Name: Uso de imágenes de células vivas para medir los efectos de las proteínas patológicas en el transporte axonal en las neuronas primarias del hipocampo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-22T14:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Aprende a medir los efectos de proteínas patológicas en el transporte axonal usando imágenes de células vivas en neuronas primarias del hipocampo. Este método ayuda a investigar los mecanismos de neurodegeneración.

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<meta charset="utf8"></head><body>Visualización de proteínas en neuronas primarias del hipocampo mediante imágenes de células vivas

<ol><li>Kneynsberg, A., Combs, B., Christensen, K., Morfini, G., Kanaan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+degeneration+in+tauopathies%3A+disease+relevance+and+underlying+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Axonal degeneration in tauopathies: disease relevance and underlying mechanisms.</a> Front Neurosci. 11, 572(2017).</li>
<li>Combs, B., Mueller, R. L., Morfini, G., Brady, S. T., Kanaan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+and+axonal+transport+misregulation+in+tauopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Tau and axonal transport misregulation in tauopathies.</a> Adv Exp Med Biol. 1184, 81-95 (2019).</li>
<li>Brady, S. T., Morfini, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+motor+proteins%2C+axonal+transport+deficits+and+adult-onset+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Regulation of motor proteins, axonal transport deficits and adult-onset neurodegenerative diseases.</a> Neurobiol Dis. 105, 273-282 (2017).</li>
<li>Morfini, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+defects+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Axonal transport defects in neurodegenerative diseases.</a> J Neurosci. 29 (41), 12776-12786 (2009).</li>
<li>Brady, S. T., Lasek, R. J., Allen, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+axonal+transport+in+extruded+axoplasm+from+squid+giant+axon%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fast axonal transport in extruded axoplasm from squid giant axon.</a> Science. 218 (4577), 1129-1131 (1982).</li>
<li>LaPointe, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amino+terminus+of+tau+inhibits+kinesin-dependent+axonal+transport%3A+implications+for+filament+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">The amino terminus of tau inhibits kinesin-dependent axonal transport: implications for filament toxicity.</a> J Neurosci Res. 87 (2), 440-451 (2009).</li>
<li>Kanaan, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+forms+of+tau+inhibit+kinesin-dependent+axonal+transport+through+a+mechanism+involving+activation+of+axonal+phosphotransferases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pathogenic forms of tau inhibit kinesin-dependent axonal transport through a mechanism involving activation of axonal phosphotransferases.</a> J Neurosci. 31 (27), 9858-9868 (2011).</li>
<li>Kanaan, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+in+the+amino+terminus+of+tau+prevents+inhibition+of+anterograde+axonal+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation in the amino terminus of tau prevents inhibition of anterograde axonal transport.</a> Neurobiol Aging. 33 (4), 826.e15-826.e30 (2012).</li>
<li>Pigino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+fast+axonal+transport+is+a+pathogenic+mechanism+for+intraneuronal+amyloid+beta%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Disruption of fast axonal transport is a pathogenic mechanism for intraneuronal amyloid beta.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (14), 5907-5912 (2009).</li>
<li>Morfini, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+huntingtin+inhibits+fast+axonal+transport+by+activating+JNK3+and+phosphorylating+kinesin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pathogenic huntingtin inhibits fast axonal transport by activating JNK3 and phosphorylating kinesin.</a> Nat Neurosci. 12 (7), 864-871 (2009).</li>
<li>Morfini, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+fast+axonal+transport+by+pathogenic+SOD1+involves+activation+of+p38+MAP+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Inhibition of fast axonal transport by pathogenic SOD1 involves activation of p38 MAP kinase.</a> PLoS One. 8 (6), e65235(2013).</li>
<li>Combs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frontotemporal+lobar+dementia+mutant+tau+impairs+axonal+transport+through+a+protein+phosphatase+1gamma-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Frontotemporal lobar dementia mutant tau impairs axonal transport through a protein phosphatase 1gamma-dependent mechanism.</a> J Neurosci. 41 (45), 9431-9451 (2021).</li>
<li>Christensen, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphomimetics+at+Ser199%2FSer202%2FThr205+in+tau+impairs+axonal+transport+in+rat+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Phosphomimetics at Ser199/Ser202/Thr205 in tau impairs axonal transport in rat hippocampal neurons.</a> Mol Neurobiol. 60 (6), 3423-3438 (2023).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li>
<li>Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+hippocampal+neurons+from+prenatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice.</a> J Vis Exp. (65), 3634(2012).</li>
<li>Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KymoAnalyzer%3A+a+software+tool+for+the+quantitative+analysis+of+intracellular+transport+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons.</a> Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).</li>
<li>Cox, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+isoform-specific+tau+aggregates+suggests+a+common+toxic+mechanism+involving+similar+pathological+conformations+and+axonal+transport+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Analysis of isoform-specific tau aggregates suggests a common toxic mechanism involving similar pathological conformations and axonal transport inhibition.</a> Neurobiol Aging. 47, 113-126 (2016).</li>
<li>Tiernan, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudophosphorylation+of+tau+at+S422+enhances+SDS-stable+dimer+formation+and+impairs+both+anterograde+and+retrograde+fast+axonal+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Pseudophosphorylation of tau at S422 enhances SDS-stable dimer formation and impairs both anterograde and retrograde fast axonal transport.</a> Exp Neurol. 283 (Pt A), 318-329 (2016).</li>
<li>Mueller, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau%3A+a+signaling+hub+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Tau: a signaling hub protein.</a> Front Mol Neurosci. 14, 647054(2021).</li>
<li>Hedstrom, K. L., Ogawa, Y., Rasband, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AnkyrinG+is+required+for+maintenance+of+the+axon+initial+segment+and+neuronal+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">AnkyrinG is required for maintenance of the axon initial segment and neuronal polarity.</a> J Cell Biol. 183 (4), 635-640 (2008).</li>
<li>Basu, H., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QuoVadoPro%2C+an+autonomous+tool+for+measuring+intracellular+dynamics+using+temporal+variance%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">QuoVadoPro, an autonomous tool for measuring intracellular dynamics using temporal variance.</a> Curr Protoc Cell Biol. 87 (1), e108(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0,4% Azul de tripán</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,7 mL</td><td>DOT</td><td>RN1700-GMT</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina al 2,5%</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 3 mL con aguja de 21 G</td><td>Fisher</td><td>14-826-84</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de plástico de 10 mL</td><td>Fisher</td><td>14-823-2A</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de 14 G</td><td>Fisher</td><td>14-817-203</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de 15 G</td><td>Medline</td><td>SWD200029Z</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de 16 G</td><td>Fisher</td><td>14-817-104</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de 18 G</td><td>Fisher</td><td>14-840-97</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de 22 G</td><td>Fisher</td><td>14-840-90</td><td></td></tr><tr><td>32% paraformaldehído</td><td>Fisher</td><td>50-980-495</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 cabra anti-conejo IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A21244</td><td>RRID:AB_2535813</td></tr><tr><td>Anfotericina B</td><td>Gibco</td><td>15290-026</td><td></td></tr><tr><td>Arruga Pinzas de cápsula microembrionaria, curvadas; 4"&nbsp;</td><td>Autoclave Roboz</td><td>RS-5163</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Suplemento (50x), sin suero</td><td>Gibco</td><td>A3582801</td><td></td></tr><tr><td>BioCoat Placas de lisina Poly D de 24 pocillos&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>08-774-124</td><td></td></tr><tr><td>ácido bórico</td><td>Sigma</td><td>B6768-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo 3 1/2" de largo 8 x 0,15 mm Ángulo Tijeras afiladas</td><td>Autoclave Roboz</td><td>RS-5658</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo</td><td></td><td></td> de recuento de células <td>automático o manual</td></tr><tr><td>Microscopio confocal con accesorio</td> <td>de cámara de células vivas</td><td></td><td></td></tr><tr>Software <td></td><td></td><td></td>de <td>imagen confocal</td></tr><tr><td>D-(+)-glucosa</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>DNasa I (Worthington)</td><td>Fisher</td><td>NC9185812</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco</td><td>Gibco</td><td>14200-075</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Fisher</td><td>O2783-100</td><td></td></tr><tr><td>Fatal-Plus Solution</td><td>Vortech Pharmaceuticals, LTD</td><td>NDC 0298-9373-68</td><td>pentobarbital sódico; se pueden utilizar otros métodos aprobados de eutanasia&nbsp;</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Invitrogen</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>Solución reactiva de gentamicina</td><td>Gibco</td><td>15710-072</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>sustituto de glutamina</td></tr><tr><td>Solución salina equilibrada de Hanks</td><td>Gibco</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ versión 1.51n</td><td>ImageJ</td><td></td><td>Life-Line versión 2017 30 de mayo: https://imagej.net/software/fiji/downloads</td></tr><tr><td>KymoAnalyzer (versión 1.01)</td><td>El paquete Encalada Lab</td><td></td><td>incluye las 6 macros: https://www.encalada.scripps.edu/kymoanalyzer</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000</td><td>Invitrogen</td><td>100022050</td><td>Uso con el reactivo potenciador de la transfección P3000</td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Fisher</td><td>AC223211000</td><td></td></tr><tr><td>MES hydrate</td><td>Sigma</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>Micro Tijeras de Disección 3.5" Recta Sharp/Sharp</td><td>Roboz</td><td>RS-5910</td><td>autoclave</td></tr><tr><td>Neurobasal Plus medio</td><td>Gibco</td><td>A3582901</td><td></td></tr><tr><td>Neurofascin (A12/18) Ratón IgG2a</td><td>UC Davis/NIH NeuroMab</td><td>75-172</td><td>RRID:AB_2282826; 250 ng/mL; Funciona en neuronas de rata, NO en neuronas de ratón</td></tr><tr><td>Neurofascin 186 (D6G60) Señalización</td><td>de células</td> IgG de conejo <td>15034</td><td>RRID:AB_2773024; 500 ng/mL; Funciona en neuronas de ratón, no lo hemos probado en neuronas de rata</td></tr><tr><td>suero de ternero recién nacido</td><td>Gibco</td><td>16010-167</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985-062</td><td></td></tr><tr><td>P3000</td><td>Invitrogen</td><td>100022057</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri, vidrio de 100 x 10 mm</td><td>Fisher</td><td>08-748B</td><td>Para disección; placa de Petri para autoclave</td></tr><tr><td>, vidrio de 100 x 20 mm</td><td>Fisher</td><td>08-748D</td><td>Para colocar cuernos uterinos en; autoclave</td></tr><tr><td>Poly-D-lisina</td><td>Sigma</td><td>P7886-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga cónicos de polipropileno (15 mL)</td><td>Fisher</td><td>14-955-238</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga cónicos de polipropileno (50 mL)</td><td>Fisher</td><td>14-955-238</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Fisher</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de sodio</td><td>Sigma</td><td>S5636</td><td></td></tr><tr><td>borato de sodio decahidrato</td><td>VWR</td><td>MK745706</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de operación de hoja recta Blunt/Sharp</td><td>Fisher</td><td>13-810-2</td><td>autoclave</td></tr><tr><td>Filtros de jeringa, 0.22 y micro; m</td><td>VWR</td><td>514-1263</td><td></td></tr><tr><td>Pinza de vendaje para pulgar, dentada, 4,5"</td> <td>Autoclave Roboz</td><td>RS-8100</td><td></td></tr><tr><td>&micro;-Slide 4 Pocillos Fondo de Vidrio</td><td>Ibidi</td><td>80427</td><td></td></tr></tbody></table>

uso de imágenes de células vivas para medir los efectos de las proteínas patológicas en el transporte axonal en las neuronas primarias del hipocampo

Using Live&#45;Cell Imaging to Measure the Effects of Pathological Proteins on Axonal Transport in Primary Hippocampal Neurons

Utilizando estos métodos, caracterizamos el transporte axonal en presencia de formas de proteína tau de tipo salvaje o relacionadas con la enfermedad para examinar los posibles mecanismos de la neurotoxicidad patológica inducida por tau en la enfermedad12,13. El software KymoAnalyzer calcula y agrupa una variedad de parámetros diferentes de todos los kymographs dentro de una carpeta determinada. Las tarifas de transporte se calculan solo cuando la carga está en m...

Uso de imágenes de células vivas para medir los efectos de las proteínas patológicas en el transporte axonal en las neuronas primarias del hipocampo

Bidirectional transport of cargos along the axon is critical for maintaining functional synapses, neural connectivity, and healthy neurons. Axonal ...

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Imágenes de células vivas es de particular utilidad en el estudio de la dinámica del tráfico de orgánulos. A continuación se describe un protocolo para obtener imágenes en vivo de alta densidad de núcleo vesículas en las neuronas cultivadas con amplio campo de la microscopía de fluorescencia. Este protocolo es flexible y puede adaptarse a los orgánulos de imagen como las mitocondrias, endosomas, y peroxisomas.

Imágenes en vivo del denso núcleo de vesículas en la Primaria neuronas del hipocampo cultivadas

Se describe un protocolo que permite imágenes de las mitocondrias en la vida neuronas a través de microscopía de fluorescencia durante largos períodos de tiempo. Imágenes durante períodos prolongados se lleva a cabo a través de lentivirus mediada por la expresión de una proteína mitocondrial, dirigida fluorescentes y el uso de una etapa de bajo costo-top incubadora que fue diseñado y construido en nuestro laboratorio.

La neuromodulación y mitocondrial de transporte: Imágenes en vivo en las neuronas del hipocampo durante largos períodos de tiempo

Este informe describe el uso de imágenes de células vivas y técnicas fotoblanquear para determinar la expresión en la superficie, las vías de transporte y la cinética de la trata de exógena expresó, sensible al pH las buenas prácticas agrarias de etiquetado proteínas en la membrana plasmática de las neuronas.

Difusión lateral y exocitosis de proteínas de membrana en neuronas cultivadas evaluó a través de la recuperación de fluorescencia y la pérdida de fluorescencia photobleaching

El transporte axonal de BDNF, un factor neurotrófico, es crítico para la supervivencia y la función de varias poblaciones neuronales. Algunos trastornos degenerativos están marcadas por disrupción de la estructura y la función axonal. Hemos demostrado las técnicas utilizadas para examinar el tráfico directo de QD-BDNF en las cámaras de microfluidos que utilizan las neuronas primarias.

Imágenes en tiempo real de Axonal Transporte de Quantum Dot-etiquetado BDNF en las neuronas primarias

Endocitosis de vesículas sinápticas se detectan por microscopia ligera de pHluorin fusionado con la proteína de la vesícula sináptica y por microscopia electrónica de la absorción de la vesícula.

Medición de endocitosis vesícula sináptica en neuronas Hippocampal cultivadas

Aquí se presenta un protocolo para investigar los efectos tempranos de la amiloide-β (Aß) en el cerebro.  Esto demuestra que Aβ induce la endocitosis mediada por clatrina y colapso de conos de crecimiento axonal. El protocolo es útil en el estudio de efectos tempranos de Aβ en conos de crecimiento axonal y puede facilitar la prevención de la enfermedad de Alzheimer.

Visualizar el colapso del cono de crecimiento Axonal y temprano efectos β amiloidea en las neuronas de ratón cultivadas

Aquí, se describe un protocolo para estudiar cuantitativamente el montaje y la estructura de los segmentos iniciales de axones (AIS) de las neuronas del hipocampo que carecen de AIS pre-montado debido a la ausencia de una anquiria gigante-G.

Uso De Las Neuronas Del Hipocampo Cultivadas Primarias Para Estudiar El Ensamblaje De Los Segmentos Iniciales Axón

Se describen dos métodos relacionados para visualizar los eventos subcelulares necesarios para la transmisión sináptica. Estos protocolos permiten el monitoreo en tiempo real de la dinámica de la afluencia de calcio presináptico y la fusión de la membrana de vesícula sináptica utilizando imágenes de células vivas de neuronas cultivadas in vitro .

Medición fluorescente en tiempo real de las funciones sinápticas en modelos de esclerosis lateral amiotrófica

Utilizando ratones fluorescentes transgénicos, se describen protocolos detallados para evaluar el transporte axonal in vivo de endosomas de señalización y mitocondrias dentro de los axones motores y sensoriales del nervio ciático intacto en animales vivos.

Ampliación del kit de herramientas para imágenes in vivo del transporte axonal

Presentamos aquí un protocolo sobre cómo preparar cultivos primarios de células gliales, astrocitos y microglía de cortezas de rata para imágenes de video de lapso de tiempo de Ca2+ intracelular para la investigación sobre fisiopatología de la esclerosis lateral amiotrófica en el modelo de rata hSOD1G93A .

Cultivos primarios de astrocitos de rata y microglia y su uso en el estudio de la esclerosis lateral amiotrófica

Aprende a medir los efectos de proteínas patológicas en el transporte axonal usando imágenes de células vivas en neuronas primarias del hipocampo. Este método ayuda a investigar los mecanismos de neurodegeneración.

Uso de imágenes de células vivas para medir los efectos de las proteínas patológicas en el transporte axonal en las neuronas primarias del hipocampo (Video) | JoVE Journal

Uso de imágenes de células vivas para medir los efectos de las proteínas patológicas en el transporte axonal en las neuronas primarias del hipocampo

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