Name: Modelo murino de pinzamiento del hiliar pulmonar izquierdo de lesión por isquemia pulmonar y reperfusión (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-12T13:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Aprende el modelo de pinzamiento del hiliar pulmonar izquierdo en ratones para estudiar lesión por isquemia y reperfusión. Este método permite analizar el papel de neutrófilos y células B en el daño pulmonar.

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Modelo murino para el estudio de la lesión por isquemia-reperfusión pulmonar

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Los autores no informan de ninguna divulgación relevante.

Describimos una técnica de pinzamiento hiliar que consiste en la aplicación de un nudo corredizo en el hilio izquierdo que ocluye la arteria pulmonar y las venas y bronquios para inducir isquemia caliente seguida de reperfusión. Después del pinzamiento hiliar, se puede extraer el pulmón izquierdo para una variedad de técnicas experimentales como histología, citometría de flujo, secuenciación masiva o de una sola célula y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa. Además, la sangre y el bazo pueden utilizarse para estudiar los efectos sistémicos, mientras que el pulmón derecho no isquémico puede servir como control interno. En este protocolo, también describimos métodos detallados para obtener mediciones de ABG y/o determinar la extravasación celular.
La técnica de pinzamiento hiliar murino es fundamental para el estudio de la IRI pulmonar y para el campo más amplio del trasplante pulmonar. Por ejemplo, utilizando este modelo de pinza hiliar, nuestro grupo descubrió que los monocitos clásicos CCR2+ derivados del bazo median la extravasación de neutrófilos al pulmón después de IRI18. Otro grupo demostró que las células epiteliales alveolares tipo II producen CXCL1 (un quimioatrayente de neutrófilos) de una manera dependiente de la NADPH oxidasa-IL-17-TNFα utilizando un modelo de pinza hiliar19. Se encontró que TLR4 desempeña un papel en el desarrollo de edema en un modelo murino de pinzamiento hiliar20.
Si bien el trasplante ortotópico de pulmón murino es más aplicable clínicamente y puede simular isquemia tanto caliente como fría, también introduce trauma quirúrgico por anastomosis vasculares y bronquiales y estímulos alogénicos por incompatibilidad donante-receptor. Por lo tanto, la principal ventaja de la técnica de pinzamiento hiliar es su capacidad para aislar los efectos de la IRI pulmonar de estos otros factores. Además, para el microcirujano de ratón sin experiencia, el procedimiento de pinza hiliar es técnicamente menos exigente y se puede dominar más rápidamente en comparación con el trasplante de pulmón. Una limitación del modelo de pinza hiliar es que la isquemia fría es difícil de lograr. La isquemia fría in situ se ha realizado en cerdos con perfusión al ras anterógrada a través de la arteria pulmonar izquierda25, sin embargo, esto es mucho más desafiante en el ratón debido a su menor tamaño y la necesidad de mantener la normotermia durante la cirugía. Sin embargo, el estudio de la isquemia caliente aislada es importante, ya que generalmente es más deletérea para la función orgánica que la isquemia fría 4,5,6. Además, los centros de trasplante están adoptando cada vez más los trasplantes de pulmón con DCD, que se acompañan de tiempos isquémicos cálidos mucho más largos que los trasplantes de pulmón con DBD tradicionales7. Por lo tanto, el estudio detallado de los eventos durante la isquemia caliente y el posterior período de reperfusión es crítico y se puede lograr con este modelo de pinza hiliare.
En las últimas dos décadas se han creado muchas variaciones de la técnica de pinzamiento hiliare. Estos incluyen el uso de una pinza microvascular atraumática 8,9,10,11,12,13, un torniquete de Rumel 14,15 y una corbata con un nudo corredizo alrededor del hilio16. Describimos nuestra adaptación de la técnica del nudo corredizo en ratones. La principal ventaja que tiene esta técnica sobre otras técnicas de pinzamiento hiliar es que permite el cierre del tórax durante el período de isquemia, lo que minimiza las pérdidas insensibles de líquido, particularmente en protocolos con períodos más largos de isquemia. Esto no se puede lograr cuando se coloca una pinza o un torniquete en el hilio.
En cuanto a la selección de animales, se optó por desarrollar este modelo en ratón en lugar de en ratas o modelos de animales grandes, como el cerdo. El razonamiento es doble: nuestro laboratorio tiene una amplia experiencia en microcirugía de ratón con trasplante ortotópico de pulmón de ratón17. En segundo lugar, si bien los ratones son más pequeños y técnicamente más difíciles de operar que las ratas, actualmente hay más cepas de ratones transgénicos disponibles comercialmente que cepas de ratas26,27. Los ratones también se reproducen más rápidamente, lo que permite un desarrollo más rápido de nuevas cepas, lo que es particularmente útil cuando se investigan los mecanismos inmunológicos de la IRI. Por estos motivos, hemos optado por desarrollar esta técnica en ratones.
Hasta donde sabemos, este es el primer artículo basado en video que utiliza la técnica de pinzamiento hiliar del pulmón izquierdo en ratón con un nudo corredizo. Saito et al han publicado un artículo basado en vídeo que demuestra el pinzamiento hiliar en ratas utilizando un pinzamiento microvascular22. En ratón, Liao et al publicaron un modelo IRI pulmonar con pinzamiento de la arteria pulmonar (AP) con un nudo corredizo, sin embargo, el pulmón permanece ventilado en este modelo ya que el bronquio está excluido de la pinza28. La técnica de pinzamiento por AP se ha utilizado como modelo para estudiar la embolia pulmonar29, la hipertensión pulmonar y/o el fallo ventricular derecho30,31. Dado que el área de estudio es la IRI pulmonar en el trasplante, optamos por pinzar todo el hilio, incluido el bronquio, para minimizar el barotrauma además de la lesión isquémica.
Cabe destacar que se eligieron 30 min de isquemia tibia seguida de 1 h de reperfusión porque estamos interesados en la dinámica de las células infiltrantes pulmonares en el período muy temprano post-IRI. Por ejemplo, los estudios han reportado una regulación positiva de los genes citoprotectores, como la hemo oxigenasa 1, después de solo 30 minutos de isquemia seguidos de 2 h de reperfusión13. Anteriormente se pensaba que los neutrófilos eran el tipo de célula central que infiltraba el pulmón después de IRI32, sin embargo, demostramos que los monocitos preceden a los neutrófilos en su llegada al pulmón18,24. Más recientemente, descubrimos que las células B preceden incluso a los monocitos y entran en el pulmón dentro de 1 h después de la reperfusión (datos no publicados). Al adaptar esta técnica, las duraciones de la isquemia caliente y la reperfusión se pueden ajustar de acuerdo con la pregunta y la hipótesis del estudio. Es posible que se produzcan períodos más largos de isquemia caliente sin preocuparse por la pérdida excesiva de líquido y calor, ya que el tórax puede cerrarse durante este período.
Varias complicaciones pueden ocurrir perioperatoriamente, y el resultado final común es la muerte perioperatoria. Hemos observado que la incidencia de muerte de animales durante la cirugía disminuye con las repeticiones de la técnica por parte del cirujano. Estimamos que los cirujanos requieren al menos 2 meses de práctica y/o al menos 20 casos para alcanzar una meseta en habilidad. En este punto, estimamos que la mortalidad intraoperatoria ocurre en aproximadamente 1 de cada 50 casos. La muerte en el ratón anestesiado a menudo es anunciada por respiraciones agónicas que involucran contracciones forzadas del diafragma y la musculatura de la pared torácica. Al inicio de estas respiraciones agónicas, la muerte ocurrirá en 3-5 minutos si no se toma ninguna intervención. Hay varias causas que pueden precipitar la muerte intraoperatoria, muchas de las cuales son reconocibles y prevenibles. Destacaremos a continuación los pasos críticos de esta cirugía y las técnicas de solución de problemas para lograr un resultado exitoso.
Intubación El primer paso crítico es la intubación cuidadosa y la fijación de las vías respiratorias para evitar la extubación inadvertida. En una cirugía de supervivencia, es particularmente importante asegurarse de que las cuerdas vocales no se dañen durante la intubación inicial, ya que el ratón no podrá respirar después de la extubación. El avance del TET más allá de los cordones debe realizarse bajo visualización directa a través del microscopio. Si se encuentra resistencia durante la intubación, el TET no debe avanzarse a ciegas. Al mantener la orofaringe abierta con la pinza antimosquitos, se debe tener cuidado de no perforar la mucosa oral, ya que la sangre oscurecerá la vista de las vías respiratorias. El número de intentos de intubación debe limitarse a menos de cinco.
Extubación accidental Si en algún momento durante el procedimiento, los pulmones no parecen estar inflándose adecuadamente, es posible que el tumor se haya desplazado. Otra manifestación de la extubación accidental que pasa desapercibida durante un período prolongado es el desarrollo repentino de la respiración agónica del ratón. Después de la intubación inicial, se debe tener cuidado de asegurar bien el TET a la nariz circunferencialmente con cinta de seda, y se debe limitar el ajuste del cuello y el torso del ratón. Si ni el pulmón izquierdo ni el derecho se inflan, es posible que el tumor se haya salido de la tráquea. Se pueden hacer intentos para empujar el TET hacia adentro, sin embargo, es posible que sea necesario volver a intubar al ratón de manera rápida para evitar la muerte prematura del animal. Si solo un pulmón se está inflando cuando se espera que ambos lo hagan, el TET puede ser demasiado profundo y debe retirarse con cuidado y volver a asegurarse.
Movilización pulmonar La movilización del pulmón izquierdo debe realizarse con aplicadores con punta de algodón con una presión suave sobre el parénquima pulmonar, ya que la lesión por compresión puede dañar los alvéolos y disminuir la distensibilidad del pulmón. Los pulmones no deben agarrarse con fórceps o pinzas, ya que esto dañará el parénquima pulmonar.
Aplicación de pinza hiliar La pinza hiliar izquierda debe colocarse bajo visualización directa, teniendo cuidado de no colocar el nudo demasiado central (para no atrapar la aurícula izquierda) o demasiado periférico (para no atrapar ningún parénquima pulmonar). Atrapar la aurícula izquierda con la pinza hiiar probablemente precipitará la fibrilación auricular y la posterior muerte. La visualización del hilio se puede mejorar asegurando una retracción adecuada de las costillas para ampliar el campo de visión. Después de atar el nudo corredizo, es útil asegurarse de que la pinza sea completamente oclusiva realizando una maniobra de reclutamiento, ocluyendo manualmente el tubo de salida que conecta el ETT con el ventilador y asegurándose de que el pulmón izquierdo no se expanda con presión positiva. Se presume oclusión vascular con confirmación de oclusión bronquial, dada la mayor colapsabilidad de la arteria y las venas pulmonares en comparación con el bronquio cartilaginoso. Además, la pinza hiliar no debe atarse con una fuerza excesiva, ya que aplastará las partes cartilaginosas del bronquio del tronco principal izquierdo y evitará la expansión del pulmón izquierdo tras la liberación de la pinza hiliare. Una vez que se libera la pinza hiilar, es importante comprobar que el pulmón aún puede ventilarse realizando otra maniobra de reclutamiento.
Cierre de pecho Al cerrar el tórax, la4ª y5ª costillas deben juntarse cuando el pulmón está en su máxima inspiración. Esto minimizará la cantidad de aire que queda en la cavidad pleural, lo que resultaría en un neumotórax una vez que las costillas estén cerradas. Las capas musculares y la piel deben cerrarse herméticamente para evitar el desarrollo de neumotórax a tensión.
Obtención de ABG Por último, al obtener la GA, es importante pinzar primero el hilio derecho para que la medición de la GA refleje únicamente la función pulmonar izquierda 22,23. Sin la pinza hiliares derecha, el pulmón derecho que normalmente ventila compensará con creces el pulmón izquierdo isquémico dañado y las mediciones de la glucea arterial parecerán normales.
En resumen, la técnica de pinzamiento hiliar que describimos anteriormente es una herramienta valiosa para el estudio del trasplante pulmonar y, lo que es más importante, puede aislar el estudio de la IRI caliente sin la introducción de alogenicidad, trauma relacionado con la anastomosis quirúrgica o almacenamiento isquémico frío. En particular, esta técnica descrita de pinzamiento hiliar es fácil de enseñar y ampliamente adoptable, y puede conducir a resultados confiables y reproducibles.

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Erratum: Murine Left Pulmonary Hilar Clamp Model of Lung Ischemia Reperfusion Injury

La IRI durante el trasplante de órganos es un factor de riesgo importante para la disfunción primaria del injerto y los episodios posteriores de rechazo del injerto 1,2. Durante el trasplante, el tiempo de isquemia caliente se define como el período de tiempo que transcurre desde el pinzamiento cruzado de la aorta del donante hasta el inicio de la perfusión fría y desde la extracción del órgano desde el hielo hasta la implantación del órgano. El tiempo de almacenamiento en frío se define como el período de tiempo que transcurre desde el inicio de la perfusión en frío hasta la extracción del órgano del hielo3. La isquemia caliente es más deletérea para la función orgánica posterior que la isquemia fría 4,5,6, y sus mecanismos subyacentes justifican estudios adicionales en modelos preclínicos. Además, el trasplante de órganos por donación después de la muerte cardíaca (DCD) se asocia con tiempos isquémicos cálidos más largos que la donación tradicional después de la muerte encefálica (DBD)7. Si bien el uso de donantes con DCD puede ampliar el grupo de donantes y aumentar la utilización pulmonar, se necesitan más estudios preclínicos para evaluar los efectos de la isquemia caliente en la función pulmonar posterior al trasplante. A continuación, describimos un modelo de IRI caliente en ratones a través de la pinza hiliar pulmonar izquierda.
En los últimos años se han desarrollado y adaptado varios modelos animales de pinzamiento hiliar pulmonar que pueden incluir el uso de una pinza microvascular atraumática 8,9,10,11,12,13, un torniquete de Rumel 14,15 o una ligadura de sutura16 como la pinza hiliare. El quid de la pinza hiiar es que debe ser reversible y causar un daño mínimo o nulo a las estructuras hiliares para que se pueda lograr la reperfusión. Aquí, describimos nuestra técnica de pinzamiento hiliar en ratones que implica la ligadura reversible de sutura del hilio pulmonar izquierdo con un nudo corredizo. Este método ocluye el flujo arterial pulmonar de entrada, el flujo venoso de salida y el flujo de aire dentro y fuera del bronquio principal. El principal beneficio de un nudo corredizo sobre una pinza vascular, un clip o un torniquete es que el tórax puede cerrarse durante períodos prolongados de isquemia, minimizando así la pérdida de líquido insensible y calor en el ratón. Proporcionamos un protocolo para obtener mediciones fiables de la gasometría arterial (GAB) y para medir la extravasación celular después del pinzamiento hiliar.
Esta técnica de pinzamiento hiliar ocupa un lugar importante en el estudio más amplio del trasplante de pulmón. En comparación con los modelos de trasplante pulmonar ortotópico de animales pequeños, la técnica de pinzamiento hiliar puede aislar los efectos de la IRI sin la adición de trauma anastomótico quirúrgico o alogenicidad17. Además, la técnica de pinzamiento hiliar puede dominarse más fácil y rápidamente que el trasplante de pulmón de ratón. De hecho, utilizando técnicas de pinzamiento hiliar, se han identificado en la última década varios mecanismos importantes en la patogénesis de la IRI, como TLR4, NADPH oxidasa y el receptor de adenosina A2A 14,18,19,20. En el siguiente protocolo, presentamos un método fiable, enseñable y reproducible de pinzamiento hiliar como herramienta para el estudio de la IRI pulmonar.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Medicamentos</solución ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% de povidona yodada</td><td>Aplicare</td><td>NDC 52380-0126-2</td><td>Para desinfectante</td></tr><tr><td>Buprenorfina 1.3 mg/mL</td><td>Fidelis Animal Health</td><td>NDC 86084-100-30</td><td>Para el control del dolor</td></tr><tr><td>Carprofeno</td><td>Cronus Pharma</td><td>NDC 69043-027-18</td><td>Para el control del dolor</td></tr><tr><td>Heparina 1000 unidades/mL</td><td>Sagent</td><td>NDC 25021-404-01</td><td>Para la obtención de sangre arterial</td></tr><tr><td>Isoflurano 1%-1.5%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>26675-46-7</td><td>Para anestesia</td></tr><tr><td>Clorhidrato de ketamina 100 mg/mL</td><td>Vedco</td><td>NDC 50989-996-06</td><td>Para anestesia</td></tr><tr><td>Puralube Vet ungüento ocular</td><td>Medi-Vet.com</td><td>11897</td><td>Para prevenir la desecación ocular</td></tr><tr><td>Xilacina 20 mg/mL</td><td>Akorn</td><td>NDC 59399-110-20</td><td>Para el control del dolor</td></tr><tr><td><fuerte>Herramientas e instrumentos</fuerte></td>Argent Pluma de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cauterización de punta fina de alta temperatura</td><td>McKesson</td><td>231</td><td>Para coagular los vasos sanguíneos</td></tr><tr><td>Pinza antimosquitos curvada</td><td>Fine Science Tools</td><td>13009-12</td><td>Para procedimientos quirúrgicos</td></tr><tr><td>Pinzas curvas finas</td><td>Fine Science Tools</td><td>11274-20</td><td>Para cirugía procedimiento</td></tr><tr><td>Tijeras finas</td><td>Fine Science Tools</td><td>15040-11</td><td>Para procedimiento quirúrgico</td></tr><tr><td>Configuración de pinza de intubación</td><td>Fine Science Tools</td><td>18374-44, 18144-30</td><td>Para sujetar al ratón verticalmente por la lengua durante la intubación. Véase la figura complementaria 1A.</td></tr><tr><td>Retractores magnéticos de costillas</td><td>Fine Science Tools</td><td>18200-01, 18200-10</td><td>Para la retracción de la toracotomía. El fijador magnético y el retractor deben estar conectados por un tubo de microlátex que se encuentra debajo.</td></tr><tr><td>Fibra óptica de plástico de grado óptico sin camisa, 500 &mu; m</td><td>Edmund Optics</td><td>02-532</td><td>Para hacer el introductor del tubo endotraqueal. Vea la Figura Suplementaria 1B. Una longitud de 1.5 pulgadas de esta fibra óptica debe tener un trozo de cinta de seda asegurado a un extremo. A continuación, se puede utilizar como introductor del tubo endotraqueal. El extremo del introductor debe ser ligeramente curvado.</td></tr><tr><td>Power Pro Ultra maquinilla</td><td>Oster</td><td>078400-020-001</td><td>Para cortar el pelo</td></tr><tr><td>Tijeras</td><td>Fine Science Tools</td><td>14370-22</td><td>Para procedimiento quirúrgico</td></tr><tr><td>Almohadilla térmica para animales pequeños</td><td>K& H Pet Products</td><td>Almohadilla térmica Thermo-Peep</td><td>Para mantener la normotermia</td></tr><tr><td>Ventilador para animales pequeños</td><td>Harvard Apparatus</td><td>55-0000</td><td>Para ventilación (TV 0,35 cc, PEEP 1 cm H2O, RR 100-105/min, FiO2 100%)</td></tr><tr><td>Spearit Micro Látex Tubo de caucho (1/8 de pulgada de diámetro exterior, 1/16 de pulgada de diámetro interior)</td><td>Amazon.com</td><td>https://www.amazon.com/Rubber-Tubing-CONTINUOUS-Select-Length/dp/B00H4MT7V0?th=1</td><td>Para la retracción de toracotomía</td></tr><tr><td>Stat Profile Prime Analizador de gases en sangre para cuidados críticos</td><td>Nova Biomedical</td><td>https://novabiomedical.com/prime-plus-critical-care-blood-gas-analyzer/index.php?gad=1&gclid=Cj0KCQjwmICoBhDx ARIsABXkXlInZX--R3ezBkc304nS_GVGI9Z2T3Esr33 2aM8WGPiUVhicPQZ Wj2AaAqhDEALw_wcB&nbsp; &nbsp;</td><td>Para la retracción de la toracotomía</td></tr><tr><td>Pinza recta</td><td>Fine Science Tools</td><td>13008-12</td><td>Para procedimientos quirúrgicos</td></tr><tr><td>Pinzas rectas</td><td>Fine Science Tools</td><td>91113-10</td><td>Para procedimientos quirúrgicos</td></tr><tr><td>Microscopio quirúrgico</td><td>Wild Heerbrugg</td><td>ya no se</td><td>fabrica Para intubación y procedimientos quirúrgicos; recomendar su sustitución por microscopios quirúrgicos Leica</td></tr><tr><td>Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&frac12; jeringa cc con aguja</td><td>McKesson 942665 McKesson</td><td></td> de 12 pulgadas <td>para inyectar ketamina / xilacina intraperitonealmente</td></tr> <tr><td>&frac12; aguja de 31G pulgadas en una jeringa de tuberculina de 1 cc</td><td>McKesson</td><td>16-SNT1C2705</td><td>Para la aspiración de sangre arterial desde el ventrículo izquierdo</td></tr><tr><td>Catéter intravenoso de 1 pulgada y 20 G</td><td>Terumo SROX2025CA</td><td></td><td>Para tubo endotraqueal (ETT)</td></tr><tr><td>seda de 1 pulgada cinta</td><td>Durapore</td><td>3M ID 7100057168</td><td>Para pegar ETT a la nariz y asegurar las extremidades</td></tr><tr><td>Jeringa de 3/10 cc con aguja 31G de 5/16 pulgadas</td><td>McKesson</td><td>102-SN310C31516P</td><td>Para inyección de anticuerpos en la vena cava inferior</td></tr><tr><td>6-0 sutura monofilamento en una aguja P-10</td><td>McKesson</td><td>S697GX</td><td>Para el cierre de la toracotomía, la capa muscular y la piel</td></tr><tr><td>Corbata de seda 6-0</td><td>Especialidades Quirúrgicas Look</td><td>SP102</td><td>Para hacer nudo corredizo para pinza hiliar</td></tr><tr><td>Aplicadores puntiagudos con punta de algodón</td><td>Solon</td><td>56225</td><td>Para manipular el pulmón y para la disección roma</td></tr></tbody></table>

modelo murino de pinzamiento del hiliar pulmonar izquierdo de lesión por isquemia pulmonar y reperfusión

Murine Left Pulmonary Hilar Clamp Model of Lung Ischemia Reperfusion Injury

La lesión por isquemia-reperfusión (IRI) durante el trasplante de pulmón es un factor de riesgo importante para las complicaciones posteriores al trasplante, incluida la disfunción primaria del injerto, el rechazo agudo y crónico y la mortalidad. Los esfuerzos para estudiar los fundamentos de la IRI condujeron al desarrollo de un modelo de ratón fiable y reproducible de pinzamiento hiliar del pulmón izquierdo. Este modelo consiste en un procedimiento quirúrgico realizado en un ratón anestesiado e intubado. Se realiza una toracotomía izquierda, seguida de una movilización pulmonar cuidadosa y disección del hilio pulmonar izquierdo. La pinza hiliar implica la ligadura reversible del hilio pulmonar con un nudo corredizo, que detiene la entrada arterial, la salida venosa y el flujo de aire a través del bronquio principal izquierdo. La reperfusión se inicia mediante la extracción cuidadosa de la sutura. Nuestro laboratorio utiliza 30 min de isquemia y 1 h de reperfusión para el modelo experimental en las investigaciones actuales. Sin embargo, estos períodos de tiempo pueden modificarse dependiendo de la pregunta experimental específica. Inmediatamente antes del sacrificio, se puede obtener gasometría arterial del ventrículo izquierdo después de un período de 4 minutos de pinzamiento del hilar derecho para garantizar que los valores dePaO2 obtenidos se atribuyan solo al pulmón izquierdo lesionado. También describimos un método para medir la extravasación celular con citometría de flujo, que implica la inyección intravenosa de un anticuerpo marcado con fluorocromo específico para la(s) célula(s) que se va a estudiar antes del sacrificio. A continuación, se puede extraer el pulmón izquierdo para la citometría de flujo, congelado o fijo, inmunohistoquímica incluida en parafina y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa. Esta técnica de pinzamiento hiliar permite un estudio detallado de los mecanismos celulares y moleculares que subyacen a la IRI. Los resultados representativos revelan una disminución de la oxigenación del pulmón izquierdo y evidencia histológica de lesión pulmonar después del pinzamiento hiliare. Esta técnica puede ser fácilmente aprendida y reproducida por personal con y sin experiencia microquirúrgica, lo que conduce a resultados confiables y consistentes y sirve como un modelo ampliamente adoptable para el estudio de la IRI pulmonar.

Después del pinzamiento hiliar izquierdo, la presión parcial de oxigenación en la sangre arterial (PaO2) atribuida al pulmón izquierdo es de ~100 mmHg, significativamente menor en comparación con los ~500 mmHg después de la toracotomía simulada (Figura 7A, n = 6-7). Cabe destacar que se realizaron toracotomías simuladas en ratones B6 con medición de la GAB tomada después de 4 min de pinzamiento hiliar derecho, lo que representa valores atribuidos solo al pulmón izquierdo. La tinción con H&amp;E del pulmón izquierdo pinzado hiliar demostró la infiltración de células inflamatorias que llenan las vías respiratorias y la congestión de los vasos sanguíneos con eritrocitos, mientras que estos hallazgos están ausentes en el pulmón izquierdo ingenuo (Figura 7B, n = 2). Estos resultados demuestran la lesión tisular inmediata y la infiltración celular después de un período de isquemia y reperfusión.
Como se discutió en el paso 6, los neutrófilos intravasculares e intersticiales se pueden diferenciar con la inyección intravenosa de anticuerpos anti-Ly6G marcados con FITC 5 min antes del sacrificio, seguida del marcaje de todos los neutrófilos con anticuerpos APC-Ly6G18,24. Los gráficos representativos muestran que ~75% de los neutrófilos son intravasculares (APC-Ly6G+FITC-Ly6G+) y ~25% son intersticiales (APC-Ly6G+FITC-Ly6G-) después del pinzamiento hiliar del pulmón izquierdo (Figura 7C, n=4). Estos resultados demuestran una forma fiable de evaluar la extravasación de neutrófilos y pueden adaptarse a otros tipos de células en función de los anticuerpos utilizados (es decir, anti-Ly6C para los monocitos, anti-CD19 para las células B). Esta técnica es útil para el estudio de la dinámica celular después de la IRI.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66232/66232fig1v2.jpg"> Figura 1: Intubación del ratón. (A) Ratón con el pecho izquierdo y el abdomen afeitados. (B) Tubo endotraqueal conectado al tubo del ventilador. (C) Una vez confirmada la intubación, pegue el tubo circunferencialmente a la nariz del ratón. (D) Ratón intubado con tubo de entrada y salida desde y hacia el ventilador para animales pequeños. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66232/66232fig1v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66232/66232fig02.jpg"> Figura 2: Toracotomía izquierda. (A) Incisión en la piel sobre el4º espacio intercostal (CSI). (B) Capas musculares divididas en el4º espacio intercostal. (C) Hacer una pequeña incisión justo por encimade la 5ª costilla. (D) Extensión de la incisión anterior y posterior en el4º ICS. (E) Pulmón visualizado en4º ICS. (De F a G) Retractores de costillas colocados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66232/66232fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66232/66232fig03.jpg"> Figura 3: Pinza hiliar izquierda. (A) Pulmón izquierdo movilizado con hisopos de algodón. (B) Ligamento pulmonar inferior (IPL) visualizado. (C) Con el pulmón izquierdo volteado hacia atrás, la corbata de seda se coloca posterior al hilio. (D) Con la izquierda volteada posteriormente sobre el lazo de seda, se visualiza el hilio anterior. (E) Amarre instrumental de un nudo corredizo sobre el hilio izquierdo. (F) Nudo corredizo en hilio. (G) Con la oclusión manual del flujo de salida, el pulmón izquierdo no se infla, lo que indica un pinzamiento hiliar exitoso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66232/66232fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66232/66232fig04.jpg"> Figura 4: Liberación de la pinza hiiar izquierda y cierre del tórax izquierdo. (A) Con el nudo corredizo suelto, el pulmón izquierdo se vuelve a inflar. (B) Cierre de costilla con un bocado justo por encimade la 4ª costilla y (C) un bocado justo por encimade la 6ª costilla. (D-E) Pecho cerrado con un punto atado en el extremo de la inspiración. (F) Cierre de la piel con puntos interrumpidos (después del cierre de la capa muscular con puntos corridos). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66232/66232fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66232/66232fig05.jpg"> Figura 5: Laparotomía, toracotomía bilateral en forma de concha y extracción de sangre arterial. (A) Ratón ajustado a posición supina. (B) Incisión en la piel sobre la línea media del abdomen. (C) Laparotomía que se extiende desde el xifoides hasta el pubis, con extensión hacia la izquierda y hacia la derecha a lo largo de la costilla más inferior. (D-E) Apertura del diafragma para entrar en la cavidad torácica, con extensión de la incisión del diafragma hacia la izquierda y hacia la derecha a lo largo de la costilla más inferior (línea punteada). (F) Toracotomía bilateral con incisiones en las líneas axilares anteriores (línea punteada) hacia el ápice del tórax. (G) Lóbulo accesorio del pulmón derecho que se extiende hacia el tórax izquierdo posterior a la vena cava inferior. (H) Lóbulo accesorio movilizado y devuelto al tórax derecho. (I) Aspiración de sangre arterial desde el ventrículo izquierdo (recuadro: diferencia de color entre los ventrículos derecho e izquierdo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66232/66232fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66232/66232fig06.jpg"> Figura 6: Inyección intravenosa en la vena cava inferior. (A) Rotación visceral medial derecha para exponer la vena cava inferior (VCI). (B) Inyección de solución en IVC. (C) Aplicar presión sobre la VCI para lograr la hemostasia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66232/66232fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66232/66232fig07.jpg"> Figura 7: Resultados representativos de la oxigenación pulmonar, histología y extravasación de neutrófilos después de la pinza hiliar izquierda. (A) Presión parcial de oxígeno en la sangre arterial de un ratón C57BL/6 que se sometió a una toracotomía simulada frente a una pinza hiilar. Los resultados se presentan como media ± SEM, n=6-7. Valores de p calculados por la prueba U de Mann-Whitney. **P &lt;0,01. (B) Tinción de H&amp;E de una sección pulmonar fijada en formol e incluida en parafina de un ratón C57BL/6 que se sometió a una toracotomía simulada frente a una pinza hiliare. La barra de escala representa 250 μm. (C) Figura representativa de la distribución de neutrófilos Ly6G+FITC-Ly6G+extravasculares (APC-Ly6G+FITC-Ly6G-) Ly6G+ extravasculares (APC-Ly6G+FITC-Ly6G-) en un ratón C57BL/6 tras pinza hiliar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66232/66232fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Figura complementaria 1: Introductor para tubo endotraqueal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66232/Supplemental_Figure_1_updated.pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

El protocolo describe un método factible, fiable y reproducible de pinzamiento del hiliar pulmonar izquierdo que puede utilizarse para estudiar la lesión por isquemia-reperfusión pulmonar en modelos de ratón.

Modelo murino de pinzamiento del hiliar pulmonar izquierdo de lesión por isquemia pulmonar y reperfusión

Ischemia reperfusion injury (IRI) during lung transplantation is a major risk factor for post-transplant complications, including primary graft ...

Estamos interesados en estudiar los efectos de la lesión por isquemia-reperfusión en los resultados después del trasplante pulmonar con el objetivo de comprender los mecanismos celulares y moleculares subyacentes. Los neutrófilos que ingresan al pulmón contribuyen a la lesión por isquemia-reperfusión (IRI, por sus siglas en inglés). Recientemente hemos descubierto que las células B preceden a los neutrófilos en la entrada al pulmón, y desempeñan un papel en el reclutamiento de neutrófilos después de la IRI.El trasplante de pulmón izquierdo en el ratón es técnicamente desafiante y requiere un entrenamiento dedicado a tiempo completo durante varios meses para lograr resultados consistentes. Además, introduce la alergenicidad y el trauma anastomótico quirúrgico. Por lo tanto, necesitamos una técnica más accesible que pueda aislar el estudio de la lesión por isquemia-reperfusión.Utilizando nuestro modelo de pinza hiliar, hemos descubierto que las células B entran en el pulmón poco después de la lesión por isquemia-reperfusión, y reclutan monocitos clásicos en un receptor de células B de forma dependiente de TLR4. En última instancia, esto da como resultado un aumento de la extravasación de neutrófilos al pulmón. Nuestro protocolo consiste en la ligadura reversible de sutura del hilio pulmonar izquierdo con un nudo corredizo.La naturaleza flexible y discreta de la sutura permite el cierre del tórax, lo que es útil para estudiar períodos más largos de isquemia caliente, ya que el cierre del tórax minimiza el calor y las pérdidas insensibles de líquido en el ratón.

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Investigación

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Medicine

Medicina

El trauma quirúrgico induce una respuesta inflamatoria. Las citocinas y los ligandos endógenos se sabe que modulan el tamaño del infarto de miocardio después de la isquemia y la reperfusión. Se presenta una versión modificada de tórax cerrado, el modelo murino de isquemia y reperfusión con pesas colgantes para minimizar los efectos de la toracotomía.

Un murino tórax cerrado modelo de isquemia y reperfusión miocárdica

Se introduce un método quirúrgico para inducir experimental de isquemia / reperfusión (I / R) lesión para simular el infarto de miocardio (MI) en modelos de ratón que permite una mayor claridad en el posicionamiento de la ligadura en la arteria descendente anterior izquierda (LAD) para aumentar la reproducibilidad de experimentos en ratones MI.

Un modelo murino de isquemia-reperfusión miocárdica lesión a través de la ligadura de la arteria descendente anterior

Un modelo de abrazadera hiliar hígado de rata única fue desarrollado para estudiar el impacto de moléculas farmacológicas en la mejora de la lesión por isquemia-reperfusión. Este modelo incluye la canulación directa del suministro de portal al segmento de hígado isquémico a través de una rama de la vena porta, lo que permite la entrega hepática directa.

Método de la entrega directa segmentaria intra-hepática utilizando un modelo de hígado de rata hiliar abrazadera

Aquí se describe un procedimiento quirúrgico que muestra cómo lograr la ligadura permanente de la arteria coronaria descendente izquierda-anterior en ratones. Este modelo es de gran relevancia para investigar la fisiopatología del infarto de miocardio y los procesos biológicos concomitantes.

Modelo de infarto de miocardio murino usando ligadura permanente de la arteria coronaria descendente anterior izquierda

Describimos en detalle un modelo de tumor de metástasis hepáticas de cáncer colorrectal clínicamente relevante (CRLM) y la influencia de la reperfusión de isquemia hepática (I/R) en el crecimiento tumoral y la metástasis. Este modelo puede ayudar a entender mejor los mecanismos subyacentes promoción inducida por cirugía del crecimiento metastásico hepático.

Modelo murino de tumores hepáticos metastásicos en el escenario de la lesión por reperfusión de isquemia

El modelo de isquemia-reperfusión miocárdica del corazón de rata se mejora mediante el uso de un retractor de fabricación propia, un tubo de cloruro de polivinilo y un método de anudado único. El electrocardiograma, el cloruro de trifeniltetrazolio y la tinción histológica, y los resultados del análisis de supervivencia porcentual mostraron que el grupo modelo mejorado tiene mayores tasas de éxito y supervivencia que el grupo modelo ya existente.

Modelo mejorado de roedores de isquemia miocárdica y lesión por reperfusión

Un modelo quirúrgico de ratón para crear una lesión por isquemia de reperfusión (RI) del pulmón izquierdo mientras se mantiene la ventilación y se evita la hipoxia.

Un modelo de ratón de intubación orotraqueal y cirugía de reperfusión de isquemia pulmonar ventilada

Aquí se presenta un procedimiento quirúrgico para la ligadura permanente de la arteria coronaria izquierda en ratones. Este modelo se puede utilizar para investigar la fisiopatología y la respuesta inflamatoria asociada después del infarto de miocardio.

Ligadura de la arteria coronaria izquierda: un modelo murino quirúrgico de infarto de miocardio

Este estudio describe un modelo de lesión pulmonar aguda después de la isquemia-reperfusión visceral durante el pinzamiento cruzado de la aorta supracelíaca mediante laparotomía en ratas. Permite investigar los efectos clínicos y biológicos del pinzamiento aórtico, así como el impacto de la isquemia-reperfusión en los órganos subyacentes y las lesiones pulmonares remotas.

Un modelo de lesión pulmonar aguda después de la isquemia-reperfusión visceral por pinzamiento cruzado de la aorta supracelíaca en ratas

Se describen modelos de lesión renal por isquemia-reperfusión inducida moderada y grave en la que los ratones se someten a pedículo renal unilateral de sujeción seguida de simultánea o en diferido nefrectomía contralateral, respectivamente. Estos modelos dan consistentemente lugar a la disfunción renal y la fibrosis después de la lesión, pero gravedad de la lesión y la supervivencia dependen de equipos de fondo, la edad y quirúrgicos ratón.

La isquemia-reperfusión modelo de lesión renal aguda y post lesión fibrosis en ratones

Aprende el modelo de pinzamiento del hiliar pulmonar izquierdo en ratones para estudiar lesión por isquemia y reperfusión. Este método permite analizar el papel de neutrófilos y células B en el daño pulmonar.

Modelo murino de pinzamiento del hiliar pulmonar izquierdo de lesión por isquemia pulmonar y reperfusión

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