Name: Microscopía intravital de dos fotones de glioblastoma en un modelo murino (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-01T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Aprenda microscopía intravital de dos fotones para estudiar la distribución de nanopartículas en glioblastoma usando un modelo murino. Esta técnica permite visualizar en tiempo real el transporte terapéutico a través de la barrera hematoencefálica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nos gustaría agradecer al Servicio de Microscopía de Neurociencia Wu Tsai de Stanford, al Centro de Innovaciones en Imágenes In Vivo (SCi3) de Stanford - centro de imágenes de animales pequeños, a la Subvención de Instrumentación Compartida S10 de los NIH (S10RR026917-01, PI Michael Moseley, Ph.D.) y al Centro de Imágenes Preclínicas de Stanford en Porter Drive por proporcionar el equipo y la infraestructura para este proyecto. Este trabajo fue apoyado por una subvención del Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano, subvención número R01HD103638. Nos gustaría agradecer al Grupo Schnitzer, de la Universidad de Stanford; el laboratorio Zuo, Universidad de Santa Cruz; y el Laboratorio de Imágenes Neurovasculares, Centro Fotónico de Boston, Universidad de Boston, para discusiones educativas sobre imágenes de dos fotones y modelos de ventana craneal.

Seguimiento en tiempo real de nanopartículas en tumores cerebrales mediante 2P-IVM en ratones

<ol><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li>
<li>Wang, Z., McCracken, S., Williams, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transpupillary+two-photon+in+vivo+imaging+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transpupillary two-photon in vivo imaging of the mouse retina.</a> J Vis Exp. 168, 61970(2021).</li>
<li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+microscopy+reveals+the+contribution+of+Sox9%2B+to+kidney+regeneration+in+a+mouse+model+with+extracellular+vesicle+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon microscopy reveals the contribution of Sox9+ to kidney regeneration in a mouse model with extracellular vesicle treatment.</a> J Biol Chem. 295 (34), 12203(2020).</li>
<li>Jang, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+microscopy+of+Paneth+cells+in+the+small+intestine+of+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Two-photon microscopy of Paneth cells in the small intestine of live mice.</a> Sci Rep. 8 (1), 14174(2018).</li>
<li>Ihler, F., Bertlich, M., Weiss, B., Dietzel, S., Canis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+microscopy+allows+imaging+and+characterization+of+cochlear+microvasculature+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Two-photon microscopy allows imaging and characterization of cochlear microvasculature in vivo.</a> Biomed Res Int. 2015, 154272(2015).</li>
<li>Matsuura, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+with+two-photon+microscopy+reveals+cellular+dynamics+in+the+ischeamia-reperfused+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging with two-photon microscopy reveals cellular dynamics in the ischeamia-reperfused rat heart.</a> Sci Rep. 8 (1), 15991(2018).</li>
<li>Veres, T. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intubation-free+in+vivo+imaging+of+the+tracheal+mucosa+using+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Intubation-free in vivo imaging of the tracheal mucosa using two-photon microscopy.</a> Sci Rep. 7 (1), 694(2017).</li>
<li>Zong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+two-photon+calcium+imaging+in+freely+moving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Large-scale two-photon calcium imaging in freely moving mice.</a> Cell. 185 (7), 1240-1256.e30 (2022).</li>
<li>Takasaki, K., Abbasi-Asl, R., Waters, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superficial+bound+of+the+depth+limit+of+two-photon+imaging+in+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Superficial bound of the depth limit of two-photon imaging in mouse brain.</a> eNeuro. 17 (1), (2019).</li>
<li>Birkner, A., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+two-photon+imaging+in+vivo+with+a+red-shifted+calcium+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Deep two-photon imaging in vivo with a red-shifted calcium indicator.</a> Methods Mol Biol. 1929, 15-26 (1929).</li>
<li>Busche, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+hippocampal+neurons+in+Alzheimer+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon calcium imaging of hippocampal neurons in Alzheimer mouse models.</a> Methods Mol Biol. 1750, 341-351 (2018).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+two-photon+probe+to+selectively+detect+monoamine+oxidase+B+activity+in+Parkinson%27s+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A sensitive two-photon probe to selectively detect monoamine oxidase B activity in Parkinson's disease models.</a> Nat Commun. 5, 3276(2014).</li>
<li>Madden, K. S., Zettel, M. L., Majewska, A. K., Brown, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tumor+imaging%3A+live+imaging+of+glioma+by+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Brain tumor imaging: live imaging of glioma by two-photon microscopy.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013 (3), (2013).</li>
<li>Ricard, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+dynamics+of+microglial+and+monocyte-derived+cells+in+glioblastoma-bearing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Phenotypic dynamics of microglial and monocyte-derived cells in glioblastoma-bearing mice.</a> Sci Rep. 6, 26381(2016).</li>
<li>Soubéran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+VEGF+blockade+on+the+dynamics+of+the+inflammatory+landscape+in+glioblastoma-bearing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Effects of VEGF blockade on the dynamics of the inflammatory landscape in glioblastoma-bearing mice.</a> J Neuroinflammation. 16 (1), 191(2019).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+vivo+reveals+specific+nanoparticle+target+binding+in+a+syngeneic+glioma+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Real-time vivo reveals specific nanoparticle target binding in a syngeneic glioma mouse model.</a> Nanoscale. 14 (15), 5678-5688 (2022).</li>
<li>Wartchow, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+with+cyclic+AMP+activators+reduces+glioblastoma+growth+and+invasion+as+assessed+by+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Treatment with cyclic AMP activators reduces glioblastoma growth and invasion as assessed by two-photon microscopy.</a> Cells. 10 (3), 556(2021).</li>
<li>Jiang, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+detection+of+fibrillar+collagen+deposition+associated+with+vascular+elements+in+glioblastoma+multiforme+by+using+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Label-free detection of fibrillar collagen deposition associated with vascular elements in glioblastoma multiforme by using multiphoton microscopy.</a> J Microsc. 265 (2), 207-213 (2017).</li>
<li>Chen, Z., Ross, J. L., Hambardzumyan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+2-photon+imaging+reveals+distinct+morphology+and+infiltrative+properties+of+glioblastoma-associated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Intravital 2-photon imaging reveals distinct morphology and infiltrative properties of glioblastoma-associated macrophages.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (28), 14254-14259 (2019).</li>
<li>Zhang, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+human+mesenchymal+stem+cells+with+gold+nanocages+for+in+vitro+and+in+vivo+tracking+by+two-photon+microscopy+and+photoacoustic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Labeling human mesenchymal stem cells with gold nanocages for in vitro and in vivo tracking by two-photon microscopy and photoacoustic microscopy.</a> Theranostics. 3 (8), 532-543 (2013).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Hoeferlin, G. F., Menendez, D. M., Krebs, O. K., Capadona, J. R., Shoffstall, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+thermal+damage+from+robot-drilled+craniotomy+for+cranial+window+surgery+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assessment of thermal damage from robot-drilled craniotomy for cranial window surgery in mice.</a> J Vis Exp. 189, 64188(2022).</li>
<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li>
<li>Heo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+soft%2C+transparent%2C+freely+accessible+cranial+window+for+chronic+imaging+and+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology.</a> Sci Rep. 6, 27818(2016).</li>
<li>Kim, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+optical+access+to+an+estimated+one+million+neurons+in+the+live+mouse+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Long-term optical access to an estimated one million neurons in the live mouse cortex.</a> Cell Rep. 17 (12), 3385-3394 (2016).</li>
<li>Kılıç, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+cranial+windows+for+long+term+multimodal+neurovascular+imaging+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Chronic cranial windows for long term multimodal neurovascular imaging in mice.</a> Front Physiol. 11, 612678(2021).</li>
<li>Helm, P. J., Ottersen, O. P., Nase, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+optical+properties+of+the+mouse+cranium-implications+for+in+vivo+multi+photon+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of optical properties of the mouse cranium-implications for in vivo multi photon laser scanning microscopy.</a> J Neurosci Methods. 178 (2), 316-322 (2009).</li>
<li>Lu, W., Sun, Q., Wan, J., She, Z., Jiang, X. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+albumin-conjugated+pegylated+nanoparticles+allow+gene+delivery+into+brain+tumors+via+intravenous+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cationic albumin-conjugated pegylated nanoparticles allow gene delivery into brain tumors via intravenous administration.</a> Cancer Res. 66 (24), 11878-11887 (2006).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LDLR-mediated+peptide-22-conjugated+nanoparticles+for+dual-targeting+therapy+of+brain+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">LDLR-mediated peptide-22-conjugated nanoparticles for dual-targeting therapy of brain glioma.</a> Biomaterials. 34 (36), 9171-9182 (2013).</li>
<li>Xin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+anti-glioblastoma+efficacy+by+PTX-loaded+PEGylated+poly%28%C9%9B-caprolactone%29+nanoparticles%3A+In+vitro+and+in+vivo+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Pharm%22%5BJournal%5D)">Enhanced anti-glioblastoma efficacy by PTX-loaded PEGylated poly(ɛ-caprolactone) nanoparticles: In vitro and in vivo evaluation.</a> Int J Pharm. 402 (1-2), 238-247 (2010).</li>
<li>Valable, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+MRI+tracking+of+exogenous+monocytes%2Fmacrophages+targeting+brain+tumors+in+a+rat+model+of+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">In vivo MRI tracking of exogenous monocytes/macrophages targeting brain tumors in a rat model of glioma.</a> Neuroimage. 40 (2), 972(2008).</li>
<li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototheranostics%3A+Active+targeting+of+orthotopic+glioma+using+biomimetic+proteolipid+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Phototheranostics: Active targeting of orthotopic glioma using biomimetic proteolipid nanoparticles.</a> ACS Nano. 13 (1), 386-398 (2021).</li>
<li>Asan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+correlates+of+gray+matter+volume+changes+in+magnetic+resonance+morphometry+identified+by+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Cellular correlates of gray matter volume changes in magnetic resonance morphometry identified by two-photon microscopy.</a> Sci Rep. 11, 4234(2021).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de intereses.

Presentamos un método para el seguimiento in vivo de NP en tiempo real utilizando 2P-IVM a través de una ventana craneal para evaluar la administración tumoral de NP de óxido de hierro marcadas con fluorescencia. La técnica quirúrgica para este procedimiento requiere una mano firme y habilidades quirúrgicas experimentales avanzadas. Es recomendable practicar el uso de cadáveres o fantasmas antes de pasar a la experiencia con animales vivos. Como alternativa, Hoeferlin et al. implementaron un taladro robótico para reducir el daño térmico, minimizar la variabilidad de la técnica quirúrgica y estandarizar la cirugía22.
El tamaño de la ventana representa otro parámetro crítico. Una ventana más grande permitiría obtener imágenes de una porción más grande del tumor con 2P-IVM. En la literatura se han descrito tamaños entre 3-7 mm23. Sin embargo, las ventanas más grandes no pueden acomodar la curvatura cerebral, lo que puede conducir a un aumento de la presión regional24. Para superar esta restricción, se puede utilizar en su lugar la llamada "calavera de cristal"25. En comparación con las ventanas de vidrio tradicionales, este método utiliza vidrio curvo, que se adapta a la curvatura del cerebro y, por lo tanto, permite la creación de ventanas más grandes al tiempo que reduce la presión focal en la corteza. Este tipo de vidrio curvo no está disponible comercialmente, y solo tiene aplicaciones limitadas en 2P-IVM, ya que la superficie curva provoca artefactos de reflexión, limitando el área de la ventana que podría ser fotografiada. Otra alternativa es una ventana24 basada en silicio. Por un lado, este método ofrece más flexibilidad en cuanto al tamaño y la forma de la ventana que se va a crear. Además, se han reportado resultados comparables en términos de fallas de ventanas y tasas de inflamación a las ventanas de vidrio clásicas. Por otro lado, se ha demostrado que la calidad de las imágenes de 2 fotones en ventanas basadas en polímeros disminuye más rápido que en ventanas de vidrio, lo que la hace inviable para aplicaciones a largo plazo26. Una ventana craneal de cráneo adelgazada representa otra alternativa. Si bien es menos invasiva que la ventana de vidrio clásica, no permite la implantación de células GBM utilizando la misma técnica que se describe aquí. Además, es difícil lograr un grosor de cráneo constante y, como resultado, esto puede causar artefactos significativos en 2P-IVM27.
La línea celular y la cantidad de células GBM que se implantan son otras consideraciones importantes a la hora de planificar el cronograma del estudio. La línea celular de glioma de rata C6 es una de las líneas celulares más utilizadas en la investigación de GBM. En ratas y ratones, se han reportado números celulares entre 5 x 104 y 5 x 106 para implantes intracraneales 27,28,29,30,31. Como regla general, cuando se implanta un mayor número de células, es de esperar un crecimiento tumoral más rápido. En este protocolo, se implantaron 1 x 105 células y se realizaron imágenes en los días 11 y 12 después de la implantación. Xin et al. implantaron 1 x 105 células C6 en ratones desnudos BALB/c e informaron haber detectado GBM avanzado en la resonancia magnética el día 7 después de la implantación y un aumento de la mortalidad después de 15 días30. En comparación, Jia et al. utilizaron un mayor número de células (1 x 106) y la misma cepa de ratón y detectaron una pequeña masa tumoral en el día 7 en la RM con una barrera hematoencefálica (BBB) ligeramente alterada, como lo demuestra una tinción azul de Evans pálida en el tejido GBM32. El día 14, la mancha azul de Evans fue más fuerte que el día 7, lo que indica que la BHE estaba muy alterada. A su vez, el crecimiento del tumor también afecta el tiempo que los animales pueden permanecer en el experimento. Esta es una consideración importante del bienestar animal para los estudios longitudinales de imagen. Se ha reportado que las ventanas craneales crónicas son adecuadas para la obtención de imágenes hasta 6 meses después de la implantación26.
Las nanopartículas utilizadas en este protocolo consisten en óxido de hierro y componentes de fluoróforos. Las posibles aplicaciones incluyen la investigación de la administración tumoral de nuevos fármacos terapéuticos, terapias celulares e intervenciones en la vasculatura tumoral y el microambiente tumoral. Se pueden evaluar diferentes candidatos a fármacos y terapias combinadas a nivel celular y molecular. El componente de óxido de hierro de las NP permite obtener imágenes multimodales con imágenes de resonancia magnética o partículas magnéticas, además de 2P-IVM. A pesar de que la RM representa una modalidad de imagen clínicamente relevante, su resolución anatómica es inferior a la de la microscopía intravital33.
Este método también tiene ciertas limitaciones. Las coordenadas cerebrales de acuerdo con un atlas cerebral de ratón están estandarizadas para ratones C57BL/6J y deben ajustarse en función de la cepa del ratón, el sexo y la edad. Además, con las imágenes de dos fotones, solo se puede acceder a una profundidad limitada de aproximadamente 450 μm9. Por lo tanto, solo es posible la caracterización parcial del tumor con 2P-IVM, y las diferencias regionales en las características del tumor podrían pasar desapercibidas. Además, solo se incluyeron dos momentos después de la administración de NP. Los estudios futuros, que incluyen más puntos de tiempo después de la administración intravenosa, permitirán un análisis más detallado del comportamiento espacio-temporal de las NP en el microambiente tumoral.
Para concluir, evaluamos la administración tumoral de nanopartículas de óxido de hierro marcadas con fluorescencia utilizando 2P-IVM en un modelo de ratón de GBM. Este método se puede modificar fácilmente para adaptarse a diversas áreas de investigación y representa una herramienta importante para la obtención de imágenes cerebrales in vivo en el campo de la neurociencia.

La microscopía intravital de dos fotones (2P-IVM) es una técnica de imagen por fluorescencia que permite la visualización de tejido vivo1.
Desarrollada por primera vez en la década de 1990, la 2P-IVM se ha utilizado para el análisis in vivo de la retina2, el riñón3, el intestino delgado4, la cóclea5, el corazón6, la tráquea7 y el cerebro en varios modelos preclínicos 8,9. En el campo de la neurociencia, la 2P-IVM ha cobrado importancia como técnica para la obtención de imágenes en tiempo real del cerebro sano en animales despiertos10, así como para el estudio de enfermedades del sistema nervioso como el Alzheimer11, el Parkinson12 y el glioblastoma (GBM)13,14,15,16.
2P-IVM ofrece una solución elegante para estudiar el microambiente tumoral durante el desarrollo de GBM. Mientras que algunos estudios anteriores se centraron en modelos in vitro17 y ex vivo 18, otros implementaron modelos ortotópicos19 y xenótropos20 in vivo para examinar la GBM. Madden et al. realizaron imágenes nativas de la línea celular de glioma de rata SNC-1 en un modelo de ratón13. Utilizando un modelo murino ortotópico GL261-DsRed, Ricard et al. realizaron una administración intravenosa de un fluoróforo para mejorar los vasos sanguíneos en la región tumoral en 2P-IVM14.
Aquí, aplicamos 2P-IVM para rastrear la administración tumoral de nanopartículas de óxido de hierro (NP) marcadas con fluorescencia en un modelo de ratón ortotópico de GBM. Utilizando una ventana craneal, este método nos permite estudiar en detalle la distribución espacio-temporal en tiempo real de las NP en el cerebro.

<table><tbody><tr><td>Solución de infusión de cloruro de sodio al 0,9%</td><td>Baxter Corp</td><td>533-JB1301P</td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Invitrogen</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>jeringas de 1 mL Jeringa</td><td>BD</td><td>Luer-Lok, REF309628</td><td></td></tr><tr><td>10%&nbsp; FBS</td><td>Thermo fisher</td><td>Cytiva SH30910.03HI</td><td></td></tr><tr><td>10% DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de 2 fotones</td><td>Prairie Technologies, Bruker</td><td>Prairie Ultima IV</td><td></td></tr><tr><td>Aplicadores de alcohol, 70%</td><td>Medline Industries, LP</td><td>MDS093810</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol, botella de spray</td><td>Decon Labs Inc</td><td>Decon SaniHol, 04-355-122</td><td></td></tr><tr><td>Papel de aluminio</td><td>Reynold</td><td>Brands Reynold Wrap papel de aluminio</td><td></td>antiadherente</tr><tr><td>Máquina de anestesia</td><td>Patterson Scientific</td><td>SAS3</td><td></td></tr><tr><td>Monitoreo de anestesia&nbsp;</td><td>Kent Scientific&nbsp;</td><td>MouseSTAT Jr. Roedor Pulsoxímetro</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-Antimicótico (100x), líquido</td><td>Invitrogen</td><td>15240-096</td><td></td></tr><tr><td>Aplicadores de Betadine</td><td>Professional Disposables International, Inc</td><td>S41125</td><td></td></tr><tr><td>Punzón de biopsia, 5 mm&nbsp;</td><td>Miltex</td><td>Tamaño 5</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina de liberación sostenida</td><td>Zoo Pharm</td><td>Bup SR Lab, 1.0 mg/mL</td><td>En su lugar, se puede usar un medicamento genérico.</td></tr><tr><td>Línea celular de glioma de rata C6</td><td>ATCC (American Tissue Culture Collection)</td><td>CCL-107</td><td></td></tr><tr><td>Cánulas</td><td>BD</td><td>16 G, 1.1/2", 30 G, 1"</td><td></td></tr><tr><td>Carprofeno</td><td>Pfizer &nbsp;</td><td>Rimadyl, 50 mg/ml</td><td>En su lugar, se puede utilizar un medicamento genérico.&nbsp;</td></tr><tr><td>Cefazoline</td><td>Sagent Pharmaceuticals</td><td>25021-101-10, 1 g/vial</td><td>En su lugar, se puede utilizar un medicamento genérico.</td></tr><tr><td>Filtro de células, 40 y micro; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>87711</td><td></td></tr><tr><td>Aplicadores de punta de algodón, 6" &nbsp;</td><td>Dyad Medical Sourcing, LLC</td><td>HCS1005</td><td></td></tr><tr><td>Cemento dental</td><td>Stoelting Co</td><td>51459</td><td>Kit de cemento dental, transparente, 2 componentes</td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Bimeda</td><td>138RX, 2 mg/mL</td><td>En su lugar, se puede utilizar un medicamento genérico.</td></tr><tr><td>DietGel</td><td>ClearH2O</td><td>Recuperación, 72-06-502</td><td></td></tr><tr><td>Drape&nbsp;</td><td>Taladro Cardinal Health</td><td>Bio Shield Wrap</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Saeyang</td><td>Microtech Escort Pro, B08350</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de perforación&nbsp;</td><td>Hager & Meissinger GmbH</td><td>REF310104001001005</td><td>Tamaño 005, EE. UU. 1/4</td></tr><tr><td>FIJI software de análisis</td><td>de imágenes Instituto Nacional de Salud</td><td>https://imagej.net/software/fiji/</td><td></td></tr> <tr><td>Pinzas</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-812-41</td><td></td></tr><tr><td>Gasa</td><td>Fisher HealthCare</td><td>Almohadilla de gasa de algodón estéril, 4 x 4", 22-415-469</td><td></td></tr><tr><td>Gelfoam&nbsp;</td><td>Ethicon Inc.&nbsp;</td><td>Esponja de gelatina absorbible Surgifoam, Ref. 1972</td><td></td></tr><tr><td>Germinador&nbsp;</td><td>Cellpoint Scientific&nbsp;</td><td>Germinator 500, N° 11688</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de vidrio, 5 mm de diámetro</td><td>Fisher Scientific</td><td>Menzel Cubreobjetos&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Guantes, no estériles</td><td>Fisher Scientific</td> Guantes <td></td><td>de reconocimiento médico sin polvo</td></tr><tr><td>Guantes estériles</td><td>Medline Industries, LP</td><td>MDS104070</td><td></td></tr><tr><td>Crema depilatoria</td><td>Church & Dwight</td><td>Nair Loción depiladora&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa Hamilton</td><td>Hamilton Company Inc</td><td>Gastight #1701, 10 &micro; L</td><td></td></tr><tr><td>HBSS sin Ca, Mg</td><td>Fisher Scientific PI88284</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Barra de cabeza</td><td>Hongway</td> 5 <td>mm de diámetro interior Juntas</td><td></td>tóricas</tr><tr><td>Almohadilla térmica</td><td>Stoelting Co.&nbsp;</td><td>Calentador de roedores X2</td><td></td></tr><tr><td>Jeringas de insulina</td><td>Exel International Medical Products&nbsp;</td><td>29G x 1/2 y Prime;</td><td></td></tr><tr><td>Nanopartículas de óxido de hierro</td><td>Covis Pharma GmbH</td><td>Feraheme ferumoxitol inyectable, 510 mg/17 mL, 59338077501</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Dechra</td><td>26675-46-7</td><td></td></tr><tr><td>Ratones</td><td>Jackson Laboratories</td><td>NSG, Microscopio de 005557</td><td></td>de cepas</tr><tr><td>(cirugía)</td><td>Seiler Medical</td><td>Seiler IQ Q-100-220</td><td></td></tr><tr><td>Nanopartículas</td><td>personalizadas</td><td></td><td>Nanopartículas de óxido de hierro (Ferumoxytol) marcadas con isotiocianato de fluoresceína</td></tr><tr><td>Pomada oftálmica</td><td>Principales productos farmacéuticos</td><td>Lubrifresh P.M. ungüento nocturno, 203964</td><td></td></tr><tr><td>Oxygen</td><td>Linde Gas & Equipo Inc.&nbsp;</td><td>Cilindro de acero de alta presión estilo K, 249CF, 2000PSIG, CGA 540</td><td></td></tr><tr><td>Vasos de plástico</td><td>Georgia-Pacirif Consumer Products</td><td>Vaso para porciones Dixie, 2 oz., Plástico, transparente, PK2400</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de polietileno</td><td>Braintree Scientific</td><td>50-195-5494</td><td></td></tr><tr><td>Escala</td><td>Ohaus Corp</td><td>CR2200</td><td></td></tr><tr><td>Bisturí</td><td>Integra Life Sciences Production Corp</td><td>Integra Miltex Bisturí desechable de acero inoxidable</td> Tijeras Fisher Scientific 13-804-18 Sellador Henkel Corp Loctite 4014 Bata de laboratorio de un solo uso High Tech Conversions 17-444-081 Marco estereotáctico Stoelting Co.&nbsp;<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Stoelting New Standard TM</td><td></td></tr><tr><td>Sistemas de filtración estéril de la parte superior</td> de la botella <td>al vacío Fisher Scientific</td><td>S2GPU05RE, MilliporeSigma NO.:S2GPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>Caja de espuma de poliestireno</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Guantes quirúrgicos</td><td>Cardinal Health</td><td>19-163-108</td><td></td></tr><tr><td>Pegamento quirúrgico, 3M Vetbond adhesivo para tejidos</td><td>3M Animal Care Prodcuts</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Tail catéter de vena</td><td>personalizado</td><td></td><td>Consta de dos cánulas de 30 G conectadas con un tubo de silicona&nbsp;</td></tr><tr><td>TrypLE Express (1x), rojo sin fenol</td><td>Invitrogen</td><td>12604-039</td><td></td></tr><tr><td>Antorcha ultravioleta</td><td>Tecnología de sol primaveral</td><td>Consciot</td><td></td></tr></tbody></table>

microscopía intravital de dos fotones de glioblastoma en un modelo murino

Two-Photon Intravital Microscopy of Glioblastoma in a Murine Model

La administración de terapias contra el cáncer administradas por vía intravenosa a los tumores cerebrales está limitada por la barrera hematoencefálica. Un método para obtener imágenes directas de la acumulación y distribución de macromoléculas en tumores cerebrales in vivo mejoraría en gran medida nuestra capacidad para comprender y optimizar la administración de fármacos en modelos preclínicos. Este protocolo describe un método para el seguimiento in vivo en tiempo real de nanopartículas marcadas con fluorescencia administradas por vía intravenosa con microscopía intravital de dos fotones (2P-IVM) en un modelo de ratón de glioblastoma (GBM).
El protocolo contiene una descripción de varios pasos del procedimiento, que incluye la anestesia y analgesia de animales de experimentación, la creación de una ventana craneal, la implantación de células GBM, la colocación de una barra en la cabeza, la realización de estudios 2P-IVM y la atención posquirúrgica para estudios de seguimiento a largo plazo. Mostramos sesiones representativas de imágenes 2P-IVM y análisis de imágenes, examinamos las ventajas y desventajas de esta tecnología y discutimos las posibles aplicaciones.
Este método puede modificarse y adaptarse fácilmente a diferentes preguntas de investigación en el campo de las imágenes cerebrales preclínicas in vivo .

Aquí, realizamos una cirugía de ventana craneal e injertamos células C6 en un modelo de ratón NSG de GBM (n = 5). Un sellado adecuado entre todos los componentes involucrados en la creación de la ventana (Figura 1A) garantizará la durabilidad de las ventanas para la obtención de imágenes a largo plazo y, además, reducirá la morbilidad. Utilizando la platina adaptada para 2P-IVM in vivo (Figura 2), pudimos obtener imágenes de animales bajo anestesia durante un máximo de 2 h sin ningún artefacto de movimiento importante. Aproximadamente 10 minutos después de la aplicación intravenosa de las nanopartículas en ratones portadores de GBM, 2P-IVM muestra la señal verde y fluorescente de los vasos en la región del tumor, consistente con la localización intravascular de las nanopartículas marcadas con FITC. Solo se observa una pequeña cantidad de señal verde-fluorescente fuera de los vasos sanguíneos, lo que indica el comienzo de la extravasación de NP (Figura 3A). Se observa un aumento de la señal FITC originada en el espacio extravascular, lo que está en línea con la extravasación avanzada (Figura 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66304/66304fig01.jpg"> Figura 1. Colocación de ventana craneal, craneotomía, implantación e imagenología. (A) Sección transversal de la ubicación anatómica de una ventana craneal. Dado que la barra de cabeza no contiene metales, es posible realizar imágenes por resonancia magnética o imágenes de partículas magnéticas, además de la microscopía intravital de dos fotones. (B) Visión general (fila superior) y vista detallada (fila inferior) de la craneotomía (izquierda), la implantación celular (centro) y la microscopía intravital de 2 fotones (derecha). Al abrir el cráneo, se produce una hemorragia superficial (izquierda) que se reabsorbe rápidamente (centro). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66304/66304fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66304/66304fig02.jpg"> Figura 2. Diseño asistido por ordenador (CAD) del escenario. CAD de la platina utilizada para la microscopía intravital in vivo de 2 fotones, que incluye una barra de mordida, estabilización de la barra de cabeza y tornillos para ajustes de altura y ángulo. El archivo CAD 3D se puede encontrar en el archivo de codificación suplementario 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66304/66304fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66304/66304fig03.jpg"> Figura 3. Imágenes in vivo de microscopía intravital de 2 fotones. Las imágenes se adquirieron (A) 10 min y (B) 24 h después de la administración intravenosa de nanopartículas. Mientras que las células GBM emiten señales fluorescentes en el espectro rojo (izquierda), las nanopartículas en el tejido cerebral se visualizan en verde (derecha). # indica NPs extravasadas, * indica un vaso sanguíneo. Solo un número limitado de partículas han sufrido extravasación y son visibles en las proximidades de las células tumorales 10 min después de la administración de NP. Se observa una gran cantidad de partículas en la región de las células GBM, lo que sugiere extravasación 24 h después de la administración de NP. Las nanopartículas consisten en isotiocianato de fluoresceína (FITC) y nanopartículas de óxido de hierro (Ferumoxitol). Las barras de escala representan 100 μm. Abreviaturas: 2P-IVM: microscopía intravital de 2 fotones, RFP: proteína fluorescente roja, GBM: glioblastoma, FITC: isotiocianato de fluoresceína, NP: nanopartículas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66304/66304fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Archivo de codificación suplementario 1: Archivo CAD 3D de la etapa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66304/custom%20stage%203D%20CAD.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Presentamos un enfoque novedoso para la microscopía de dos fotones de la administración tumoral de nanopartículas de óxido de hierro marcadas con fluorescencia al glioblastoma en un modelo de ratón.

Microscopía intravital de dos fotones de glioblastoma en un modelo murino

The delivery of intravenously administered cancer therapeutics to brain tumors is limited by the blood-brain barrier. A method to directly image the ...

El glioblastoma es uno de los cánceres cerebrales primarios más comunes y se asocia con un crecimiento rápido y una esperanza de vida baja. El desarrollo de terapias eficaces para el glioblastoma sigue siendo un reto importante, ya que la administración de terapias está limitada por la barrera hematoencefálica. Un método para obtener imágenes directas de la acumulación y distribución de macromoléculas en el cerebro mejoraría en gran medida nuestra capacidad para comprender y optimizar la administración de fármacos.La microscopía de dos fotones ofrece una solución elegante para estudiar la distribución en tiempo real de las nanopartículas en el modelo preclínico de glioblastoma. Al modificar la nanopartícula utilizada en este estudio, es posible investigar la administración de diferentes candidatos a fármacos y terapias combinadas a nivel celular y molecular. Además de la microscopía intravital de dos fotones, el componente de óxido de hierro de estas nanopartículas permite obtener imágenes multimodales con resonancia magnética o MPI.En el futuro, las instalaciones de diagnóstico por imágenes podrían servir para la detección precoz del cáncer, lo que conduciría a terapias más eficaces contra las neoplasias malignas. Un camino para lograrlo es fusionar la microscopía intravital de dos fotones con otras modalidades de imagen, como la tomografía por emisión de positrones y el ultrasonido fotoacústico.

two-photon-intravital-microscopy-of-glioblastoma-in-a-murine-model

Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Implantación intracraneal de GL261 células en ratones C57BL / 6 produce los gliomas malignos que recapitular muchas de las características del glioblastoma multiforme humano. Hemos utilizado GL261 células que expresan establemente la luciferasa que nos permita...

La implantación intracraneal con posterioridad 3D En Vivo Bioluminiscentes imagen de gliomas murino

Se describe un método integrado para la implantación precisa, estereotáctica de las células de glioblastoma multiforme en el cerebro de ratones desnudos y posterior...

La implantación estereotáctica intracraneal y<em&gt; En vivo</em&gt; Radiología bioluminiscente de xenoinjertos de tumores en un sistema modelo de ratón de glioblastoma multiforme

En este video, realizamos imágenes intravitales de células cancerosas preinyectadas en un modelo de ratón a través de una ventana craneal implantada. Esta técnica de imagen de lapso de tiempo de alta resolución permite el estudio del comportamiento dinámico de las células cancerosas en el ratón vivo.

Imágenes intravitales basadas en ventanas craneales en un modelo de ratón: una técnica de imagen para estudiar el comportamiento de las células cancerosas preinyectadas en el cerebro de un modelo murino

En este video, describimos la tomografía molecular de fluorescencia o FMT para la obtención de imágenes in vivo de xenoinjertos de glioblastoma marcados con proteínas fluorescentes en modelos de ratón. La técnica es útil para dilucidar los efectos de la terapéutica antitumoral a nivel molecular.

Tomografía molecular de fluorescencia: una técnica de imagen para la obtención de imágenes in vivo de xenoinjertos de glioblastoma marcados con proteínas fluorescentes en modelo de ratón

Fuente: Clark, A.J., et al. Imágenes de bioluminiscencia de un modelo animal inmunocompetente para el glioblastoma. J. Vis. Exp. (2016)Este video muestra imágenes de bioluminiscencia para rastrear la progresión del glioblastoma en un modelo de ratón inmunocompetente, utilizando células tumorales que expresan luciferasa y luciferina para cuantificar el crecimiento tumoral de forma no invasiva.

Imágenes de bioluminiscencia de un modelo de ratón inmunocompetente para el glioblastoma

Hemos establecido un modelo ortotópico de glioblastoma cortical en ratones para intravital microscopía de dos fotones que recapitula las limitaciones biofísicas normalmente en juego durante el crecimiento del tumor. Una ventana de cristal crónica reemplazando el cráneo por encima de la del tumor permite el seguimiento de la progresión del tumor con el tiempo por microscopía de dos fotones.

El mantenimiento de un modelo de ratón ortotópico Glioblastoma Restricciones cerebral parenquimatosa físicas y Conveniente para intravital microscopía de dos fotones

GL261 proporcionan un modelo animal inmunocompetente útil de glioblastoma. Los objetivos de este protocolo son demostrar las técnicas adecuadas para monitorizar el crecimiento tumoral intracraneal mediante imágenes de bioluminiscencia in vivo, y verificar la utilidad de las células GL261 modificadas con luciferasa para el estudio de la inmunología tumoral y los enfoques inmunoterapéuticos para el tratamiento del glioblastoma.

La bioluminiscencia de imágenes de un Modelo inmunocompetentes Animal para Glioblastoma

Ortotópico inyección intracraneal de células del tumor se ha utilizado en la investigación del cáncer para el estudio de la biología del tumor de cerebro, evolución, evolución y respuesta terapéutica. Presentamos la tomografía molecular fluorescencia de xenoinjertos tumorales, que proporciona en tiempo real imágenes intravital y cuantificación de un tumor masivo en modelos preclínicos de glioblastoma.

Tomografía Molecular de la fluorescencia para obtener imágenes In Vivo de xenoinjertos de Glioblastoma

Comprender el comportamiento maligno del cáncer requiere crear modelos precisos de cómo las células tumorales interactúan con los componentes del microambiente tumoral, como los macrófagos. En este trabajo describimos dos métodos para estudiar la interacción de las células del glioblastoma con los macrófagos asociados al tumor y la microglía, donde se evalúa el efecto sobre la invasión del glioblastoma.

Cocultivo Los ensayos para Estudiar macrófagos y microglia Estimulación de Glioblastoma Invasion

Este protocolo describe el uso de la microscopía multifotónica para realizar imágenes unicelulares de alta resolución a largo plazo del pulmón intacto en tiempo real utilizando una ventana de imagen estabilizada por vacío.

A largo plazo de alta resolución Microscopia intravital en el pulmón con una ventana de imagen vacío Estabilizado

Aprenda microscopía intravital de dos fotones para estudiar la distribución de nanopartículas en glioblastoma usando un modelo murino. Esta técnica permite visualizar en tiempo real el transporte terapéutico a través de la barrera hematoencefálica.

Microscopía intravital de dos fotones de glioblastoma en un modelo murino

Explorar más videos