Name: Un enfoque de clonación sin fisuras para la construcción de vectores de expresión del virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-17T14:15:00.000+00:00
Duration: 4 min 18 s
Description: Aprende a construir vectores de expresión complejos del PRRSV mediante clonación sin fisuras y recombinación homóloga in vitro. Este método permite incorporar múltiples fragmentos de ADN de manera eficiente.

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Este trabajo fue apoyado por el apoyo financiero de los fondos de iniciación de investigación doctoral proporcionados por la Universidad Normal Occidental de China (No. 20E059).

1. Preparación de la plantilla del gen PRRSV
<ol><li>Descongele el stock de virus en 1 mL de reactivo de extracción de ARN (consulte la tabla de materiales).</li>
	<li>Añadir 0,2 mL de cloroformo y mezclar bien. Incubar durante 3 min.</li>
	<li>Centrifugar la mezcla durante 15 min a 12.000 × g a 4 °C. NOTA: La mezcla se divide en tres fases, a saber, una fase acuosa incolora, una interfase y una fase de fenol-cloroformo rojo.</li>
	<li>Pipetear la fase acuosa incolora y transferirla a un nuevo tubo.</li>
	<li>Mezclar bien la fase acuosa con 0,5 mL de isopropanol e incubar durante 10 min a 4 °C.</li>
	<li>Centrifugar durante 10 min a 12.000 × g a 4 °C. NOTA: La parte inferior del tubo tiene un precipitado de ARN blanco.</li>
	<li>Utilice una micropipeta para desechar el sobrenadante del tubo.</li>
	<li>Agregue 1 mL de etanol al 75% para resuspender brevemente el pellet y el vórtice.</li>
	<li>Centrifugar durante 5 min a 7.500 × g a 4 °C. Utilice una micropipeta para desechar el sobrenadante del tubo.</li>
	<li>Seque el ARN durante 5 minutos, agregue 20-50 μL de agua libre de ARNasa para resuspender el ARN y mezcle bien.</li>
	<li>Proceda a realizar la transcripción inversa; configure las reacciones para realizar la transcripción inversa como se muestra en la Tabla 1. NOTA: Para garantizar el éxito de la transcripción inversa, utilice plantillas de ARN de alta calidad.</li>
	<li>Utilice el ADNc resultante para PCR o guárdelo a -20 °C.</li>
</ol>2. Diseño del cebador PCR
<ol><li>Diseño de la imprimación delantera<ol><li>Abra el software y elija Nuevo archivo de ADN.</li>
		<li>Pegue la secuencia del gen PRRSV (GenBank: FJ548852.1) del NCBI en el software. Haga clic en Aceptar para generar los archivos de secuencia.</li>
		<li>Analice la secuencia y marque las uniones de fragmentos. Diseñe el cebador de secuencia específica hacia adelante de los fragmentos. Para la mayoría de los casos, la temperatura de fusión preferible (Tm) está entre 55 °C y 62 °C, y el contenido de GC es del 40-60%.</li>
		<li>Haga clic en Imprimaciones y elija Agregar imprimación.</li>
		<li>Pegue la secuencia específica y agregue secuencias superpuestas del vector al primer nucleótido 5' del cebador de secuencia específica. Cerca de cada cruce, elija 20-40 pb para que sirva como región de superposición entre los dos fragmentos adyacentes.</li>
		<li>Asigne un nombre al cebador delantero que contiene los voladizos y la secuencia específica (consulte la Figura complementaria S1).</li>
		<li>Haga clic en Agregar imprimación a la plantilla.</li>
	</ol></li>
	<li>Diseño de la imprimación inversa<ol><li>Analice la secuencia y marque las uniones de fragmentos en el software. Diseñe el cebador de secuencia específica inversa de los fragmentos.</li>
		<li>Haga clic en Imprimaciones y elija Agregar imprimación.</li>
		<li>Pegue la secuencia específica y agregue el sitio de restricción al primer nucleótido 5' del cebador de secuencia específica. NOTA: Los sitios de restricción agregados deben estar ausentes del fragmento de inserción y del vector, excepto en los sitios de clonación múltiples.</li>
		<li>Agregue secuencias de voladizo de vectores de 20 a 40 pb al primer nucleótido 5' del sitio de restricción.</li>
		<li>Asigne un nombre al cebador inverso que contiene los voladizos y la secuencia específica (consulte la Figura complementaria S1).</li>
		<li>Haga clic en Agregar imprimación a la plantilla.</li>
	</ol></li>
</ol>3. PCR para amplificar fragmentos
<ol><li>Configure seis reacciones individuales de PCR (Tabla 2): para el fragmento 1, utilice los cebadores P1 y P2 (véase la Figura complementaria S2); para el fragmento 2, utilice los cebadores P3 y P4 (véase la Figura Suplementaria S2); para el fragmento 3, utilice los cebadores P5 y P6 (véase la Figura Suplementaria S2); para el fragmento 4, utilice los cebadores P7 y P8 (véase la Figura Suplementaria S2); para el fragmento 5, utilice los cebadores P9 y P10; y utilice los cebadores P11 y P12 para amplificar el fragmento 6 (véase la Figura suplementaria S2). NOTA: Descongele, mezcle y centrifugue brevemente cada componente antes de usarlo.</li>
	<li>Ejecute la PCR utilizando el protocolo de tres pasos de la Tabla 2.</li>
	<li>Agregue 1 μL de tampón de carga de ADN 6x a 5 μL de producto de PCR, mezcle y centrifugue brevemente el contenido.</li>
	<li>Analice las muestras mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%.</li>
</ol>4. Purificación de los fragmentos de PCR
NOTA: La purificación de los productos de PCR de un gel utilizando un kit de extracción de gel (ver Tabla de Materiales) es importante para la construcción de vectores.
<ol><li>Agregue 9 μL de tampón de carga de ADN 6x a 45 μL de productos de PCR, mezcle y centrifugue brevemente el contenido.</li>
	<li>Realizar electroforesis en gel de agarosa al 1% para separar los fragmentos de ADN. NOTA: No reutilice el tampón de ejecución TAE, ya que su valor de pH afectará la recuperación de fragmentos de ADN.</li>
	<li>Una vez separadas adecuadamente las bandas, utilice un bisturí afilado para extirpar cuidadosamente las bandas de ADN. NOTA: Minimice el tamaño de la rebanada de gel recortando el exceso de agarosa.</li>
	<li>Pesar la rodaja de gel en un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 mL, añadir un volumen igual de tampón aglutinante a la rodaja de gel (por ejemplo, de 0,3 mL a una rodaja de 0,3 g) e incubar a 60 °C durante 7 min.</li>
	<li>Inserte una mini columna en un tubo de recolección de 2 ml. Añadir 700 μL de solución de ADN/agarosa del paso 4.4 a la minicolumna.</li>
	<li>Centrifugar a 10.000 × g durante 1 min a temperatura ambiente. Deseche el filtrado y reutilice el tubo de recolección.</li>
	<li>Añadir 300 μL de tampón aglutinante y centrifugar a 13.000 × g durante 1 min a temperatura ambiente. Deseche el filtrado y reutilice el tubo de recolección.</li>
	<li>Añadir 700 μL de tampón de lavado y centrifugar a 13.000 × g durante 1 min a temperatura ambiente. Deseche el filtrado y reutilice el tubo de recolección.</li>
	<li>Gire la minicolumna vacía durante 2 minutos a velocidad máxima para secar la matriz de la columna. Coloque la mini columna en un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 mL.</li>
	<li>Añadir 20 μL de agua desionizada directamente en el centro de la membrana de la columna y dejar reposar a temperatura ambiente durante 2 min. Centrifugar a velocidad de 13.000 × g durante 1 min.</li>
	<li>Almacene el ADN a -20 °C.</li>
</ol>5. Preparación de un vector linealizado
NOTA: Después de preparar el plásmido, se pueden utilizar las enzimas seleccionadas para cortarlo. La digestión prolongada o la digestión de doble enzima es crucial para garantizar la digestión de todo el ADN. Esto reducirá el número de clones falsos positivos en experimentos posteriores.
<ol><li>Linealización pVAX1
	<ol><li>Prepare la mezcla de reacción a temperatura ambiente en el orden indicado (Tabla 3). NOTA: Se debe agregar el volumen de agua para mantener el volumen total de reacción indicado. Aquí, 1 μg del plásmido se digirió con enzimas en la mezcla de reacción. Dependiendo de la concentración del plásmido, el volumen del plásmido se puede ajustar en la mezcla de reacción.</li>
		<li>Mezclar suavemente; luego gire hacia abajo. Incubar a 37 °C en un bloque de calor o termostato de agua durante 60 min.</li>
		<li>Realizar una purificación en gel similar a la purificación de los fragmentos de PCR de la sección 4 utilizando el kit de extracción en gel (ver Tabla de Materiales).</li>
	</ol></li>
	<li>Linealización pVAX1-F1 NOTA: pVAX1-F1 es el vector obtenido de la primera ronda de pVAX1 (NdeI y HindIII) y la recombinación del fragmento 1. pVAX1-F2 es el vector obtenido a partir de la recombinación de pVAX1-F1 (NdeI) y fragmento 2. pVAX1-F3 es el vector obtenido a partir de la ronda de recombinación de pVAX1-F2 (NdeI) y fragmento 3. pVAX1-F4 es el vector obtenido a partir de la recombinación de pVAX1-F3 (NdeI) y fragmento 4. pVAX1-F5 es el vector obtenido de la ronda de recombinación de pVAX1-F4 (EcoRV y NtoI) y el fragmento 5.<ol><li>Para cada vector, prepare la mezcla de reacción por separado a temperatura ambiente en el orden indicado (Tabla 3).</li>
		<li>Mezclar suavemente; luego gire hacia abajo. Incubar a 37 °C en un bloque de calor o termostato de agua durante 60 min.</li>
		<li>Realizar una purificación en gel similar a la purificación de los fragmentos de PCR de la sección 4 utilizando el kit de extracción en gel (ver Tabla de Materiales).</li>
	</ol></li>
</ol>6. Subclonación a un nuevo vector
NOTA: Se puede lograr una buena eficiencia de clonación cuando se utilizan 50-200 ng de vector e insertos.
<ol><li>Configure la clonación sin interrupciones de ExonArt y la reacción de ensamblaje (Tabla 4). Ajuste el volumen total de reacción a 10 μL utilizando H2O desionizado esterilizado y mezcle.</li>
	<li>Incubar la reacción en un termociclador durante 15-60 min a 50 °C. Guarde las muestras en hielo. NOTA: Extender la incubación hasta 60 minutos puede mejorar la eficiencia del ensamblaje.</li>
	<li>Descongele células DH5α químicamente competentes en hielo.</li>
	<li>Añadir 10 μL del producto de montaje a las células competentes; A continuación, mezcle suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo.</li>
	<li>Coloca la mezcla en hielo durante 30 min.</li>
	<li>Choque térmico a 45 °C durante 45 s y transferencia de los tubos a hielo durante 3 min.</li>
	<li>Añada 900 μL de medio SOC al tubo.</li>
	<li>Agite el tubo a 225 rpm durante 1 h en una incubadora agitadora a 37 °C.</li>
	<li>Centrifugar la reacción de transformación a 6.000 × g durante 2 min. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 100 μL de medio SOC fresco.</li>
	<li>Extienda la suspensión celular transformada en una placa LB separada con 50 μg/mL de kanamicina.</li>
	<li>Incubar todas las placas durante la noche a 37 °C. Escoja colonias aisladas individuales de cada placa experimental.</li>
</ol>7. Análisis de los transformadores
<ol><li>Elija ocho colonias en 20 μL de medio LB que contenga 50 μg/mL de kanamicina.</li>
	<li>Configure la reacción de PCR de la colonia y ejecute la PCR (Tabla 5). NOTA: Para la reacción de PCR de colonias para el fragmento 1, utilice los cebadores P1 y P2 (consulte el archivo complementario 1); para el fragmento 2, utilice los cebadores P3 y P4 (véase el Archivo Suplementario 1); para el fragmento 3, utilice los cebadores P5 y P6 (véase el Archivo Suplementario 1); para el fragmento 4, utilice los cebadores P7 y P8 (véase la Figura Suplementaria S2); para el fragmento 5, utilice los cebadores P9 y P10; y utilizar los cebadores P11 y P12 para detectar el fragmento 6 (véase la figura suplementaria S2).</li>
	<li>Agregue 1 μL de tampón de carga de ADN 6x a 5 μL del producto de PCR, mezcle y centrifugue brevemente el contenido.</li>
	<li>Analice los resultados utilizando electroforesis en gel de agarosa al 1%.</li>
	<li>Seleccione una colonia positiva en 5 mL de medio LB que contenga 50 μg/mL de kanamicina y crezca durante la noche a 37 °C.</li>
	<li>Obtenga el plásmido utilizando un mini kit de ADN plasmídico (consulte la Tabla de materiales) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Visualice los resultados utilizando electroforesis en gel de agarosa al 1%.</li>
</ol>

Clonación del gen PRRSV de longitud completa en el vector de expresión pVAX1

<ol><li>Lessard, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning.</a> Methods Enzymol. 529, 85-98 (2013).</li>
<li>Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+BioBrick+vectors+from+BioBrick+parts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Eng%22%5BJournal%5D)">Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts.</a> J. Biol. Eng. 2, 5(2008).</li>
<li>Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+splicing+by+overlap+extension%3A+tailor-made+genes+using+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction.</a> Biotechniques. 54 (3), 129-133 (2013).</li>
<li>Horton, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR-mediated+recombination+and+mutagenesis.+SOEing+together+tailor-made+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">PCR-mediated recombination and mutagenesis. SOEing together tailor-made genes.</a> Mol Biotechnol. 3 (2), 93-99 (1995).</li>
<li>Bang, D., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+synthesis+by+circular+assembly+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Gene synthesis by circular assembly amplification.</a> Nat. Methods. 5 (1), 37-39 (2008).</li>
<li>Geu-Flores, F., Nour-Eldin, H. H., Nielsen, M. T., Halkier, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((USER+fusion%3A+a+rapid+and+efficient+method+for+simultaneous+fusion+and+cloning+of+multiple+PCR+products%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">USER fusion: a rapid and efficient method for simultaneous fusion and cloning of multiple PCR products.</a> Nucleic Acids Res. 35 (7), e55(2007).</li>
<li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+overlapping+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments.</a> Methods Enzymol. 498, 349-361 (2011).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Cho, J. G., Dee, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Porcine reproductive and respiratory syndrome virus.</a> Theriogenology. 66 (3), 655-662 (2006).</li>
<li>Holtkamp, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+economic+impact+of+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+on+United+States+pork+producers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Swine+Health+Prod%22%5BJournal%5D)">Assessment of the economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome virus on United States pork producers.</a> J. Swine Health Prod. 21, 72-84 (2013).</li>
<li>Thomann, B., Rushton, J., Schuepbach-Regula, G., Nathues, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+economic+effects+of+vaccination+against+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome%3A+Impact+of+vaccination+effectiveness%2C+vaccine+price%2C+and+vaccination+coverage%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Vet+Sci%22%5BJournal%5D)">Modeling economic effects of vaccination against porcine reproductive and respiratory syndrome: Impact of vaccination effectiveness, vaccine price, and vaccination coverage.</a> Front Vet Sci. 7, 500(2020).</li>
<li>Dwivedi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+immune+responses+to+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+in+pigs+during+early+stage+of+infection+under+farm+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">Evaluation of immune responses to porcine reproductive and respiratory syndrome virus in pigs during early stage of infection under farm conditions.</a> Virol J. 9, 45(2012).</li>
<li>Mengeling, W. L., Lager, K. M., Vorwald, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+consequences+of+exposing+pregnant+gilts+to+strains+of+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+%28PRRS%29+virus+isolated+from+field+cases+of+%26%2334%3Batypical%26%2334+PRRS%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Vet.+Res%22%5BJournal%5D)">Clinical consequences of exposing pregnant gilts to strains of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus isolated from field cases of &#34;atypical&#34 PRRS.</a> Am. J. Vet. Res. 59 (12), 1540-1544 (1998).</li>
<li>Dee, S. A., Joo, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+the+spread+of+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+in+endemically+infected+pig+herds+by+nursery+depopulation%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Rec%22%5BJournal%5D)">Prevention of the spread of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in endemically infected pig herds by nursery depopulation.</a> Vet Rec. 135 (1), 6-9 (1994).</li>
<li>Dee, S. A., Joo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+to+control+PRRS%3A+a+summary+of+field+and+research+experiences%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Strategies to control PRRS: a summary of field and research experiences.</a> Vet Microbiol. 55 (1-4), 347-343 (1997).</li>
<li>Renukaradhya, G. J., Meng, X. J., Calvert, J. G., Roof, M., Lager, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+vaccines%3A+Current+status+and+future+direction%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Live porcine reproductive and respiratory syndrome virus vaccines: Current status and future direction.</a> Vaccine. 33 (33), 4069-4080 (2015).</li>
<li>Conzelmann, K. K., Visser, N., Woensel, P. V., Thiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus%2C+a+member+of+the+arterivirus+group%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of porcine reproductive and respiratory syndrome virus, a member of the arterivirus group.</a> Virology. 193 (1), 329-339 (1993).</li>
<li>Han, M. Y., Yoo, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+PRRS+virus+genome%3A+Updates+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Engineering the PRRS virus genome: Updates and perspectives.</a> Vet Microbiol. 174 (3), 279-295 (2014).</li>
<li>Bryksin, A. V., Matsumura, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overlap+extension+PCR+cloning%3A+a+simple+and+reliable+way+to+create+recombinant+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Overlap extension PCR cloning: a simple and reliable way to create recombinant plasmids.</a> Biotechniques. 48 (6), 463-465 (2010).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restriction-based+multiple-fragment+assembly+strategy+to+avoid+random+mutation+during+long+cDNA+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Restriction-based multiple-fragment assembly strategy to avoid random mutation during long cDNA cloning.</a> J Cancer. 6 (7), 632-635 (2015).</li>
<li>Zhang, Z. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+economic+impact+of+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+outbreak+in+four+Chinese+farms%3A+Based+on+cost+and+revenue+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Vet+Sci%22%5BJournal%5D)">The economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome outbreak in four Chinese farms: Based on cost and revenue analysis.</a> Front Vet Sci. 9, 1024720(2022).</li>
<li>Chen, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+genetic+diversity+of+Chinese+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+viruses+from+2016+to+2019%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Vet+Sci%22%5BJournal%5D)">High genetic diversity of Chinese porcine reproductive and respiratory syndrome viruses from 2016 to 2019.</a> Res Vet Sci. 131, 38-42 (2020).</li>
<li>Wang, X. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salidroside%2C+a+phenyl+ethanol+glycoside+from+Rhodiola+crenulata%2C+orchestrates+hypoxic+mitochondrial+dynamics+homeostasis+by+stimulating+Sirt1%2Fp53%2FDrp1+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ethnopharmacol%22%5BJournal%5D)">Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling.</a> J Ethnopharmacol. 293, 115278(2022).</li>
<li>Hou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salidroside+intensifies+mitochondrial+function+of+CoCl2-damaged+HT22+cells+by+stimulating+PI3K-AKT-MAPK+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Phytomedicine%22%5BJournal%5D)">Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway.</a> Phytomedicine. 109, 154568(2023).</li>
<li>Zhang, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+an+infectious+clone+of+HuN4-F112%2C+an+attenuated+live+vaccine+strain+of+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+high+copy+plasmid%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">Generation of an infectious clone of HuN4-F112, an attenuated live vaccine strain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus high copy plasmid.</a> Virol J. 8, 410(2011).</li>
<li>Ni, Y. Y., Huang, Y. W., Cao, D. J., Opriessnig, T., Meng, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+DNA-launched+infectious+clone+for+a+highly+pneumovirulent+strain+of+type+2+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus%3A+identification+and+in+vitro+and+in+vivo+characterization+of+a+large+spontaneous+deletion+in+the+nsp2+region%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Res%22%5BJournal%5D)">Establishment of a DNA-launched infectious clone for a highly pneumovirulent strain of type 2 porcine reproductive and respiratory syndrome virus: identification and in vitro and in vivo characterization of a large spontaneous deletion in the nsp2 region.</a> Virus Res. 160 (1-2), 264-273 (2011).</li>
</ol>

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

La técnica de ensamblaje de Gibson es un método de clonación molecular basado en la recombinación in vitro para el ensamblaje de fragmentos de ADN8. Este método permite el ensamblaje de múltiples fragmentos de ADN en un plásmido circular en una reacción isotérmica de un solo tubo. Sin embargo, uno de los obstáculos para la técnica de ensamblaje de Gibson es la adquisición de fragmentos largos de ADNc. Los fragmentos largos son difíciles de amplificar con precisión por muchas razones. Por ejemplo, los cebadores son más fáciles de desajustar durante largos períodos de extensión, el ADNc puede no ser de buena calidad o las regiones ricas en GC detendrán la polimerización del ADN. Cuando el fragmento completo no se puede obtener fácilmente a partir del ADNc mediante PCR, el fragmento completo debe dividirse en varios fragmentos para su amplificación. Sin embargo, a medida que aumenta el número y la longitud de los fragmentos de ADN insertados, la eficiencia y los clones positivos del ensayo de recombinación homóloga también disminuirán significativamente. Por lo tanto, probamos una solución alternativa mediante la introducción de sitios de restricción adecuados en el extremo de 3' de los insertos. Luego, podríamos linealizar el vector y unir los fragmentos de ADN en el vector uno por uno a través de la tecnología de recombinación homóloga y eliminar los sitios de restricción no deseados a través de la reacción de recombinación homóloga.
Como uno de los patógenos económicamente más importantes en los mercados mundiales, el PRRSV siempre ha atraído la atención de los investigadores durante los últimos 30 años 10,21,22. Es un virus de ARN de cadena positiva, de aproximadamente 15 kb de longitud, y el fragmento largo de ADN no se puede amplificar fácilmente a partir del ADNc. Por lo tanto, para investigar si este método se puede utilizar para la clonación de fragmentos largos, empleamos el PRRSV como plantilla para la clonación del genoma completo. En este estudio, dividimos la secuencia completa en seis fragmentos y añadimos sitios de restricción apropiados al cebador inverso, obteniendo seis fragmentos por PCR. A continuación, obtuvimos con éxito el vector de expresión pVAX1-PRRSV de longitud completa mediante varias rondas de reacciones de recombinación. Además, el vector de expresión de PRRSV construido puede servir como plantilla para la transcripción in vitro con el fin de obtener ARN tapados para la transfección o la investigación de vacunas de ARNm. Mientras tanto, el plásmido de virus de ARNm construido se puede utilizar para el cribado por lotes de compuestos naturales antivirales in vitro mediante técnicas de interacción molecular, como la resonancia de plasmón de superficie23,24. El plásmido pVAX1 cumple con los requisitos porque un ensayo de transcripción in vitro requiere un plásmido de alta copia con un promotor T7. Además, el plásmido pVAX1-PRRSV que contiene el promotor de CMV puede transfectarse en células BHK-21 para la expresión del genoma viral25,26.
En resumen, con este protocolo, demostramos que los genes largos de longitud completa se pueden dividir en varios fragmentos obtenidos por amplificación por PCR. Es importante que los cebadores inversos se introduzcan en los sitios de restricción apropiados para que el vector de expresión génica de longitud completa pueda obtenerse mediante varias rondas de reacciones de recombinación. Este método se puede utilizar para genes de longitud completa que no se pueden obtener directamente mediante una sola PCR o para genes de longitud completa que no se pueden obtener mediante la recombinación homóloga de múltiples inserciones. Por lo tanto, este enfoque es un complemento importante a la técnica de ensamblaje de Gibson, anticipamos que puede ser ampliamente utilizada para la clonación de fragmentos largos de ADN y la construcción de genes de fusión.

Como técnica esencial para construir herramientas experimentales basadas en ADN para su expresión en células procariotas y eucariotas, la clonación molecular es un componente muy importante de la biología experimental. La clonación molecular implica cuatro procesos: la adquisición del ADN del inserto, la ligadura del inserto en el vector apropiado, la transformación del vector recombinante en Escherichia coli (E. coli) y la identificación de los clones positivos1. Hasta ahora, se han adoptado múltiples métodos para unir moléculas de ADN mediante el uso de enzimas de restricción 2,3 y recombinación mediada por PCR 4,5,6. La recombinación homóloga, conocida como tecnología de clonación sin fisuras, es el grupo de métodos de clonación que permite la inserción independiente de la secuencia y sin cicatrices de uno o más fragmentos de ADN en un vector. Esta tecnología incluye la clonación independiente de la secuencia y la ligadura (SLIC), el extracto de clonación de ligadura sin costuras (SLiCE), la infusión y el ensamblaje de Gibson. Emplea una exonucleasa para degradar una hebra del inserto y un vector para generar extremos cohesivos, y reparación in vivo o recombinación in vitro para unir covalentemente el inserto al vector formando enlaces fosfodiéster. La capacidad de unir un solo inserto a un vector en cualquier secuencia sin cicatrices es muy atractiva. Además, la tecnología tiene la capacidad de unir de 5 a 10 fragmentos en un orden predeterminado sin restricciones de secuencia.
Como una de las muchas técnicas de ADN recombinante, la técnica de ensamblaje de Gibson, actualmente el método de clonación más eficaz 7,8, es un método robusto y elegante basado en exonucleasas para ensamblar uno o varios fragmentos de ADN linealizados sin problemas. La reacción de ensamblaje de Gibson se realiza en condiciones isotérmicas utilizando una mezcla de tres enzimas, a saber, 5' exonucleasa, polimerasa de alta fidelidad y una ADN ligasa termoestable. Los salientes de una sola cadena 3' creados por la exonucleasa 5'-3' contribuyen al recocido de fragmentos que comparten complementariedad en un extremo. La polimerasa de alta fidelidad llena eficazmente los huecos en las regiones de una sola cadena recocidas mediante la adición de dNTP, y la ADN ligasa termoestable sella las muescas para formar moléculas de ADN conjuntas8. De ahí que este método técnico haya sido ampliamente utilizado para la construcción de vectores de expresión génica.
El síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS, por sus siglas en inglés) es una enfermedad viral que provoca deterioro reproductivo e insuficiencia respiratoria en cerdos causada por el PRRSV a cualquier edadde 9 años. El síndrome se manifiesta como fiebre, anorexia, neumonía, letargo, depresión y dificultad respiratoria. Además, en algunas epidemias se han observado signos clínicos, como la decoloración roja/azul de las orejas. Como miembro de la familia de los arterivirus, el PRRSV se transmite ampliamente a los países productores de carne de cerdo por contacto directo e intercambio de fluidos, como orina, calostro y saliva. Debido a la propagación del PRRSV en los Estados Unidos, las pérdidas económicas totales de la industria porcina se han estimado en aproximadamente 664 millones de dólares por año, sobre la base de la escala de cría de 5,8 millones de cerdas y 110 millones de cerdos10,11. El informe del Servicio de Inspección de Sanidad Agropecuaria muestra que el 49,8% de los cerdos no vacunados muestran la presencia de PRRSV en suero12 y los niveles bajos de PRRSV en cerdos infectados se excretan a través de la saliva, las secreciones nasales, la orina y las heces13. Se han implementado múltiples estrategias para controlar la propagación del PRRSV 14,15,16. Además de los procedimientos de eliminación para crear poblaciones completamente negativas para el virus o mejorar la bioseguridad y la gestión, la administración de vacunas es un medio eficaz para controlar el PRRS.
El PRRSV es un virus de ARN monocatenario con envoltura y sentido positivo con una longitud de aproximadamente 15 kilobases (kb). El genoma del PRRSV consta de al menos 10 marcos de lectura abiertos (ORF), una región corta no traducida de 5' (5' UTR) y una cola de poli(A) en el extremo 3' (Figura 1A)17. El genoma de un virus de ARN de cadena negativa no es infeccioso, mientras que el genoma de los virus de ARN de cadena positiva es infeccioso. Existen dos estrategias principales para la transfección de ARN y ADN para generar la progenie del virus18. Sin embargo, la clonación del fragmento completo correspondiente al genoma de ARN es crucial para la construcción de clones infecciosos. Debido a la naturaleza larga y compleja del genoma del PRRSV, el genoma completo no se puede obtener fácilmente mediante PCR de una sola vez. Además, aunque la síntesis artificial de genes PRRSV es una solución eficaz, la síntesis de fragmentos largos suele ser costosa. Por lo tanto, para obtener el vector de expresión de longitud completa PRRSV, intentamos crearlo mediante el método de recombinación homóloga de inserciones múltiples19,20. Desafortunadamente, no pudimos obtener el vector de expresión génica de longitud completa. Por lo tanto, en este estudio, añadimos sitios de restricción apropiados al cebador inverso y obtuvimos con éxito el vector de expresión pVAX1-PRRSV mediante varias rondas de reacciones de recombinación homólogas. Además, este método también puede lograr la deleción o mutación de genes objetivo y unir de manera eficiente un gran número de fragmentos de ADN al vector de expresión.

<table><tbody><tr><td>1 kb más Escalera de ADN</td><td>Tiangen Biochemical Technology (Beijing) Co., Ltd</td><td>MD113-02</td><td></td></tr><tr><td>2x Universal Green PCR Master Mix</td><td>Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd</td><td>A303-1</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga de sobremesa</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; Co., Ltd</td><td>FRESCO17</td><td></td></tr><tr><td>Banco limpio</td><td>Sujing Antai Air Technology&nbsp; Co., Ltd</td><td>VD-650-U</td><td></td></tr><tr><td>Equipo de electroforesis de ADN</td><td>Cleaver Scientific&nbsp; Co., Ltd</td><td>170905117</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de carga de ADN (6x)</td><td>Biosharp Biotechnology Co., Ltd</td><td>BL532A</td><td></td></tr><tr><td>E. Z. N. A. Kit de extracción de gel</td><td>Omega Bio-Tek Co., Ltd</td><td>D2500-01</td><td></td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Mini kit de ADN plasmídico I</td><td>Omega Bio-Tek Co., Ltd</td><td>D6943-01</td><td></td></tr><tr><td>Cultivador de temperatura estacionaria con electrocalentamiento</td><td>Shanghai Hengyi Scientific Instrument Co., Ltd</td><td>DHP-9082</td><td></td></tr><tr><td>ExonArt Kit de clonación y ensamblaje sin costuras</td><td>Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd</td><td>A101-02</td><td></td></tr><tr><td>ExonScript RT SuperMix con dsDNase</td><td>Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd</td><td>A502-1</td><td></td></tr><tr><td>FastDigest Eco321 (EcoRV)</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; Co., Ltd</td><td>FD0303</td><td></td></tr><tr><td>FastDigest HindIII</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; Co., Ltd</td><td>FD0504</td><td></td></tr><tr><td>FastDigest NheI</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; Co., Ltd</td><td>FD0974</td><td></td></tr><tr><td>FastDigest NotI</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; Co., Ltd</td><td>FD0596</td><td></td></tr><tr><td>Gel Doc XR</td><td>Bio-Rad Laboratories Co., Ltd</td><td>721BR07925</td><td></td></tr><tr><td>Goldview Tinción de gel de ácido nucleico</td><td>Shanghai Yubo Biotechnology Co., Ltd</td><td>YB10201ES03</td><td></td></tr> máquina <tr><td>de fabricación de hielo</td><td>Shanghai Bilang Instrument Manufacturing Co., Ltd</td><td>FMB100</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Platino SuperFi II ADN polimerasa</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; Co., Ltd</td><td>12361010</td><td></td></tr><tr><td>Placa de agar LB (Kanamicina)</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>B530113-0010</td><td></td></tr><tr><td>LB medio líquido estéril (Kanamicina)</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>B540113-0001</td><td></td></tr><tr><td>Micropipetas</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; Co., Ltd</td><td>&mdash;</td><td></td></tr><tr><td>Horno de microondas</td><td>Panasonic Electric (China) Co., Ltd</td><td>NN-GM333W</td><td></td></tr><tr><td>Agitadores orbitales</td><td>Shanghai Zhicheng Analytical Instrument Manufacturing Co., Ltd</td><td>ZHWY-2102C</td><td></td></tr><tr><td>Virus PRRSV</td><td>Universidad Agrícola de Sichuan</td><td>&mdash;</td><td></td></tr><tr><td>SnapGene</td><td>GSL Biotech, LLC</td><td>v5.1</td><td>Para diseñar cebadores</td></tr><tr><td>T100 PCR Gradient Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad Laboratories&nbsp; Co., Ltd</td><td>T100 Thermal Cycler</td><td></td></tr><tr><td>TAE</td><td>buffer Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>B040123-0010</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo TRIzol</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; Co., Ltd</td><td>Reactivo de extracción de ARN</td> <td>15596026</td></tr></tbody></table>

un enfoque de clonación sin fisuras para la construcción de vectores de expresión del virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino

A Seamless Cloning Approach for Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Expression Vector Construction

La construcción de vectores de expresión génica es un componente importante del trabajo de laboratorio en biología experimental. Con avances técnicos como el ensamblaje de Gibson, la construcción vectorial se vuelve relativamente simple y eficiente. Sin embargo, cuando el genoma completo del virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRSV) no puede amplificarse fácilmente mediante una sola reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a partir del ADNc, o es difícil adquirir un vector de expresión génica de longitud completa mediante la recombinación homóloga de múltiples inserciones in vitro, la técnica actual de ensamblaje de Gibson no logra este objetivo.
En consecuencia, nos propusimos dividir el genoma del PRRSV en varios fragmentos e introducir sitios de restricción apropiados en el cebador inverso para obtener fragmentos amplificados por PCR. Después de unir el fragmento de ADN anterior en el vector mediante tecnología de recombinación homóloga, el nuevo vector adquirió el sitio de escisión de la enzima de restricción. Por lo tanto, podemos linealizar el vector utilizando el sitio de escisión de la enzima recién agregado e introducir el siguiente fragmento de ADN aguas abajo del fragmento de ADN aguas arriba.
Se eliminará el sitio de escisión de la enzima de restricción introducido en el extremo 3' del fragmento de ADN aguas arriba, y se introducirá un nuevo sitio de escisión en el extremo 3' del fragmento de ADN aguas abajo. De esta forma, podemos unir fragmentos de ADN al vector uno a uno. Este método es aplicable para construir con éxito el vector de expresión PRRSV y es un método eficaz para ensamblar un gran número de fragmentos en el vector de expresión.

En este artículo, presentamos un sistema de recombinación in vitro para ensamblar y reparar moléculas de ADN superpuestas utilizando el cebador inverso a través de sitios de restricción introducidos continuamente (Figura 1B). Este sistema es un procedimiento simple y eficiente que comprende la preparación del vector lineal y los fragmentos de inserto que contienen voladizos introducidos por PCR con cebadores que tienen secuencias de extensión 5' y sitios de restricción apropiados; una reacción isotérmica única in vitro y la transformación química estándar de los productos de recombinación en bacterias huésped adecuadas; y la selección de una colonia positiva y la obtención del vector recombinante para la siguiente ronda de clonación. Para obtener el vector pVAX1-PRRSV paso a paso, deben estar ausentes sitios de restricción de los insertos y múltiples sitios de clonación del vector recombinante.
Dado que es difícil obtener secuencias genéticas completas y complejas con una sola PCR, los fragmentos de PRRSV solo pudieron amplificarse con seis reacciones de PCR (Figura 1C). Durante la primera ronda de recombinación, el fragmento 1 de PRRSV se insertó con éxito en el vector pVAX1, y el nuevo plásmido recombinante con los sitios de restricción introducidos (NheI, un sitio de escisión de una sola enzima) se denominó pVAX1-F1 (Figura 1D). En la segunda ronda de recombinación, el vector pVAX1-F1 se linealizó con la enzima de restricción NheI. El fragmento 2 se insertó con éxito en el vector pVAX1-F1, produciendo el plásmido recombinante pVAX1-F2 con sitios de restricción (NheI, un solo sitio de escisión de la enzima) (Figura 1D). Para la tercera ronda de recombinación, como se muestra en la Figura 1D, el fragmento 3 se insertó con éxito en el vector pVAX1-F2 para obtener pVAX1-F3 con sitios de restricción (NheI, un sitio de escisión de una sola enzima). En la cuarta ronda de recombinación, obtuvimos el vector pVAX1-F4 introduciendo el fragmento 4 con los sitios de restricción EcoRV (un solo sitio de escisión de la enzima). A continuación, el vector pVAX1-F4 fue linealizado por la enzima de restricción EcoRV y NotI. El fragmento 5 se clonó en el vector pVAX1-F4 para obtener pVAX1-F5 con sitios de restricción (NotI, un solo sitio de escisión de la enzima). Después de la última ronda de recombinación, se obtuvo con éxito el vector de sobreexpresión de longitud completa de PRRSV (pVAX1-PRRSV) (Archivo Suplementario 1). Como se ilustra en la Figura 1D, el nuevo plásmido recombinante se hace cada vez más grande con la introducción continua de fragmentos. Por lo tanto, estos resultados indicaron que la combinación de la adición de sitios de restricción apropiados y la utilización de la técnica de ensamblaje de Gibson puede lograr la introducción eficiente de fragmentos de ADN en el vector.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66320/66320fig01.jpg"> Figura 1: Organización y construcción de vectores pVAX1-F6 (pVAX1-PRRSV) por recombinación homóloga. (A) Organización del genoma del PRRSV. ORF1b codifica dominios de ARN polimerasa dependientes de ARN, ARN helicasa y multinucleares de unión a zinc. Otros ORF codifican glicoproteínas asociadas a la membrana (GP2, GP3, GP4 y GP5), la proteína E, la proteína de la envoltura de membrana y la proteína de la nucleocápside. (B) Diagrama esquemático del proceso de generación del vector pVAX1-PRRSV. (C) El gel de ADN agarosa muestra la amplificación por PCR de los fragmentos objetivo. (D) Con la inserción de fragmentos, el tamaño del vector recombinante aumenta gradualmente. Abreviaturas: PRRSV = Virus del Síndrome Respiratorio y Reproductivo Porcino; ORF = marco de lectura abierto; GP = glicoproteína; E = proteína E; M = proteína de la envoltura de membrana; N = proteína de la nucleocápside. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66320/66320fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Componente</td>
			<td>Volumen</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>ARN del PRRSV</td>
			<td>2 μL (25 ng)</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Agua libre de RNasa</td>
			<td>11 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>5x Mezcla de reacción</td>
			<td>4 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Mezcla de Enzimas Supremas</td>
			<td>3 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Temperatura</td>
			<td>Duración</td>
			<td>Ciclos</td>
		</tr><tr><td>25 °C</td>
			<td>10 minutos</td>
			<td>Elimine el ADN genómico, los cebadores aleatorios se emparejan con plantillas de ARN</td>
		</tr><tr><td>55 °C</td>
			<td>15 minutos</td>
			<td>Inactivación rápida de dsDNasa y transcripción inversa</td>
		</tr><tr><td>85 °C</td>
			<td>5 minutos</td>
			<td>Inactivación de la transcriptasa inversa</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Configuración y condiciones de la transcripción inversa.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Componente</td>
			<td>Volumen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>5x Búfer SuperFi II</td>
			<td>10 μL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>10 μM Imprimación directa</td>
			<td>2,5 μL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Imprimación inversa de 10 μM</td>
			<td>2,5 μL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>DNTP de 10 mM</td>
			<td>1 μL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>ADNc (PRRSV)</td>
			<td>1 μL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>ADN polimerasa Platinum SuperFi II</td>
			<td>1 μL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>ddH2O</td>
			<td>32 μL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Paso del ciclo</td>
			<td>Temperatura</td>
			<td>Duración</td>
			<td>Ciclos</td>
		</tr><tr><td>Desnaturalización inicial</td>
			<td>98 °C</td>
			<td>30 s</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>Desnaturalización</td>
			<td>98 °C</td>
			<td>10 s</td>
			<td>35</td>
		</tr><tr><td>Recocido</td>
			<td>60 °C</td>
			<td>10 s</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Extensión</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>3 minutos</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Prórroga definitiva</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>5 minutos</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>Sostener</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 2: Configuración y condiciones de la reacción de PCR.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Linealización pVAX1</td>
			<td>Linealización pVAX1-F1</td>
			<td>Linealización pVAX1-F2</td>
			<td>Linealización pVAX1-F3</td>
			<td>Linealización pVAX1-F4</td>
			<td>Linealización pVAX1-F5</td>
		</tr><tr><td>Componente</td>
			<td>Volumen</td>
			<td>Volumen</td>
			<td>Volumen</td>
			<td>Volumen</td>
			<td>Volumen</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Vector</td>
			<td>10 μL (1 μg) de pVAX1</td>
			<td>6 μL (1 μg) de pVAX1-F1</td>
			<td>3,5 μL (1 μg) de pVAX1-F2</td>
			<td>7,5 μL (1 μg) de pVAX1-F3</td>
			<td>10 μL (1 μg) de pVAX1-F4</td>
			<td>15 μL (1 μg) de pVAX1-F5</td>
		</tr><tr><td>Enzima de restricción 1</td>
			<td>1 μL de NdeI</td>
			<td>1 μL de NdeI</td>
			<td>1 μL de NdeI</td>
			<td>1 μL de NdeI</td>
			<td>1 μL de EcoRV</td>
			<td>1 μL de NotI</td>
		</tr><tr><td>Enzima de restricción 2</td>
			<td>1 μL de HindIII</td>
			<td>1 μL de HindIII</td>
			<td>0,5 μL de CIAP</td>
			<td>0,5 μL de CIAP</td>
			<td>1 μL de NotI</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>10x búfer FastDigest</td>
			<td>2 μL</td>
			<td>2 μL</td>
			<td>2 μL</td>
			<td>2 μL</td>
			<td>2 μL</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr><tr><td>ddH2O</td>
			<td>6 μL</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>13 μL</td>
			<td>9 μL</td>
			<td>6 μL</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr><tr><td>Total</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 3: Mezcla de linealización de pVAX1, pVAX1-F1, pVAX1-F2, pVAX1-F3, pVAX1-F4 y pVAX1-F5.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Componente</td>
			<td>Volumen</td>
		</tr><tr><td>Kit de clonación y ensamblaje sin costuras ExonArt</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>Vector linealizado</td>
			<td>200 ng</td>
		</tr><tr><td>Fragmento</td>
			<td>200 ng</td>
		</tr><tr><td>ddH2O</td>
			<td>hasta 10 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 4: Clonación sin interrupciones de ExonArt y configuración de reacción de ensamblaje.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Componente</td>
			<td>Volumen</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>2x Mezcla Maestra de PCR Verde Universal</td>
			<td>10 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>10 μM Imprimación directa</td>
			<td>0,4 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Imprimación inversa de 10 μM</td>
			<td>0,4 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Plantilla</td>
			<td>1 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>ddH2O</td>
			<td>8,2 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Total</td>
			<td>20 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Temperatura</td>
			<td>Duración</td>
			<td>Ciclos</td>
		</tr><tr><td>95 °C</td>
			<td>30 s</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>98 °C</td>
			<td>10 s</td>
			<td>28</td>
		</tr><tr><td>56 °C</td>
			<td>10 s</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>72 °C</td>
			<td>3 minutos</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>72 °C</td>
			<td>5 minutos</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>4 °C</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 5: Configuración y condiciones de la PCR en colonias.
Figura suplementaria S1: Esquema del proceso de diseño de imprimaciones. También se muestran otros diseños de imprimación como P5 y P6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66320/66320_Supplemental_FigS1.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura suplementaria S2: Secuencias de cebadores. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66320/66320_Supplemental_FigS2.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 1: Datos de secuenciación de ADN. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66320/Supplemental_File_2.rar" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Aquí, presentamos un protocolo para obtener el vector de expresión pVAX1-PRRSV mediante la introducción de sitios de restricción adecuados en el extremo 3' de los insertos. Podemos linealizar el vector y unir fragmentos de ADN al vector uno por uno mediante la tecnología de recombinación homóloga.

Un enfoque de clonación sin fisuras para la construcción de vectores de expresión del virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino

The construction of gene expression vectors is an important component of laboratory work in experimental biology. With technical advancements like Gibson ...

Este protocolo demuestra la construcción de un extenso e intrincado vector de expresión génica. Cuando un fragmento de ADN de longitud completa no puede obtenerse mediante una única PCR a partir de ADNc, o el vector de expresión génica de longitud completa no puede obtenerse mediante recombinación homóloga de múltiples inserciones in vitro, este método es aplicable. En la actualidad, la clonación de ligadura múltiple se utiliza para obtener fragmentos de ADN de longitud completa para clonarlos en un vector adecuado.Este método puede lograr la deleción o mutación de genes diana y unir de manera eficiente un gran número de fragmentos de ADN al vector de expresión.

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Investigación

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Biology

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La generación de rotavirus recombinantes a partir del ADN plásmido proporciona una herramienta esencial para el estudio de la replicación del rotavirus y la patogénesis, y el desarrollo de vectores de expresión de rotavirus y vacunas. En este documento, describimos un enfoque de genética inversa simplificado para generar rotavirus recombinantes, incluyendo cepas que expresan proteínas fluorescentes de reportero.

Método de Genética Inversa Simplificada para Recuperar Rotavirus Recombinantes Expresando Proteínas Reportero

Este es un método para generar virus de vacuna recombinante "sin cicatrices" utilizando la selección del rango de host y la identificación visual de virus recombinantes.

Generación rápida y sin fisuras de poxvirus recombinantes utilizando el rango de host y la selección visual

Para el análisis mecánico profundizado de la síntesis sincitial respiratoria del ARN del virus (RSV), divulgamos un protocolo de utilizar la fosfoproteína de la chaperona (p) para el coexpression de la nucleoproteína ARN-libre (N0)para el montaje in vitro subsecuente de las nucleocápsides virus-específicas (NCs).

Generación Y Ensamblaje De Nucleocápsides Específicas Del Virus Respiratorio Sincitial

Aprende a construir vectores de expresión complejos del PRRSV mediante clonación sin fisuras y recombinación homóloga in vitro. Este método permite incorporar múltiples fragmentos de ADN de manera eficiente.

Un enfoque de clonación sin fisuras para la construcción de vectores de expresión del virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (Video) | JoVE Journal

Un enfoque de clonación sin fisuras para la construcción de vectores de expresión del virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino

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