Name: Efecto antagónico de Jiawei Shengjiang San en un modelo de rata de nefropatía diabética: relacionado con la vía de señalización EGFR/MAPK3/1 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-10T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Aprenda a utilizar farmacología de redes y acoplamiento molecular para investigar los componentes activos de Jiawei Shengjiang San en ratas con nefropatía diabética. Este método acelera la predicción de eficacia terapéutica.

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<meta charset="utf8"></head><body>Jiawei Shengjiang San abordará la nefropatía diabética mediante la farmacología de red

<table><tbody><tr><td>2&veces; SYBR Verde qPCR Master Mix&nbsp;</td><td>Servicebio, Wuhan, China</td><td>G3320-05</td><td></td></tr><tr><td>Cuantificación de proteínas en orina de 24 horas (UTP)</td><td>Instituto de Ingeniería Biológica de Nanjing Jiancheng</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>3,3'-diaminobenzidina</td><td>Shanghai Huzheng Biotech, China</td><td>91-95-2</td><td></td></tr><tr><td>Instrumento automático de análisis bioquímico</td><td>Hitachi, Japón</td><td>7170A</td><td></td></tr><tr><td>Etanol anhidro</td><td>Biosharp, Tianjin, China</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>BAX Anticuerpos primarios&nbsp;</td><td>Affinity, USA</td><td>AF0120</td><td>Rata</td></tr><tr><td>BCL-2 Anticuerpos primarios&nbsp;</td><td>Affinity, EE. UU.</td><td>AF6139</td><td></td></tr><tr><td>Rata BX53 Microscopio</td><td>Olympus, Japón</td><td>BX53</td><td></td></tr><tr><td>Sustituto del cloroformo</td><td>ECOTOP, Guangzhou, China</td><td>ES-8522</td><td></td></tr><tr><td>Desmond software&nbsp;</td><td>Nueva York, NY, EE. UU.</td><td>Lanzamiento 2019-1</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua digital a temperatura constante</td><td>Changzhou Jintan Liangyou Instrument, China</td><td>DK-8D</td><td></td></tr><tr><td>EGFR Anticuerpos primarios&nbsp;</td><td>Affinity, EE. UU.</td><td>AF6043</td><td>Rat</td></tr><tr><td>Embed-812 RESIN</td><td>Shell Chemical, EE. UU</td>. <td>14900</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa en sangre en ayunas (FBG)</td><td>Nanjing Jiancheng Instituto de Ingeniería Biológica N</td><td>/A</td><td></td></tr><tr><td>FC Analizador de etiquetas enzimáticas de longitud de onda completa</td><td>Multiskan; Termo, EE. UU.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH&nbsp; Anticuerpos primarios&nbsp;</td><td>Affinity, EE. UU.</td><td>AF7021</td><td></td></tr><tr><td>Proteína sérica glicosilada para ratas (GSP)</td><td>Instituto de Ingeniería Biológica de Nanjing Jiancheng</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio electrónico de transmisión</td><td>Hitachi, Japón</td><td>H-7650</td><td></td></tr><tr><td>Solución de tinción de hematoxilina/eosina (HE)</td><td>Servicebio, EE. UU.</td><td>G1003</td><td></td></tr><tr><td>Image-Pro Plus</td><td>MEDIA CYBERNETICS, EE. UU.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Instrumento de amplificación de PCR en tiempo real</td><td>Applied Biosystems, EE. UU</td><td>. iQ5&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tabletas de irbesartán</td><td>Hangzhou Sanofi Pharmaceuticals</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Biosharp, Tianjin, China</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Gránulos JWSJS</td><td>Guangdong Yifang Pharmaceutical</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Kodak Image Station 2000 MM sistema de imagen</td><td>Kodak, EE. UU</td>. <td>IS2000</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol de baja densidad (LDL-C)</td><td>Instituto de Ingeniería Biológica de Nanjing Jiancheng</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MAPK3/1Anticuerpos primarios&nbsp;</td><td>Afinidad, EE. UU.</td><td>AF0155</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga médica</td> de rata <td>Desarrollo de instrumentos de laboratorio de Hunan Xiangyi, China &nbsp;</td><td>TGL-16K</td><td></td></tr><tr><td>Mini sistema de transferencia trans-blot</td><td>Bio-Rad, EE. UU</td>. <td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de electroforesis mini-PROTEAN</td><td>Bio-Rad, EE. UU</td>. N<td>/A</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro NanoVue Plus</td><td>Healthcare Bio-Sciences AB, Suecia</td><td>111765</td><td></td></tr><tr><td>p-EGFR Anticuerpos primarios&nbsp;</td><td>Affinity, EE. UU</td>. <td>AF3044</td><td></td></tr><tr><td>Solución de tinción de ácido peryódico-Schiff (PAS) para ratas</td><td>Servicebio, EE. UU</td>. <td>G1008</td><td></td></tr><tr><td>p-MAPK3/1 Anticuerpos primarios&nbsp;</td><td>Afinidad, EE. UU</td>. <td>AF1015</td> Anticuerpos secundarios <td>para ratas</td></tr><tr><td></td><td>&nbsp; Santa Cruz, EE. UU.</td><td>SC-2357</td><td></td></tr><tr><td>Estreptozotocina</td><td>de conejo Sigma, EE. UU.</td><td>S0130</td><td></td></tr><tr><td>Kit de síntesis de ADNc de primera cadena</td><td>SureScript GeneCopeia, EE. UU.</td><td>QP056T</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo TriQuick</td><td>Solarbio, Pekín, China</td> Banco de trabajo ultralimpio <td>R1100</td><td></td></tr><tr><td>Equipo de</td><td>purificación de Suzhou, China</td><td>SW-CJ-1F &nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

efecto antagónico de jiawei shengjiang san en un modelo de rata de nefropatía diabética: relacionado con la vía de señalización egfr/mapk3/1

Antagonistic Effect of Jiawei Shengjiang San on a Rat Model of Diabetic Nephropathy: Related to EGFR/MAPK3/1 Signaling Pathway

Siguiendo el protocolo, finalmente se obtuvieron 90 ingredientes activos de JWSJS del análisis después del cribado y la deduplicación de acuerdo con los estándares establecidos de OB y DL. Estos incluían 20 tipos de Hedysarum Multijugum Maxim, 23 tipos de Epimrdii Herba, 15 tipos de Smilacis Glabrae Rhixoma, 16 tipos de Radix Rhei et Rhizome, cuatro tipos de Curcumaelongae Rhizoma, 15 tipos de Cicadae Periostracum y seis tipos de componentes de Bombyx Batryticatus . Debido a que hay muchos ingredientes activos en JWSJS, solo se enumeran 20 (consulte la Tabla 1). Tras la deduplicación, se obtuvieron finalmente 396 dianas correspondientes a los principios activos de JWSJS.
Después de buscar genes relacionados con enfermedades, finalmente se obtuvieron 3035 genes diana relacionados con DN después de fusionarlos y deduplicarlos. Las dianas correspondientes de DN se compararon y analizaron con las dianas de los principios activos de los fármacos. Se determinó la intersección, lo que dio como resultado 227 objetivos de intersección de JWSJS y DN. A continuación, se dibujó un diagrama de Wayne (véase la Figura 1A). El diagrama de red "fármaco-ingrediente-objetivo" se construyó utilizando el software Cytoscape 3.8.0 (ver Figura 1B), y se realizó un análisis topológico. Cada nodo se clasificó de mayor a menor según el valor del grado. Los cinco componentes principales del fármaco fueron quercetina, ácido palmitoleico, luteolina, kaempferol y naringenina, y los cinco objetivos principales fueron PTGS2, PTGS1, NCoA2, AR y ESR1.
A continuación, se desarrolló una red PPI para los objetivos de intersección JWSJS y DN (196 nodos y 1714 bordes con un valor medio de grados de 17,4). Además, se obtuvieron siete dianas clave que pueden ser las dianas clave de JWSJS para el tratamiento de la DN después de tres cribados: MAPK14, TP53, MAPK3, MYC, HIF1A, ESR1 y MAPK1 (véase la figura 1C).
A continuación, se realizó un análisis de enriquecimiento de GO para especular sobre las características biológicas de la diana del JWSJS en el tratamiento de la DN. Entre BP, CC y MF, las diez entradas enriquecidas principales se representan en la Figura 1D. Los resultados muestran que JWSJS podría regular la proliferación, diferenciación y apoptosis celular mediante la unión con factores de transcripción y proteínas quinasas en balsas de membrana y microdominios de membrana, lo que resulta en un efecto terapéutico sobre la DN. Se realizó un análisis de enriquecimiento de la vía KEGG en las dianas participantes para explorar las posibles vías de acción de JWSJS en la DN. Las treinta vías más enriquecidas se trazan en la Figura 1E. Los resultados muestran que el tratamiento con JWSJS de DN podría actuar sobre 181 vías de señalización, principalmente relacionadas con los lípidos y la aterosclerosis, la vía de señalización PI3K-Akt, la carcinogénesis química, la hepatitis, el cáncer de próstata, la apoptosis, la vía de señalización HIF-1 y la vía de señalización TNF.
Para explorar más a fondo los objetivos de las primeras 30 vías enriquecidas con KEGG, utilizamos el software Cytoscape 3.8.0 para construir un mapa de red de relaciones de vías de señalización KEGG para DN tratados con JWSJS. Se descubrió que MAPK1, MAPK3, EGFR y AKT1 son objetivos de múltiples vías que actúan juntas (ver Figura 1F), lo que sugiere que estas proteínas pueden desempeñar un papel central en la mediación de los efectos de JWSJS en DN.
Para validar aún más los objetivos potenciales de JWSJS en el tratamiento de DN, a continuación seleccionamos tres objetivos clave, MAPK1, MAPK3 y EGFR, con valores de alto grado en la red PPI y la red de vías de señalización KEGG. Estos se acoplaron molecularmente con quercetina, ácido palmitoleico y luteolina, los tres componentes principales del núcleo de JWSJS para el tratamiento de DN. Las condiciones para el cribado de PDB ID son las siguientes: (1) Ser derivado de seres humanos; (2) Resolución conformacional ≤ 2,5 Å, es decir, lo más pequeña posible; (3) La secuencia conformacional debe ser lo más completa posible, es decir, el complejo estructural debe tener información de ligando de molécula pequeña; y (4) el valor del pH cristalino debe estar lo más cerca posible del rango fisiológico normal del cuerpo humano35. Por último, los ID de PDB de MAPK1, MAPK3 y EGFR fueron 4QTA, 4QTB y 7JXQ.
Para verificar la fiabilidad del software AutoDock en el sistema de acoplamiento en este estudio36, primero reacoplamos las tres proteínas de MAPK1, Mapk3 y EGFR. La conformación del ligando en la estructura cristalina original de las tres proteínas diana se superpuso con los ligandos después del acoplamiento (Figura 2A). A continuación, se calcularon los valores de la desviación cuadrática media (RMSD) entre la conformación del ligando después del acoplamiento y la estructura cristalina original. Los valores de RMSD fueron 1,129, 1,201 y 1,877 Å, respectivamente, todos ≤ 2Å. Esto demostró que el método de acoplamiento era fiable y podía utilizarse para la próxima verificación de acoplamiento molecular. Para comparar y declarar el potencial inhibitorio de los componentes principales, se utilizaron los ligandos originales de MAPK1, MAPK3 y EGFR como controles. El análisis de acoplamiento predijo con éxito la energía de unión entre la luteolina, el ácido palmitoleico y la quercetina y los tres objetivos principales. Todos ellos fueron negativos e inferiores a -637; véase la Tabla 2. Cabe destacar que el acoplamiento molecular entre luteolina y MAPK1 tiene el tamaño de cavidad más alto y la energía de enlace más baja. En general, los resultados del acoplamiento molecular mostraron que la luteolina, el ácido palmitoleico y la quercetina tenían una buena actividad de unión con tres objetivos principales (Figura 2B, C).
El RMSD se utiliza para cuantificar los cambios de desplazamiento promedio de un grupo seleccionado de átomos en relación con un marco de referencia. Mientras tanto, el RMSF caracteriza eficazmente las alteraciones localizadas a lo largo de la cadena de proteínas. El gráfico RMSD (Figura 2D) muestra que los valores de RMSD del complejo compuesto luteolina-MAPK1 y del complejo quercetina-MAPK3 se estabilizaron dentro de 5 ns. El complejo luteolina-EGFR mostró una RMSD fluctuante que osciló entre 0 y 35 ns; este valor se estabilizó en 35 ns hasta el final de la simulación MD de 100 ns. Todos los complejos interactuaron de manera estable al final de la simulación MD de 100 ns. El valor de RMSF se evaluó a partir de la trayectoria de simulación de MD: los átomos en el sitio activo y la cadena principal que fluctuaban mínimamente implicaban un cambio conformacional mínimo, lo que sugiere que el compuesto principal mencionado está firmemente anclado dentro de la cavidad del bolsillo de unión de la proteína objetivo. Los resultados de la RMSF mostraron fluctuaciones limitadas en las estructuras complejas.
Finalmente, verificamos los resultados anteriores in vivo. Primero observamos que el peso de las ratas en el grupo modelo disminuyó significativamente, y GSP, LDL-C, UTP y FBG aumentaron significativamente (P &lt; 0,05). El peso corporal de las ratas aumentó significativamente en el grupo de irbesartán y en cada grupo de JWSJS en comparación con el grupo modelo. GSP, LDL-C, UTP y FBG disminuyeron en diferentes grados (P &lt; 0,05; ver Tabla 3).
Luego, la tinción HE mostró que los glomérulos del grupo normal tenían un tamaño normal. Eran regulares y de estructura clara y tenían una membrana basal lisa, túbulos renales cuidadosamente dispuestos y sin infiltración de células inflamatorias. En el grupo modelo, los glomérulos eran hipertróficos, la membrana basal estaba engrosada y la matriz mesangial estaba aumentada. El intersticio estaba infiltrado con células inflamatorias. Las manifestaciones patológicas de cada grupo de administración se aliviaron en diferente medida en comparación con el grupo modelo (ver Figura 3A).
La tinción con PAS mostró que el grupo modelo tenía un aumento de los volúmenes glomerulares, un engrosamiento de la membrana basal y un aumento de la matriz mesangial en comparación con el grupo normal. Estas manifestaciones patológicas se aliviaron significativamente con cada grupo de administración (ver Figura 3B). Usando microscopía electrónica de transmisión, encontramos que la membrana basal glomerular en el grupo modelo estaba engrosada en comparación con el grupo normal. La matriz mesangial creció y los procesos del pie podocitario se fusionaron ampliamente. Las manifestaciones microscópicas de las ratas en cada grupo de administración se aliviaron en diversos grados en comparación con el grupo modelo (ver Figura 3C).
Finalmente, se detectaron las expresiones de EGFR total, p-EGFR, MAPK3/1 y p-MAPK3/1 para ver si cambiaban en las ratas DN tratadas con JWSJS. No hubo cambios significativos en la expresión total de EGFR y MAPK3/1 en los grupos modelo en comparación con el grupo normal. La expresión de p-EGFR, p-MAPK3/1 y BAX aumentó significativamente, y la expresión de BCL-2 disminuyó significativamente. En comparación con el grupo modelo, la expresión de p-EGFR, p-MAPK3/1 y BAX se redujo significativamente, y la expresión de BCL-2 se reguló significativamente al alza en diversos grados en los tejidos renales de rata en cada grupo de dosificación (Figura 3D,E). Este resultado fue confirmado por inmunohistoquímica (Figura 3F,G). Este estudio demostró que JWSJS podía proteger los riñones en ratas DN mediante la regulación de la expresión de las proteínas p-EGFR, p-MAPK3/1, BAX y BCL-2 y la reducción de la apoptosis celular. Además, se utilizó qPCR para evaluar los niveles de expresión de MAPK3, MAPK1 y ARNm de EGFR en varios grupos. Los resultados revelaron que la expresión relativa en el grupo DN fue significativamente mayor en comparación con el grupo control, así como con los grupos Irbesartan, JWSJS-L, JWSJS-M y JWSJS-H. Este hallazgo corrobora aún más los resultados iniciales (Figura 3H).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66179/66179fig01.jpg"> Figura 1: Network Pharmacology aclaró los posibles objetivos y vías de señalización del JWSJS en la nefropatía diabética. (A) Diagrama de Venn de los objetivos que se cruzan entre el JWSJS y la nefropatía diabética. El verde representa el número de dianas terapéuticas de los componentes de la JWSJS, y el morado representa el número de dianas relevantes de la DN. La parte de intersección representa el número de objetivos que se intersectan (es decir, el número de objetivos de JWSJS para DN). (B) Diagrama de red "Fármaco-ingrediente-objetivo" de JWSJS en el tratamiento de la DN. El azul claro representa los objetivos relevantes de JWSJS para el tratamiento de la DN. El fucsia representa el principio activo de Bombyx Batryticatus. El verde representa los ingredientes activos de Hedysarum Multijugum Maxim. El azul oscuro representa los ingredientes activos de Radix Rhei et Rhizome. El rojo representa los ingredientes activos de Cicadae Periostracum. El morado representa los ingredientes activos de Epimrdii Herba. El amarillo representa los ingredientes activos del rixinoma Smilacis Glabrae. El azul cielo representa los ingredientes activos del rizoma Curcumaelongae. (C) Red PPI de objetivos de intersección JWSJS y DN. (D) Los 10 genes más significativos identificados a través del análisis ontológico de los genes diana de la terapia implicados en el tratamiento de la DN con el JWSJS. (E) Los 30 genes más significativos identificados a través del análisis de la vía de los genes diana de la terapia implicados en el tratamiento de la DN con el JWSJS. (F) La red de relaciones de la vía de señalización KEGG en el tratamiento de la DN por el JWSJS. Los iconos amarillos representan vías de señalización. Los iconos azules representan los objetivos de acción. Un gráfico más grande implica que hay más vías conectadas a él. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66179/66179fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66179/66179fig02.jpg"> Figura 2: Visualización del acoplamiento molecular y las trayectorias de dinámica molecular de JWSJS en el tratamiento de la nefropatía diabética. (A) Las conformaciones del ligando en la estructura cristalina original de los tres complejos de proteínas diana 7JXQ (a), 4QTA (b) y 4QTB (c) se comparan con las conformaciones del ligando después del acoplamiento. El verde, el naranja y el rosa son proteínas diana EGFR, MAPK1 y MAPK3, respectivamente. El oro es la molécula de ligando original y el azul es la molécula de ligando después del acoplamiento. (B) Visualización de acoplamiento molecular en 3D de JWSJS en el tratamiento de la nefropatía diabética. El verde, el naranja y el rosa son las proteínas diana 7JXQ, 4QTA y 4QTB, respectivamente. 1a-3a representa el diagrama de interacción de 7JXQ, 4QTA y 4QTB con el inhibidor original (azul). 1b-3b representa el diagrama de interacción de 7JXQ, 4QTA, 4QTB y luteolina (amarillo). 1c-3c representa el diagrama de interacción de 7JXQ, 4QTA, 4QTB y ácido palmitoleico (fucsia). 1d-3d representa el diagrama de interacción de 7JXQ, 4QTA, 4QTB y quercetina (púrpura). (C) Visualización de acoplamiento molecular en 2D de JWSJS en el tratamiento de la nefropatía diabética. 1a-3a representa el diagrama de interacción de 7JXQ, 4QTA y 4QTB con el inhibidor original. 1b-3b representa el diagrama de interacción de 7JXQ, 4QTA, 4QTB y luteolina. 1c-3c representa el diagrama de interacción de 7JXQ, 4QTA, 4QTB y ácido palmitoleico. 1d-3d representa el diagrama de interacción de 7JXQ, 4QTA, 4QTB y quercetina. (D) Análisis RMSD y RMSF de las trayectorias de dinámica molecular de (a) luteolina y proteína diana 7JXQ, (b) luteolina y proteína diana 4QTA, y (c) quercetina y complejos de proteínas diana 4QTB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66179/66179fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66179/66179fig03.jpg"> Figura 3: JWSJS alivia la lesión renal y suprime la activación de la vía de señalización EGFR/MAPK3/1 en experimentos in vivo . (A) tinción de HE y (B) tinción de ácido peryódico-Schiff (PAS) de tejidos renales de rata en diferentes grupos (Magnificación, 200x; n = 10). (C) Microscopía electrónica de transmisión de tejido renal en diferentes grupos de ratas (Magnificación, 5000x; n = 3). (D) EGFR, p-EGFR, MAPK3/1, p-MAPK3/1, BAX y BCL-2 en tejido renal de rata diabético a través de Western blot (n = 3). (E) Análisis estadístico de la expresión de p-EGFR, p-MAPK3/1, BAX y BCL-2. (F) Análisis inmunohistoquímico de la expresión de p-EGFR Y p-MAPK3/1 en los seis grupos (n = 6). (G) Análisis estadístico de la expresión de p-EGFR Y p-MAPK3/1. (H) Análisis de qPCR de la expresión de ARNm de MAPK3, MAPK1 y EGFR en seis grupos. *P &lt; 0,05 frente al control. **P &lt; 0,01 frente al control. ▲P &lt; 0.05 vs. DN. ▲▲P &lt; 0.01 vs. DN. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66179/66179fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tabla 1: Información de algunos principios activos de JWSJS. Proporciona detalles sobre cada componente y sus características o propiedades. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66179/Table%201.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Tabla 2: Tabla de resultados de acoplamiento de los objetivos principales y los principales ingredientes activos de JWSJS. La tabla presenta los resultados de los estudios de acoplamiento de los objetivos principales y los principales componentes activos de JWSJS. Esta tabla muestra cómo estos componentes interactúan con sus respectivos objetivos, lo que puede proporcionar información sobre el mecanismo de acción de JWSJS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66179/Table%202.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Tabla 3: Efecto del JWSJS sobre el peso corporal y los índices bioquímicos en ratas con nefropatía diabética (expresado como media ± desviación estándar, n = 10). En comparación con el grupo normal: * P &lt; 0,05. En comparación con el grupo de modelos: # P &lt; 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66179/Table%203.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>

Efecto antagónico de Jiawei Shengjiang San en un modelo de rata de nefropatía diabética: relacionado con la vía de señalización EGFR/MAPK3/1

We aimed to delve into the mechanisms underpinning Jiawei Shengjiang San's (JWSJS) action in treating diabetic nephropathy and deploying network ...

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