Name: Un método sencillo, rápido y eficaz para el análisis de xenotrasplantes tumorales en embriones transparentes de pez cebra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-12T12:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Aprende un método rápido de xenotrasplante tumoral en embriones transparentes de pez cebra Danio rerio. Esta técnica utiliza citometría de flujo para evaluar la progresión tumoral y la carga de enfermedad en investigación oncológica.

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los NIH R37AI110985 y P30CA006927, una asignación de la Mancomunidad de Pensilvania, la Sociedad de Leucemia y Linfoma y el Fondo Bishop. Este estudio también contó con el apoyo de las instalaciones principales de Fox Chase, incluidas las instalaciones de cultivo celular, citometría de flujo y animales de laboratorio. Agradecemos a la Dra. Jennifer Rhodes por mantener las instalaciones de pez cebra y microinyección en FCCC.

Utilización de larvas de pez cebra para estudios tumorales in vivo eficientes

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Los autores declaran no tener intereses contrapuestos.

El xenotrasplante de pez cebra ha surgido como una alternativa rápida, robusta y rentable a los estudios con ratones12. Aunque se han descrito varios enfoques para el xenotrasplante de pez cebra, nuestra adaptación ha dado lugar a mejoras significativas. Además de estandarizar los parámetros en torno al procedimiento, estas mejoras se centran específicamente en acelerar la velocidad a la que se pueden realizar las inyecciones tumorales, lo que permite un aumento en el número de animales por grupo de estudio y el uso del etiquetado tumoral para monitorear la calidad de la inyección y el comportamiento posterior a la inyección. 
Si bien las mejoras a este método descritas aquí tienen un gran potencial, la ejecución exitosa de esta estrategia requerirá un profesional capacitado y optimización para la aplicación específica. Se emplearon células leucémicas. En consecuencia, el uso de cánceres sólidos puede traer desafíos adicionales. Estos tumores pueden ser propensos a la agregación, lo que crearía variabilidad en la administración del bolo celular; sin embargo, incluso en tales circunstancias, el etiquetado RFP debe permitir un control de calidad adecuado posterior a la inyección del bolo. Esto es superior al marcaje GFP o a los tintes verdes, que están oscurecidos por la autofluorescencia. Finalmente, la estandarización descrita aquí de la mayoría de los parámetros que afectan el éxito (salud del embrión, temperatura de la acuicultura, orificio de la aguja, presión de inyección, etcétera) minimiza la variabilidad de este proceso. 
Una consideración importante para los experimentos de xenotrasplante en pez cebra es el lugar de inyección. Aquí, hemos demostrado que las inyecciones en la yema son bastante fáciles en relación con otros sitios técnicamente más desafiantes, como el espacio perivitelina34, el conducto de Cuvier35 y la inyección intracardíaca (ventrículo cardíaco)36. La desventaja de la inyección de yema es que es un órgano vital para los embriones en crecimiento, por lo que se debe tener cuidado para garantizar que el diámetro y la presión de la aguja se controlen cuidadosamente para que el embrión no muera debido a un traumatismo por inyección. El enfoque descrito aquí mitiga esta preocupación al minimizar las lesiones y descartar cualquier lesión obvia o muerte por 1 ppp, ya que esos problemas no están relacionados con el crecimiento del tumor. La consideración final con respecto al sitio de inyección es que los distintos microambientes pueden tener una mayor o menor capacidad para apoyar la propagación de tumores xenotrasplantados. En consecuencia, tal vez las inyecciones de yema se puedan realizar primero antes de proceder a inyecciones ortotópicas más desafiantes. La principal ventaja de la inyección de yema es que no requiere una estadificación embrionaria precisa y, por lo tanto, permite una inyección más rápida de un mayor número de embriones, preservando así mejor su salud y aumentando el poder estadístico para resolver las diferencias en el comportamiento de las células tumorales trasplantadas.
El seguimiento de la progresión de la enfermedad después de la inyección se evalúa típicamente a través de los efectos sobre la supervivencia mediante el análisis de Kaplan-Meier37; Sin embargo, las pruebas de carga de enfermedad también pueden ser bastante informativas. En el caso de las células trasplantadas que permanecen en el lugar de la inyección, la carga tumoral puede cuantificarse utilizando diversos métodos de microscopía, siempre que el método de marcaje de las células tumorales no esté oscurecido por la autofluorescencia29. La tinción CM-Dil se resuelve fácilmente y no se ve afectada por la autofluorescencia, por lo que funciona bien para cuantificar la carga tumoral de las células localizadas. El desafío ocurre cuando las células tumorales no permanecen en el lugar de la inyección y se diseminan. En estos casos, la citometría de flujo, junto con el marcado genético indeleble mediante proteínas fluorescentes rojas, es una forma muy eficaz de controlar la carga de enfermedad en nidadas estandarizadas de embriones, ya que el tumor marcado puede analizarse mediante el uso de tinciones específicas de la especie diferentes a las células del pez cebra. Un defecto de CM-Dil es que se diluye por la división celular38. En consecuencia, la adaptación mediante el marcaje genético de los tumores mediante RFP o mCherry conlleva beneficios significativos. La expresión de mCherry, junto con un anticuerpo específico del tumor, permite la identificación segura de las células trasplantadas entre lo que puede ser un patrón complejo de señales de fondo proporcionadas por las células del pez cebra huésped. 
En conjunto, el enfoque optimizado de xenotrasplante de pez cebra y el método de análisis utilizados en este estudio proporcionan una mejora sustancial a una plataforma experimental ya poderosa.

El análisis del comportamiento de los tumores en respuesta a una alteración genética o al tratamiento farmacológico in vivo es un elemento esencial de la investigación del cáncer 1,2,3,4. En la mayoría de los casos, estos estudios implican el uso de modelos de ratón inmunocomprometidos (Mus musculus)5; Sin embargo, los estudios de xenotrasplantes en ratones son limitados en muchos aspectos, incluyendo la capacidad limitada, la duración prolongada, el gasto significativo y la necesidad de equipos de imagen sofisticados para monitorear la progresión de los tumores internos 6,7. Por el contrario, el modelo de pez cebra (Danio rerio) permite una mayor capacidad, menor duración, menor gasto y, debido a su transparencia, un seguimiento sencillo de la progresión de la enfermedad 8,9.
El pez cebra es un sistema modelo de vertebrados bien desarrollado con desarrollo ex-útero y alta fecundidad, con hembras individuales que producen más de 100 embriones10. Además, los embriones de pez cebra son transparentes, lo que permite una fácil visualización de los procesos de desarrollo utilizando técnicas relacionadas con la fluorescencia, como los reporteros. Finalmente, la conservación de los procesos críticos de desarrollo los convierte en un modelo ideal para muchos tipos de estudios, incluyendo el comportamiento de las células malignas trasplantadas11,12. Los embriones de pez cebra de tipo salvaje desarrollan melanocitos, que los vuelven ópticamente opacos a las 2 semanas de edad, pero esto se ha superado con la generación de embriones de casper (Roya9; mitfaw2), que permanecen transparentes a lo largo de la vida13. Debido a sus propiedades ópticas, el pez cebra casper es un receptor ideal de células tumorales trasplantadas 14,15,16. El xenotrasplante de células tumorales en pez cebra ha ganado importancia en las últimas 2 décadas 17,18,19,20,21. Los embriones de pez cebra tienen inmunidad innata; Sin embargo, carecen de inmunidad adaptativa durante su etapa larvaria, lo que los hace funcionalmente inmunocomprometidos, lo que les permite servir como huéspedes efectivos para xenoinjertos tumorales trasplantados22.
Se han desarrollado protocolos para el injerto tumoral en embriones de pez cebra y en adultos que han considerado una serie de variables diferentes 23,24,25,26,27. Estos han explorado numerosos sitios de depósito tumoral en el pez cebra, incluyendo inyecciones en la yema, el espacio perivitelino y el corazón y en diferentes etapas del desarrollo16,28. La temperatura ambiente de la acuicultura para los xenoinjertos de pez cebra también es importante, ya que la cría del pez cebra suele producirse a 28 °C, mientras que las células de los mamíferos crecen a 37 °C. En consecuencia, se debe emplear una temperatura de compromiso que sea tolerada por los peces pero que apoye el crecimiento tumoral, y 34 °C parece lograr ambos objetivos29. El análisis del comportamiento y la progresión de los tumores después de un xenotrasplante es otra área importante de interés, y esto implica el uso de una variedad de modalidades de imagen, así como el análisis de la supervivencia30. Una de las principales ventajas del modelo de pez cebra es la disponibilidad de un gran número de animales de estudio para proporcionar un inmenso poder estadístico a los estudios in vivo del comportamiento tumoral; Sin embargo, los enfoques anteriores han limitado severamente este potencial debido al requisito de tediosos procedimientos de montaje para las inyecciones.
Aquí, abordamos esta limitación a través del desarrollo de un método simple y rápido con el que organizar embriones que permite un alto rendimiento y monitoreo de la calidad de la inyección utilizando la línea transparente de pez cebra casper . Esto implica la inyección de xenoinjertos en el saco vitelino de los embriones de pez cebra casper a los 2 días después de la fertilización (dpf). Observamos la supervivencia de los embriones después del xenotrasplante como parte del análisis del comportamiento tumoral. Además, mostramos la evaluación de la carga de enfermedad tras el xenotrasplante mediante la realización de suspensiones unicelulares y el análisis mediante citometría de flujo (Figura 1).

<table><tbody><tr><td>1-fenil 2-tiourea (PTU)</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>colador de células de 70 micras</td><td>Corning&nbsp;</td><td>CLS431751-50EA</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de 90 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S43565</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Apex bioresearch</td><td>20-102GP</td><td></td></tr><tr><td>APC APC anti-ratón CD45.2 Anticuerpo</td><td>Biolegend</td><td>109814</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSymphony A5 Analizador de células</td><td>BD Biosciences</td><td>BD FACSymphony A5</td><td></td></tr><tr><td>capilares de calibración</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P1424-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Rastreador de células CM-dil tinte</td><td>Invitrogen</td><td>C7001</td><td></td></tr><tr><td>Collageanse IV</td><td>Gibco</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Dumont número 55</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Corning&nbsp;</td><td>35-015-CV</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia</td><td>Nikon</td><td>modelo SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de vidrio (borosilicato)</td><td>Instrumentos de precisión mundial</td><td>1B100-4</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Corning&nbsp;</td><td>21-023-CV</td><td></td></tr><tr><td>Helix NP Blue</td><td>Biolegend</td><td>425305</td><td></td></tr><tr><td>Instant Ocean Sal marina</td><td>Instant ocean</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio óptico</td><td>Nikon</td><td>modelo SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>Azul de metileno</td><td>Microcargador Sigma</td><td>M9140-100G</td><td></td></tr><tr><td>(puntas largas para células laoding)</td><td>eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>P1000 extractor de micropipetas</td><td>Sutter instruments</td><td>modelo P-97</td><td></td></tr><tr><td>PM 1000 microinyector</td><td>de células MicroData Instruments, Inc. (MDI)</td><td>PM1000</td><td></td></tr><tr><td>Metanosulfato de tricaína (Etilo 3-aminobenzoato metanosulfato)</td><td>Sigma</td><td>E10521-10G</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,5%), sin fenol rojo</td><td>Gibco</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>Dieta irradiada para adultos de pez cebra (alimento seco)</td><td>Zeigler</td><td>388763</td><td></td></tr></tbody></table>

un método sencillo, rápido y eficaz para el análisis de xenotrasplantes tumorales en embriones transparentes de pez cebra

A Simple, Rapid, and Effective Method for Tumor Xenotransplantation Analysis in Transparent Zebrafish Embryos

Los estudios in vivo del comportamiento tumoral son un elemento básico de la investigación del cáncer; Sin embargo, el uso de ratones presenta desafíos significativos en costo y tiempo. Aquí, presentamos larvas de pez cebra como un modelo de trasplante que tiene numerosas ventajas sobre los modelos murinos, incluida la facilidad de manejo, el bajo costo y la corta duración experimental. Además, la ausencia de un sistema inmune adaptativo durante las etapas larvales obvia la necesidad de generar y utilizar cepas inmunodeficientes. Si bien existen protocolos establecidos para el xenotrasplante en embriones de pez cebra, presentamos aquí un método mejorado que involucra la estadificación del embrión para una transferencia más rápida, el análisis de supervivencia y el uso de la citometría de flujo para evaluar la carga de la enfermedad. Los embriones se organizan en etapas para facilitar la inyección rápida de células en la yema de las larvas y el marcado celular para controlar la consistencia del bolo celular inyectado. Después de la inyección, se evalúa el análisis de supervivencia embrionaria hasta 7 días después de la inyección (ppp). Por último, también se evalúa la carga de enfermedad marcando las células transferidas con una proteína fluorescente y analizándolas mediante citometría de flujo. La citometría de flujo es posible gracias a un método estandarizado de preparación de suspensiones celulares de embriones de pez cebra, que también podría usarse para establecer el cultivo primario de células de pez cebra. En resumen, el procedimiento descrito aquí permite una evaluación más rápida del comportamiento de las células tumorales in vivo con un mayor número de animales por brazo de estudio y de una manera más rentable.

Xenotrasplante En la Figura 1 se muestra una visión completa de todo el experimento y el análisis, que abarca desde la producción de embriones hasta la evaluación de la progresión de la enfermedad mediante el análisis de la supervivencia y la carga de enfermedad mediante citometría de flujo. Este enfoque aporta varias mejoras que mejoran la reproducibilidad y la escalabilidad de los xenotrasplantes, además de añadir una nueva forma de evaluar la carga de la enfermedad. El éxito de estos experimentos depende en gran medida de la salud de las células trasplantadas, ya que las células que no están sanas y están en fase logarítmica no se propagan tras el trasplante. La duración de la sesión de inyección también es un parámetro crítico. Después de preparar las células tumorales, es fundamental completar la inyección en el pez cebra dentro de las 3-4 horas. El enfoque utilizado en este estudio permite inyectar un mayor número de embriones durante este período de tiempo mediante la simple modificación de colocarlos directamente de lado en una placa de agarosa e inyectarlos en la yema (Figura 2C, D). Además, es imperativo que se seleccione el orificio óptimo de la aguja para que se inyecten suficientes células (400-600 células) pero que el orificio no sea tan grande como para dañar los embriones. Otra consideración es la presión de inyección. Encontramos que presiones superiores a 12-13 psi alteran la yema de los embriones, causando la muerte. Por último, otra variabilidad inherente a este procedimiento es la consistencia de la inyección. Las células que se van a inyectar se depositan en el extremo de la aguja de inyección, lo que dificulta el control preciso en el bolo de inyección. Cuando las células son xenotrasplantadas, todos los embriones tienen el potencial de recibir el mismo bolo de inyección, pero en la práctica, no lo hacen (Figura 3). El número de células transferidas puede diferir ampliamente según el comportamiento de las células tumorales (por ejemplo, aglomeración) y el nivel de habilidad del operador. Hemos abordado esta incertidumbre a través de la tinción CM-Dil/etiquetado mCherry, que permite la categorización posterior a la inyección de los animales que han recibido un bolo celular apropiado y consistente, así como de aquellos que reciben un bolo inferior. La tinción con CM-Dil, pero de forma más eficaz con una proteína fluorescente, tiene la ventaja añadida de facilitar el seguimiento de la progresión de la enfermedad, ya sea por microscopía o por citometría de flujo (Figura 4 y Figura 5).
Análisis del comportamiento tumoral La progresión tumoral se puede monitorizar fácilmente mediante microscopía de fluorescencia simple centrada en la RFP (Figura 4A). Del mismo modo, el monitoreo tradicional de la supervivencia se puede realizar mediante análisis de Kaplan-Meier (Log-rank y prueba de Wilcoxon) (Figura 4B). Sorprendentemente, en contraste con los estudios de xenotrasplante basados en ratones, en los que normalmente hay entre 8 y 10 animales por grupo de estudio, utilizando el método del pez cebra descrito aquí, no es difícil lograr grupos de estudio con más de 60 animales cada uno (Figura 4B). Esto mejora notablemente el poder de resolución de los estudios in vivo. Por último, hemos implementado otro enfoque para el análisis de la carga de enfermedad mediante citometría de flujo. Esto implica la interrupción de un número equivalente de embriones y el análisis del contenido de células tumorales de la suspensión unicelular resultante mediante citometría de flujo. Mediante la combinación de un marcador de superficie celular específico del tumor con el indicador de proteína fluorescente, los ratones/células humanas xenotrasplantadas pueden identificarse con confianza mediante citometría de flujo como enfoque para evaluar la carga de la enfermedad (Figura 5). Para este propósito, las proteínas fluorescentes rojas son superiores, ya que las proteínas fluorescentes verdes no lograron proporcionar una señal sobre la autofluorescencia de las células de pez cebra huésped. En este caso, se empleó mCherry para el marcaje y el seguimiento de células durante el curso del xenotrasplante para el análisis de FACS junto con CD45. El doble marcaje nos permitió medir las diferencias en la carga tumoral entre la inoculación en bolo buena frente a la incorrecta (Figura 5B,C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66164/66164fig01.jpg"> Figura 1: Esquema de todos los procedimientos de xenotrasplante y análisis post-inyección. (A) Se esquematiza la configuración de la cría, la recolección de embriones y la morfología 2 días después de la fertilización (dpf). (B) Preparación, tinción e inyecciones de células leucémicas para xenotrasplante en la yema de embriones de pez cebra. (C) Análisis post-xenotrasplante, incluyendo supervivencia y citometría de flujo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66164/66164fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66164/66164fig02.jpg"> Figura 2: Imágenes representativas de las herramientas utilizadas para las inyecciones. (A) Agujas extraídas en una placa de Petri. (B) La placa de agarosa para la estadificación de los embriones. (C,D) Una placa que muestra los embriones escalonados (diagrama representativo en el panel C y los embriones reales (encerrados en rojo) en el panel D) para inyecciones en la placa de carga embrionaria. El recuadro en la esquina inferior derecha del panel D muestra una vista de mayor aumento de los embriones en etapas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66164/66164fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66164/66164fig03.jpg"> Figura 3: Imágenes representativas de embriones xenotrasplantados. Se muestran imágenes de campo claro e inmunofluorescentes de células positivas para la tinción CM-Dil (rojo) en la yema de los embriones de casper a 1 ppp (imagen de nidada). Los embriones con un bolo inferior se indican con una flecha amarilla, mientras que los que tienen una morfología alterada se indican con un asterisco. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66164/66164fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66164/66164fig04.jpg"> Figura 4: Evaluación de la progresión de la enfermedad mediante imágenes de fluorescencia y análisis de supervivencia. (A) Imagen representativa de embriones xenotrasplantados a 4 ppp y 7 ppp. (B) El diagrama de Kaplan Meier que muestra el análisis de supervivencia de embriones con dos líneas de leucemia genéticamente distintas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66164/66164fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66164/66164fig05.jpg"> Figura 5: Análisis citométrico de flujo de la carga de enfermedad en pez cebra xenotrasplantado. (A) Representación esquemática de la preparación de la suspensión celular y análisis de citometría de flujo. En resumen, los embriones a 4 dpi se desagregan en suspensiones unicelulares utilizando tripsina y colagenasa, seguidas de citometría de flujo. (B) Gráficos representativos para el análisis de citometría de flujo donde la imagen de la izquierda en cada panel es el gráfico FSC-A v/s SSC-A y la imagen de la derecha es CD45 v/s señales mCherry. (C) Gráfico de barras que muestra las estadísticas celulares para células xenotrasplantadas obtenidas de la parcela CD45 v/s mCherry para embriones no inyectados, buenos e inferiores (n = 45, 40 y 40 para cada réplica (n = 3); valor p * ≤ 0.05, calculado utilizando la prueba t no apareada con la corrección de Welch en GraphPad Prism 9). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66164/66164fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Describimos un protocolo para el xenotrasplante en la yema de embriones transparentes de pez cebra que se optimiza mediante un método de estadificación simple y rápido. Los análisis posteriores a la inyección incluyen la supervivencia y la evaluación de la carga de enfermedad de las células xenotrasplantadas mediante citometría de flujo.

Un método sencillo, rápido y eficaz para el análisis de xenotrasplantes tumorales en embriones transparentes de pez cebra

In vivo studies of tumor behavior are a staple of cancer research; however, the use of mice presents significant challenges in cost and time. Here, we ...

Buscamos obtener información molecular sobre el control de la hematopoyesis normal y maligna y luego explotar esos conocimientos para desarrollar nuevas terapias para el tratamiento de los cánceres de la sangre. Los xenoinjertos tumorales son una herramienta indispensable para evaluar el impacto de una alteración genética o tratamiento en el comportamiento tumoral. Sin embargo, los xenoinjertos de ratones son caros, requieren mucho tiempo y tienen un alcance limitado.El uso del pez cebra para el xenotrasplante de tumores supera todos estos inconvenientes. En este protocolo, demostramos un proceso de montaje fácil y rápido para el xenotrasplante, lo que aumenta el rendimiento. Además, empleamos la tinción celular para conocer la calidad del inóculo y luego la citometría de flujo para evaluar la progresión del tumor mediante la evaluación o cuantificación de la carga de la enfermedad.Tenemos la intención de utilizar este enfoque para identificar nuevas formas de bloquear la función de la cascada de quinasas Ras/MAP, que impulsa la gran mayoría de los cánceres humanos. Y lo haremos no tratando de bloquear la actividad catalítica de la cascada de quinasas Ras/MAP, sino evitando su capacidad para fosforilar los sustratos cancerígenos que modifica.

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Investigación

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Cancer Research

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