Name: AQRNA-seq para cuantificar ARNs pequeños (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-02T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: Aprende AQRNA-seq para cuantificar ARNs pequeños en Mycobacterium bovis BCG durante la latencia por inanición. Este método supera los sesgos de la RNA-Seq tradicional y permite la cuantificación absoluta de microARNs y tARNs.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Los autores del presente trabajo agradecen a los autores del artículo original que describe la tecnología AQRNA-seq7. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (ES002109, AG063341, ES031576, ES031529, ES026856) y la Fundación Nacional de Investigación de Singapur a través de la Alianza Singapur-MIT para la Investigación y Tecnología de la Resistencia a los Antimicrobianos IRG.

Análisis de la dinámica del ARNt mediante AQRNA-seq

<ol><li>Byron, S. A., Van Keuren-Jensen, K. R., Engelthaler, D. M., Carpten, J. D., Craig, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+RNA+sequencing+into+clinical+diagnostics%3A+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gen%22%5BJournal%5D)">Translating RNA sequencing into clinical diagnostics: opportunities and challenges.</a> Nat Rev Gen. 17 (5), 257-271 (2016).</li>
<li>Grillone, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-coding+RNAs+in+cancer%3A+platforms+and+strategies+for+investigating+the+genomic+%26%2334%3Bdark+matter.%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Non-coding RNAs in cancer: platforms and strategies for investigating the genomic &#34;dark matter.&#34.</a> J Exp Clin Cancer Res. 39 (1), 117(2020).</li>
<li>Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+technologies+and+bioinformatics+pipelines%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines.</a> Exp Mol Med. 50 (8), 1-14 (2018).</li>
<li>Goh, J. J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+specific+multiplexed+RNA+imaging+in+tissues+with+split-FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly specific multiplexed RNA imaging in tissues with split-FISH.</a> Nat Methods. 17 (7), 689-693 (2020).</li>
<li>Moses, L., Pachter, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Museum+of+spatial+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Museum of spatial transcriptomics.</a> Nat Methods. 19 (5), 534-546 (2022).</li>
<li>Cummings, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+genetic+diagnosis+in+Mendelian+disease+with+transcriptome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Improving genetic diagnosis in Mendelian disease with transcriptome sequencing.</a> Sci Transl Med. 9 (386), 5209(2017).</li>
<li>Hu, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mapping+of+the+cellular+small+RNA+landscape+with+AQRNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">Quantitative mapping of the cellular small RNA landscape with AQRNA-seq.</a> Nat Biotech. 39 (8), 978-988 (2021).</li>
<li>Alon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barcoding+bias+in+high-throughput+multiplex+sequencing+of+miRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Barcoding bias in high-throughput multiplex sequencing of miRNA.</a> Genome Res. 21 (9), 1506-1511 (2011).</li>
<li>Fuchs, R. T., Sun, Z., Zhuang, F., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bias+in+ligation-based+small+RNA+sequencing+library+construction+is+determined+by+adaptor+and+RNA+structure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Bias in ligation-based small RNA sequencing library construction is determined by adaptor and RNA structure.</a> PLoS One. 10 (5), e0126049(2015).</li>
<li>Pang, Y. L. J., Abo, R., Levine, S. S., Dedon, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+cell+stresses+induce+unique+patterns+of+tRNA+up-+and+down-regulation%3A+tRNA-seq+for+quantifying+changes+in+tRNA+copy+number%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Diverse cell stresses induce unique patterns of tRNA up- and down-regulation: tRNA-seq for quantifying changes in tRNA copy number.</a> Nuc Acids Res. 42 (22), e170(2014).</li>
<li>Machnicka, M. A., Olchowik, A., Grosjean, H., Bujnicki, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+frequencies+of+post-transcriptional+modifications+in+tRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Distribution and frequencies of post-transcriptional modifications in tRNAs.</a> RNA Biol. 11 (12), 1619-1629 (2014).</li>
<li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+impact+of+RNA+secondary+structure+across+the+Arabidopsis+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulatory impact of RNA secondary structure across the Arabidopsis transcriptome.</a> Plant Cell. 24 (11), 4346-4359 (2012).</li>
<li>García-Nieto, P. E., Wang, B., Fraser, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+diversity+is+a+systematic+source+of+variation+in+RNA-sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptome diversity is a systematic source of variation in RNA-sequencing data.</a> PLOS Comput Biol. 18 (3), e1009939(2022).</li>
<li>FASTQC: a quality control tool for high throughput sequence data. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2010).</li>
<li>Chen, S., Zhou, Y., Chen, Y., Gu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fastp%3A+an+ultra-fast+all-in-one+FASTQ+preprocessor%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fastp: an ultra-fast all-in-one FASTQ preprocessor.</a> Bioinformatics. 34 (17), i884-i890 (2018).</li>
<li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biol. 15 (12), 550(2014).</li>
<li>R Core Team. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R%3A+a+language+and+environment+for+statistical+computing%5BTitle%5D)+AND+%22R+Foundation+for+Statistical+Computing%22%5BJournal%5D)">R: a language and environment for statistical computing.</a> R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. (2022).</li>
<li>Ougland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AlkB+restores+the+biological+function+of+mRNA+and+tRNA+inactivated+by+chemical+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">AlkB restores the biological function of mRNA and tRNA inactivated by chemical methylation.</a> Mol Cell. 16 (1), 107-116 (2004).</li>
<li>Bernhardt, H. S., Tate, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primordial+soup+or+vinaigrette%3A+did+the+RNA+world+evolve+at+acidic+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Direct%22%5BJournal%5D)">Primordial soup or vinaigrette: did the RNA world evolve at acidic pH.</a> Biol Direct. 7, 4(2012).</li>
<li>Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+local+alignment+search+tool%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Basic local alignment search tool.</a> J Mol Biol. 215 (3), 403-410 (1990).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads%5BTitle%5D)+AND+%22EMBnet.+J%22%5BJournal%5D)">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet. J. 17 (1), 10-12 (2011).</li>
</ol>

P.C.D. es inventor de dos patentes (PCT/US2019/013714, US 2019/0284624 A1) relacionadas con la obra publicada.

El flujo de trabajo de preparación de la biblioteca AQRNA-seq está diseñado para maximizar la captura de ARN dentro de una muestra y minimizar la caída de la polimerasa durante la transcripción inversa7. A través de una ligadura de enlazador de dos pasos, los nuevos oligonucleótidos de ADN (Linker 1 y Linker 2) se ligan en exceso para complementar completamente el ARN dentro de la muestra. El exceso de enlazadores se puede eliminar de manera eficiente con RecJf, una exonucleasa de 5' a 3' específi...

La secuenciación de próxima generación (NGS), también conocida como secuenciación paralela masiva, es una tecnología de secuenciación de ADN que implica la fragmentación del ADN, la ligadura de oligonucleótidos adaptadores, la amplificación basada en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la secuenciación del ADN y el reensamblaje de las secuencias de fragmentos en un genoma. La adaptación de NGS a la secuencia de ARN (RNA-seq) es un enfoque poderoso para identificar y cuantificar las transcripciones de ARN y sus variantes1. Los desarrollos innovadores en los flujos de trabajo de preparación de bibliotecas de ARN y las tuberías de análisis bioinformático, junto con los avances en la instrumentación de laboratorio, han ampliado el repertorio de aplicaciones de secuenciación de ARN, progresando más allá de la secuenciación del exoma hacia ómicas funcionales avanzadas como el perfil de ARN no codificante2, el análisis de células individuales3, la transcriptómica espacial 4,5, el análisis de empalme alternativo6entre otros. Estos métodos avanzados de secuenciación de ARN revelan funciones complejas de ARN a través del análisis cuantitativo del transcriptoma en células y tejidos normales y enfermos.
A pesar de estos avances en la secuenciación de ARN, varias características técnicas clave limitan el poder cuantitativo del método. Si bien la mayoría de los métodos de secuenciación de ARN permiten una cuantificación precisa y precisa de los cambios en los niveles de ARN entre variables experimentales (es decir, muestras biológicas y/o estados fisiológicos), no pueden proporcionar comparaciones cuantitativas de los niveles de moléculas de ARN dentro de una muestra. Por ejemplo, la mayoría de los métodos de secuenciación de ARN no pueden cuantificar con precisión el número relativo de copias de moléculas isoaceptoras de ARNt individuales en un grupo celular de ARNt expresados. Como se destaca en la publicación complementaria7, esta limitación a la secuenciación de ARN surge de varias características de la estructura del ARN y la bioquímica de la preparación de la biblioteca. Por ejemplo, la actividad de las enzimas de ligadura utilizadas para unir los enlazadores de secuenciación de los extremos 3' y 5' a las moléculas de ARN está fuertemente influenciada por la identidad de los nucleótidos terminales del ARN y los enlazadores de secuenciación. Esto conduce a grandes variaciones en la eficiencia de las ligaduras de enlazadores y profundos aumentos artifactuales en las lecturas de secuenciación 8,9,10.
Un segundo conjunto de limitaciones surgen de las propiedades estructurales inherentes de las moléculas de ARN. Específicamente, la formación de la estructura secundaria del ARN y los cambios dinámicos en las docenas de modificaciones postranscripcionales del ARN del epitranscriptoma pueden causar la caída de la polimerasa o la mutación durante la transcripción inversa. Estos errores dan lugar a una síntesis de ADNc incompleta o truncada o a una secuencia de ARN alterada. Si bien ambos fenómenos pueden explotarse para mapear estructuras secundarias o algunas modificaciones, degradan la precisión cuantitativa de la secuenciación de ARN si los pasos posteriores de preparación de la biblioteca no logran capturar ADNc truncados o si el procesamiento de datos arroja secuencias mutadas que no coinciden con un conjunto de datos de referencia11,12. Además, la inmensa diversidad química, estructural y de longitud de los transcritos de ARN, así como la falta de herramientas para fragmentar uniformemente los ARN largos, disminuye la aplicabilidad de la mayoría de los métodos de secuenciación de ARN a todas las especies de ARN13.
El método AQRNA-seq (secuenciación de ARN de cuantificación absoluta) se ha desarrollado para eliminar varias de estas restricciones técnicas y biológicas que limitan la precisión cuantitativa7. Al minimizar los sesgos dependientes de la secuencia en la captura, ligadura y amplificación durante la preparación de la biblioteca de secuenciación de ARN, AQRNA-seq logra una linealidad superior en comparación con otros métodos, cuantificando con precisión el 75% de una biblioteca de referencia de 963 miARN con una precisión de 2 veces. Esta correlación lineal entre el recuento de lecturas de secuenciación y la abundancia de ARN también se observa en un análisis de un grupo de longitud variable de estándares de oligonucleótidos de ARN y en referencia a métodos ortogonales como el Northern blot. El establecimiento de la linealidad entre el recuento de lecturas de secuenciación y la abundancia de ARN permite a AQRNA-seq lograr una cuantificación precisa y absoluta de todas las especies de ARN dentro de una muestra.
A continuación, se muestra una descripción del protocolo para el flujo de trabajo de preparación de la biblioteca AQRNA-seq y la canalización de análisis de datos descendente que lo acompaña. El método se aplicó para dilucidar la dinámica de la abundancia de ARNt durante la latencia inducida por inanición y la posterior reanimación en el modelo de tuberculosis Mycobacterium bovis bacilli de Calmette et Guérin (BCG). Se presentaron los resultados para la visualización exploratoria de los datos de secuenciación, junto con los posteriores análisis de agrupamiento y expresión diferencial que revelaron patrones discernibles en la abundancia de ARNt asociados con varios fenotipos.

<table><tbody><tr><td>2-cetoglutarato&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75890</td><td>Prepare una solución de trabajo (1 M) y guárdela a -20&ordm; C</td></tr><tr><td>2100 Instrumento bioanalizador</td><td>Agilent</td><td>G2938C</td><td></td></tr><tr><td>Adenosina 5'-trifosfato (ATP)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0437M (componente #: N0437AVIAL)</td><td>NEB M0437M contiene ARN ligasa T4 1 (30 U/&mu; L), tampón de reacción de ARN ligasa T4 (10X), PEG 8000 (1X) y ATP (100 mM); preparar una solución de trabajo (10 mM) y almacenarla a -20&ordm; C</td></tr><tr><td>AGAROSA GPG/LE</td><td>AmericanBio</td><td>AB00972-00500</td><td>Almacenar a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Sulfato de hierro (II) hexahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2262</td><td>Prepare una solución de trabajo (0,25 M) y guárdela a -20 °C; C</td></tr><tr><td>Bioanalyzer Análisis de ARN pequeño</td><td>Agilent</td><td>5067-1548&nbsp;</td><td>El análisis de ARN pequeño se utiliza para comprobar la calidad de los ARN de entrada y la eficiencia de las reacciones enzimáticas (por ejemplo, ligadura de Linker 1)</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA; 10 mg/mL)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>B9000</td><td>Este producto se suspendió el 15/12/2022 y se reemplaza con albúmina recombinante, grado de biología molecular (NEB B9200).</td></tr><tr><td>Cloroformo&nbsp;</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>4441-10</td><td></td></tr><tr><td>Desmetilasa&nbsp;</td><td>ArrayStar</td><td>AS-FS-004</td><td>Demethylase viene con el pretratamiento de ARNt rtStar & Kit de síntesis de ADNc de primera cadena (AS-FS-004)</td></tr><tr><td>Mezcla de solución de desoxinucleótido (dNTP)</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L (componente #: N0447LVIAL)</td><td>Esta mezcla de soluciones dNTP contiene concentraciones equimolares de dATP, dCTP, dGTP y dTTP (10 mM cada una)</td></tr><tr><td>Bloque de calor doble digital</td><td>VWR Scientific Products</td><td>13259-052</td><td>El bloque calefactor se utiliza con el QIAquick&nbsp; Kit de extracción de gel&nbsp;</td></tr><tr><td>DyeEx&nbsp; 2.0 Kit de giro&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>63204&nbsp;</td><td>Eficaz para eliminar restos cortos (por ejemplo, oligonucleótidos de menos de 10 pb de longitud)</td></tr><tr><td>Fuente de alimentación para electroforesis</td><td>Bio-Rad Labrotories</td><td>PowerPac 300</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Tubos PCR (0,5 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>0030124537</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Tubos Safe-Lock (0,5 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>022363611</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Tubos Safe-Lock (1,5 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>022363204</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Tubos Safe-Lock (2 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>022363352</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol etílico (etanol),</td><td>Sigma-Aldrich</td> puro <td>E7023&nbsp;</td><td>El etanol puro se utiliza con el kit de limpieza y concentrador Oligo de Zymo Research</td></tr><tr><td>Sistema de imágenes en gel</td><td>Alpha Innotech</td><td>FluorChem 8900</td><td></td></tr><tr><td>Tinte de carga en gel, púrpura (6X), sin SDS</td><td>New England Biolabs</td><td>N0556S (componente #: B7025SVIAL)</td><td>NEB N0556S contiene Escalera de ADN púrpura de carga rápida de 50 pb y tinte de carga en gel, púrpura (6X), sin SDS</td></tr><tr><td>Espectrofotómetro GENESYS 180 UV-Vis</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>840-309000</td><td>El espectrofotómetro se utiliza para medir las concentraciones de oligonucleótidos utilizando la ley de Beer</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>Prepare una solución de trabajo (1 M; pH = 8 con NaOH) y guárdela a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico (HCl)&nbsp;</td><td>Productos científicos de VWR</td><td>BDH3028&nbsp;</td><td>Prepare una solución de trabajo (5 M) y guárdela a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Alcohol isopropílico (isopropanol), puro</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>3032-16</td><td>El isopropanol se utiliza con el QIAquick&nbsp; Kit de extracción de gel&nbsp;</td></tr><tr><td>Ácido L-ascórbico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5960</td><td>Prepare una solución de trabajo (0,5 M) y guárdela a -20&ordm; </td></tr><tr><td>C Microcentrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 Espectrofotómetro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 2 (10X)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0264L (componente #: B7002SVIAL)</td><td>NEB M0264L contiene RecJf (30 U/&mu; L) y NEBuffer 2 (10X); tienda a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Agua sin nucleasas (no tratada con DEPC)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9938&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Oligo Limpio & Kit concentrador&nbsp;</td><td>Investigación Zymo</td><td>D4061&nbsp;</td><td>Almacenar a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>PEG 8000 (solución al 50%)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0437M (componente #: B1004SVIAL)</td><td>NEB M0437M contiene ARN ligasa T4 1 (30 U/&mu; L), tampón de reacción de ARN ligasa T4 (10X), PEG 8000 (1X) y ATP (100 mM); preparar una solución de trabajo (10 mM) y almacenarla a -20&ordm; C</td></tr><tr><td>Termociclador Peltier</td><td>MJ Research</td><td>PTC-200</td><td></td></tr><tr><td>Fenol: cloroformo: isoamilo &nbsp; alcohol 25:24:1 pH = 5.2&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J62336&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Búfer PrimeScript (5X)</td><td>TaKaRa</td><td>2680A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Transcriptasa inversa PrimeScript</td><td>TaKaRa</td><td>2680A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick&nbsp; Kit de extracción de gel&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Este kit requiere un bloque calefactor e isopropanol para trabajar con</td></tr><tr><td>Quick-Load Purple 100 bp DNA Ladder</td><td>New England Biolabs</td><td>N0551S (componente #: N0551SVIAL)</td><td></td></tr><tr><td>Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder</td><td>New England Biolabs</td><td>N0556S (componente #: N0556SVIAL)</td><td>NEB N0556S contiene Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder y Gel Loading Dye, Purple (6X), sin SDS</td></tr><tr><td>RecJf&nbsp; (30 U/&mu; L)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0264L (componente #: M0264LVIAL)</td><td>NEB M0264L contiene RecJf (30 U/&mu; L) y NEBuffer 2 (10X); tienda a -20 &deg; </td></tr><tr><td>C Inhibidor de la ARNasa (murino; 40 U/&mu; L)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0314L&nbsp;( componente #: M0314LVIAL)</td><td>Almacenar a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>SeqAMP&nbsp; ADN polimerasa&nbsp;</td><td>TaKaRa</td><td>638509&nbsp;</td><td>TaKaRa 638509 contiene SeqAMP&nbsp; ADN polimerasa&nbsp; y SeqAMP&nbsp; Tampón de PCR (2X)</td></tr><tr><td>SeqAMP&nbsp; Tampón de PCR (2X)&nbsp;</td><td>TaKaRa</td><td>638509&nbsp;</td><td>TaKaRa 638509 contiene SeqAMP&nbsp; ADN polimerasa&nbsp; y SeqAMP&nbsp; Tampón PCR (2X)</td></tr><tr><td>Fosfatasa alcalina de camarones (1 U/&mu; L)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0371L&nbsp;( componente #: M0371LVIAL)</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; S5881</td><td>Prepare una solución de trabajo (5 M) y guárdela a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>T4 ADN Ligasa (400 U/&mu; L)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202L&nbsp;( componente #: M0202LVIAL)</td><td>NEB M0202L contiene ADN ligasa T4 (400 U/&mu; L) y Tampón de reacción de ADN ligasa T4 (10X)</td></tr><tr><td>Tampón de reacción de ADN ligasa T4 (10X)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202L&nbsp;( componente #: B0202SVIAL)</td><td>NEB M0202L contiene ADN ligasa T4 (400 U/&mu; L) y tampón de reacción de ADN ligasa T4 (10X)</td></tr><tr><td>T4 ARN ligasa 1 (30 U/&mu; L)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0437M (componente #: M0437MVIAL)</td><td>NEB M0437M contiene T4 ARN ligasa 1 (30 U/&mu; L), tampón de reacción de ARN ligasa T4 (10X), PEG 8000 (1X) y ATP (100 mM)</td></tr><tr><td>Tampón de reacción de ARN ligasa T4 (10X)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0437M (componente #: B0216SVIAL)</td><td>NEB M0437M contiene ARN ligasa T4 1 (30 U/&mu; L), tampón de reacción de ARN ligasa T4 (10X), PEG 8000 (1X) y ATP (100 mM)</td></tr></tbody></table>

aqrna-seq para cuantificar arns pequeños

AQRNA-seq for Quantifying Small RNAs

AQRNA-seq proporciona una relación lineal directa entre los recuentos de lecturas de secuenciación y el número pequeño de copias de ARN en una muestra biológica, lo que permite una cuantificación precisa del grupo de ARN pequeños. El procedimiento de preparación de la biblioteca AQRNA-seq descrito aquí implica el uso de enlazadores de secuenciación diseñados a medida y un paso para reducir las modificaciones del ARN de metilación que bloquean la procesividad de transcripción inversa, lo que da como resultado un mayor rendimiento de ADNc de longitud completa. Además, se presenta una implementación detallada de la cartera de productos bioinformáticos que la acompaña. Esta demostración de AQRNA-seq se llevó a cabo a través de un análisis cuantitativo de los 45 ARNt en Mycobacterium bovis BCG cosechados en 5 días seleccionados a lo largo de un curso de 20 días de privación de nutrientes y 6 días de reanimación. Los esfuerzos en curso para mejorar la eficiencia y el rigor de AQRNA-seq también se discutirán aquí. Esto incluye explorar métodos para obviar la purificación en gel para mitigar los problemas de dímero de cebador después de la amplificación de PCR y para aumentar la proporción de lecturas completas para permitir un mapeo de lectura más preciso. Las futuras mejoras de AQRNA-seq se centrarán en facilitar la automatización y la implementación de alto rendimiento de esta tecnología para cuantificar todas las especies pequeñas de ARN en muestras de células y tejidos de diversos organismos.

Mycobacterium bovis La cepa BCG (bacilos de Calmette et Guérin) 1173P2 en crecimiento exponencial se sometió a una serie temporal (0, 4, 10 y 20 días) de inanición de nutrientes, seguida de una reanimación de 6 días en un medio rico en nutrientes, como se presentó previamente en Hu et al.7. Se aislaron pequeños ARN de cultivo bacteriano, con tres réplicas biológicas, en cada uno de los cinco puntos de tiempo designados. Las bibliotecas de Illumina se construyeron utilizando el flujo de tr...

La secuenciación de ARN de cuantificación absoluta (AQRNA-seq) es una tecnología desarrollada para cuantificar el panorama de todos los ARN pequeños en mezclas biológicas. Aquí, se demuestran los pasos de preparación de la biblioteca y procesamiento de datos de AQRNA-seq, cuantificando los cambios en el grupo de ARN de transferencia (ARNt) en Mycobacterium bovis BCG durante la latencia inducida por inanición.

AQRNA-seq para cuantificar ARNs pequeños

AQRNA-seq provides a direct linear relationship between sequencing read counts and small RNA copy numbers in a biological sample, thus enabling accurate ...

La secuenciación de AQRNA mapea cuantitativamente ARN pequeños como microARN, ARNt y fragmentos de ARNt en prácticamente cualquier muestra de célula o tejido. Se puede utilizar para mapear algunas de las 170 modificaciones conocidas del ARNt, pero hay otros métodos que son más específicos para el mapeo. Puede utilizar AQRNA-seq para descubrir biomarcadores de enfermedades en el RNoma y explorar los mecanismos de traducción de proteínas a nivel de sistemas.La mayoría de los métodos de secuenciación de ARN no pueden cuantificar con precisión la abundancia de moléculas de ARN individuales en una muestra. Esto se debe tanto a las propiedades estructurales del ARN, como las estructuras secundarias, las modificaciones postranscripcionales, como a la bioquímica de la preparación de la biblioteca, como los sesgos de ligadura de mil veces inducidos por los nucleótidos terminales de los ARN. AQRNA-seq se desarrolló para superar varios desafíos técnicos y biológicos, lo que limita la cuantificación precisa de la abundancia de ARN en la muestra.En comparación con otros asuntos, logra la linealidad entre los recuentos y el número de copias de las moléculas de ARN, con precisión, cuantifica el 7

Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Los microRNAs (miRNAs) son una clase ampliamente conservada de moléculas reguladoras. Aquí describimos un método de clonación de miRNA que se basa en dos potentes pasos de ligadura seguidos de una secuenciación de alto rendimiento. Nuestro método permite una cuantificación precisa de miRNAs en todo el genoma.

Ligadura Altamente Eficiente de los Pequeños ARN moléculas de microARN cuantificación mediante secuenciación de alto rendimiento

MicroRNAs circulantes han surgido recientemente como biomarcadores prometedores y novedosos para varios tipos de cáncer y otras enfermedades. El objetivo de este artículo es discutir tres plataformas basados ​​en sondas diferentes en tiempo real PCR y métodos que están disponibles para cuantificar y determinar la abundancia de microRNAs en circulación.

PCR en tiempo real basada en sondeos Enfoques para la medición cuantitativa de microRNAs

Se proporciona un protocolo para cuantificar los genes de ARNr 16S bacterianos y las transcripciones de los sedimentos costeros mediante PCR en tiempo real. La metodología incluye la co-extracción de ADN y ARN; preparación de ARN libre de ADN; y cuantificación de genes y transcripciones del ARNr 16S mediante RT-q-PCR, incluida la construcción de curvas estándar.

ADN-ARN simultánea extracción de los sedimentos costeros y cuantificación de 16S rRNA genes y las transcripciones de PCR en tiempo real

Describimos un método basado en la secuenciación de ARN dirigido que incluye la preparación de bibliotecas de ADNc indexadas, hibridación y captura con sondas personalizadas y análisis de datos para interrogar transcripciones seleccionadas para la expresión génica, mutaciones y fusiones de genes. Targeted RNAseq permite una evaluación rápida y rentable de transcripciones seleccionadas en un secuenciador de escritorio.

La secuenciación de ARN dirigidos Ensayo para caracterizar la expresión génica y la genómica alteraciones

Este protocolo describe un método para asignación pre-mRNA 3' final sitios de procesamiento.

Extremo 3' secuencia biblioteca elaboración con Sec2 A

Aquí, describimos una estrategia paso a paso para aislar pequeños ARN, enriquecer para microARN y preparar muestras para la secuenciación de alto rendimiento. A continuación, describimos cómo procesar lecturas de secuencia y alinearlas con microRNAs, utilizando herramientas de código abierto.

Una tubería completa para aislar y secuenciar microRNAs, y analizarlos mediante herramientas de código abierto

Los ARN circulares (arnar) son ARN no codificantes que pueden tener funciones en la regulación transcripcional y en las interacciones mediantantes entre proteínas. Tras la evaluación de los diferentes parámetros para la construcción de bibliotecas de secuenciación de circRNA, se compiló un protocolo utilizando la preparación total de la biblioteca de ARN varada con el pretratamiento RNase R y se presenta aquí.

Identificación de ARN circulares mediante secuenciación de ARN

Presentamos un protocolo detallado de reparación de la biblioteca de ARN pequeño con menos sesgo que los métodos estándar y una mayor sensibilidad para los ARN de 2'-O-metil. Este protocolo se puede seguir utilizando reactivos caseros para ahorrar costos o usar kits para mayor comodidad.

Mejora de ARN pequeño-seq: Menos sesgo y mejor detección de 2'-O-Metil RNAs

Aquí se presenta un protocolo para la microdisección de captura láser (LCM) de tejidos vegetales. LCM es una técnica microscópica para aislar áreas de tejido de una manera libre de contaminación. El procedimiento incluye fijación de tejido, incrustación de parafina, seccionamiento, LCM y extracción de ARN. El ARN se utiliza en el análisis de transcriptomas de transcriptomas específicos del tejido aguas abajo y resueltos temporalmente.

Secuenciación de ARN-Secuenciación de ARN-Captura láser para Análisis de Expresión Genética Espacial y Temporal Específica de Tejidos en Plantas

Este trabajo presenta un método para cuantificar de forma rápida y precisa la pigmentación abdominal de Drosophila melanogaster mediante el análisis de imágenes digitales . Este método agiliza los procedimientos entre la adquisición del fenotipo y el análisis de los datos e incluye el montaje de las muestras, la adquisición de imágenes, la extracción de valores de píxeles y la medición de rasgos.

Cuantificación de la Pigmentación Abdominal en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aprende AQRNA-seq para cuantificar ARNs pequeños en Mycobacterium bovis BCG durante la latencia por inanición. Este método supera los sesgos de la RNA-Seq tradicional y permite la cuantificación absoluta de microARNs y tARNs.

AQRNA-seq para cuantificar ARNs pequeños

Explorar más videos