención de imágenes, las imágenes adquiridas se analizaron utilizando el software de análisis disponible gratuitamente, ImageJ. En general, este trabajo establece una línea adaptable para caracterizar la señalización celular en HIO.

La Figura 1A muestra una cúpula de BMM que contiene organoides intestinales humanos tridimensionales que han sido transducidos para expresar de forma estable GCaMP6s. La Figura 1B muestra la misma línea de organoide resarvida como monocapa a las 24, 48 y 72 h después de la siembra. Para validar la función de GCaMP6s, se obtuvieron imágenes de la monocapa mediante microscopía de fluorescencia cada 2 s durante 4 min, y se añadieron 100 nM de ADP al medio después de ~20 s. El ADP provoca la liberación de calcio del retículo endoplásmico, aumentando el calcio citosólico. La intensidad de fluorescencia detectada en el canal de 488 nm en cada exposición se representa en la Figura 1C. El trazado muestra una intensidad de fluorescencia basal constante seguida de un rápido aumento tras la adición de ADP y un retorno gradual hacia la línea de base. Se incluye un control del vehículo para verificar que la respuesta es un verdadero evento de señalización, y no simplemente un cambio en la intensidad de fluorescencia que puede surgir de la adición de medios.
La puntuación de una monocapa de HIO aumenta la eficiencia de la infección por rotavirus. Si bien las técnicas para la puntuación varían, es más fácil obtener una infección consistente utilizando una sola puntuación a lo largo de la monocapa, como se muestra en la Figura 2A. Cuando se utilizan cepas recombinantes de rotavirus que expresan proteínas fluorescentes, la infección se puede verificar durante la obtención de imágenes en vivo (Figura 2B). Cuando se utiliza una cepa que no expresa un marcador, la infección se puede detectar mediante inmunofluorescencia después de la obtención de imágenes. Dada la motilidad de las células en las monocapas de HIO, a menudo es difícil rastrear una sola célula infectada a lo largo del tiempo. En su lugar, utilice la tinción de punto final como método para verificar la infección y confirmar que la multiplicidad de infecciones coincide entre los campos de visión (Figura 2C).
Las ondas de calcio intercelular en las HIO se pueden observar cualitativamente, como se muestra en la Figura 3A. Sin embargo, determinar la frecuencia de las ondas de calcio en un campo de visión determinado requiere un análisis cuantitativo. Los pasos para una segmentación exitosa, como se describe en el paso 6 del protocolo anterior, se ilustran en la Figura 3A. La figura muestra la imagen en bruto (Figura 3Ai), la imagen después de restar las intensidades de píxeles del fotograma anterior (Figura 3Aii) y, a continuación, la onda de calcio segmentada (Figura 3Aiii).
Una vez que las ondas de calcio han sido segmentadas y cuantificadas para cada campo de visión en el transcurso de la ejecución de imágenes, a menudo es informativo comparar la frecuencia de las ondas en monocapas expuestas a diversas condiciones. El gráfico de tiras de la Figura 3B muestra el número total de ondas de calcio por campo de visión en monocapas simuladas e inoculadas con rotavirus. Este ejemplo incluye dos cepas de RV: una cepa de rotavirus humano (Ito HRV) y una cepa recombinante de rotavirus simio SA11 que expresa mRuby (SA11-mRuby). El control infectado simulado se toma como la frecuencia de onda de calcio de referencia, las monocapas infectadas por rotavirus no tratadas sirven como controles positivos, y las monocapas infectadas por rotavirus tratadas son las condiciones experimentales. Las monocapas infectadas por simulacro y las infectadas por RV tratadas con fármacos, incluido el inhibidor del receptor de ADP, BPTU, pueden compararse con ambas condiciones de control mediante ANOVA de un factor. Los datos sugieren que el BPTU disminuye efectivamente la frecuencia de las ondas de calcio intercelulares.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66132/66132fig01.jpg"> Figura 1: Validación de la expresión de GCaMP6s en organoides intestinales humanos yeyunales. (A) Después de la transducción de lentivirus, las IO que expresan GCaMP se sometieron a selección y múltiples pasajes, que se muestran aquí a los 7 días desde el pasaje más reciente. Tras la estimulación con el láser de 488 nm, la expresión de GCaMP6s es evidente en las OHIO transducidas recubiertas en una matriz de membrana basal de 15 μL como esferoides tridimensionales (Ai). Se adquirieron exposiciones de 50 ms al 50% de potencia láser utilizando un objetivo de 20x, y luego se unieron para visualizar toda la cúpula de la matriz de la membrana basal. Un proceso similar se llevó a cabo utilizando exposiciones de campo claro (Aii) de 4 ms. En la imagen de campo claro, los HIO oscuros en el centro de la cúpula son una indicación de que los cultivos están listos para el paso. (B) Las HIO se digierieron enzimáticamente en una suspensión unicelular, luego se volvieron a colocar a una densidad de 150.000 células por pocillo (5 mm de diámetro) de una placa inferior de imagen prerrecubierta con colágeno IV. A las 72 h después de la siembra, la monocapa era confluente y estaba lista para aplicaciones posteriores. Para validar la función de GCaMP, se adquirieron imágenes utilizando el conjunto de filtros de 488 nm con exposiciones de 50 ms a una potencia láser del 50% cada 2 s durante 4 min. (C) Las trazas que se muestran aquí representan la intensidad de fluorescencia de campo completo normalizada a la primera adquisición en el transcurso de la obtención de imágenes. Alrededor de 20 s (flecha), después de la décima exposición, se añadieron 100 nM de difosfato de adenosina (ADP) para provocar un pico de calcio citosólico (rojo). La adición de un volumen igual de 1x PBS no provocó una respuesta significativa (azul). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66132/66132fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66132/66132fig02.jpg"> Figura 2: Puntuación de una monocapa HIO para facilitar la infección por VD. (A) La figura ilustra una técnica adecuada para marcar una monocapa utilizando una aguja de 25G. (B) Una monocapa de HIO se infectó con una cepa recombinante de RV que expresa la proteína fluorescente mRuby (magenta, flecha), lo que permite la identificación de células infectadas. Alternativamente, cuando se utiliza una cepa natural de RV, las células infectadas se pueden identificar mediante inmunofluorescencia. (C) Las imágenes que se muestran son de 4 monocapas HIO diferentes después de la fijación, la tinción de DAPI (azul) y el marcaje de anticuerpos del antígeno de rotavirus (magenta). Ambas técnicas ilustran la infección preferencial del VD cerca de la porción marcada de la monocapa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66132/66132fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66132/66132fig03.jpg"> Figura 3: Segmentación y cuantificación de las ondas de calcio intercelulares inducidas por RV. Las exposiciones a 488 nm de las OHIO infectadas por RV que expresan GCaMP6 se adquirieron cada 1 minuto durante 16 h utilizando el protocolo. (A) La figura ilustra el proceso de segmentación de las ondas de calcio intercelular. En primer lugar, los valores de píxel de la adquisición anterior (t-1) se restan de cada imagen en bruto (Ai) para cuantificar el cambio en la intensidad de fluorescencia (Aii). A continuación, se aplica un umbral basado en un aumento mínimo de intensidad optimizado experimentalmente con respecto al fotograma anterior. A continuación, las imágenes se filtran para un área de señal contigua mínima para seleccionar las ondas de calcio intercelulares (Aiii) y excluir las señales de calcio de una sola célula. Este procesamiento permite la cuantificación de las ondas de calcio en cada campo de visión. En este experimento, las monocapas se infectaron simuladamente, se infectaron con la cepa ITO del rotavirus humano (HRV) o se infectaron con una cepa recombinante de rotavirus de simio que codifica mRuby en el segmento del gen 7, aguas abajo de la proteína no estructural 3 (SA11-mRuby). Las monocapas infectadas se trataron con el inhibidor del receptor de ADP BPTU o no se trataron. A continuación, se obtuvieron imágenes de las monocapas en 8 posiciones diferentes, y se cuantificaron las ondas de calcio en cada campo de visión utilizando la tubería descrita en este protocolo. Los puntos en el gráfico de tiras indican el número de ondas de calcio detectadas en cada posición superpuestas en un gráfico de barras que marca la media y la DE. El ANOVA de un factor seguido de las pruebas de Dunnett muestra que, si bien cualquiera de las cepas de VD aumenta la frecuencia de las ondas de calcio intercelulares por encima de la del grupo no infectado, el tratamiento con BPTU previene el aumento mediado por RV en la frecuencia de las ondas de calcio. **p<0.01, ***p<0.001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66132/66132fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reactivo</td>
			<td>Transducción</td>
			<td>Control</td>
		</tr><tr><td>Y-27632 (stock de 1 mM)</td>
			<td>4 μL</td>
			<td>4 μL</td>
		</tr><tr><td>Polibreno (1 mg/μL de stock)</td>
			<td>2 μL</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr><tr><td>Lentivirus</td>
			<td>variable*</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>HighWnt-WRNE *ver notas</td>
			<td>hasta 400 μL</td>
			<td>hasta 400 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Medio de transducción de lentivirus. Prepare el medio de transducción y el medio de control combinando los reactivos en los volúmenes indicados en la segunda y tercera columna, respectivamente. Apunte a una multiplicidad de infección (MOI) de 10 unidades de transducción de lentivirus por célula. En el caso de los LV envasados internamente, esto suele requerir ~25-50 μL de VI concentrado. El título de la mayoría de los LV envasados comercialmente se proporcionará con el Certificado de Análisis.
Archivo de codificación suplementario 1: Script de macros ImageJ para permitir la cuantificación de ondas de calcio mediante procesamiento por lotes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66132/Wave_counter.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Este protocolo describe un enfoque para la realización de imágenes de calcio en organoides intestinales humanos infectados por virus y ofrece un enfoque para el análisis.

Obtención de imágenes de calcio en vivo de monocapas de organoides intestinales humanos infectadas por virus utilizando indicadores de calcio codificados genéticamente

Calcium signaling is an integral regulator of nearly every tissue. Within the intestinal epithelium, calcium is involved in the regulation of secretory ...

A través de nuestro trabajo, nuestro objetivo es comprender cómo los virus interrumpen la señalización dentro del epitelio intestinal. Estamos particularmente interesados en comprender las formas en que las células infectadas por virus desregulan las células vecinas no infectadas para contribuir a la patogénesis. Recientemente hemos descubierto que las células infectadas por rotavirus liberan pulsos de ADP, que desregula las células vecinas no infectadas y facilita la propagación viral y exacerba la enfermedad.Si bien las imágenes de calcio son muy populares en campos como la neurociencia, no se han utilizado ampliamente para estudiar la biología epitelial o la virología. Este protocolo ofrece un enfoque para adaptar las tecnologías existentes y los sistemas modelo para estudiar la señalización del calcio y el tejido epitelial infectado por virus vivos. Mediante la ingeniería de organoides para expresar indicadores de calcio codificados genéticamente, nuestro enfoque permite obtener imágenes consistentes y reproducibles a largo plazo en un sistema modelo que recapitula la diversidad celular del epitelio intestinal humano.Nuestro objetivo es comprender los efectos de la señalización purinérgica paracrina inducida por virus tanto para el huésped como para el virus. Nuestro trabajo futuro también determinará si este tipo de señalización se conserva ampliamente en otros virus y si los efectos son similares.

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Obtención de imágenes de calcio en vivo de monocapas de organoides intestinales humanos infectadas por virus utilizando indicadores de calcio codificados genéticamente

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