Name: Análisis de Infección de Células Epiteliales con Shigella (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-09T14:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 56 s
Description: Aprende ensayos de infección con Shigella en líneas celulares epiteliales para estudiar adherencia, invasión y replicación intracelular. Este método ayuda a desarrollar terapéuticas efectivas contra infecciones bacterianas.

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El apoyo a los autores incluye el Departamento de Pediatría del Hospital General de Massachusetts, el premio 2022A009041 del Comité Ejecutivo de Financiación de Apoyo Provisional a la Investigación (ISF), la subvención del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas R21AI146405 y la subvención del Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales del Centro de Investigación de la Obesidad y la Nutrición de Harvard (NORCH) 2P30DK040561-26. Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Protocolos para el análisis de la infección por Shigella en células epiteliales colónicas

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Este protocolo describe un conjunto de tres ensayos estandarizados para estudiar la adherencia a Shigella, la invasión y la replicación intracelular de las células epiteliales intestinales. Aunque estos métodos no son más que versiones modificadas de los ensayos clásicos de gentamicina utilizados para estudiar la invasión y replicación intracelular de diversos patógenos bacterianos dentro de las células huésped 49,50,51, se deben aplicar consideraciones especiales cuando se estudia Shigella.
Las Shigella son anaerobios facultativos, que crecen de manera óptima a 37 °C en medio rico con aireación43. Al realizar estos ensayos para interrogar los efectos de diferentes señales ambientales o metabolitos en las infecciones por Shigella, se recomienda cultivar Shigella en medios ricos durante la noche, luego subcultivar en medios definidos o complementados hasta la fase media del registro antes de la infección. La máxima expresión génica de virulencia ocurre durante la fase logarítmica del crecimiento52,53. Por lo tanto, el subcultivo de cultivos de Shigella durante la noche y permitir el crecimiento bacteriano a la fase exponencial (OD600 ~ 0,7) son pasos necesarios para evaluar adecuadamente la virulencia de Shigella. Además, la expresión génica de la virulencia depende de la temperatura. Para garantizar la especificidad de la expresión solo durante la infección del huésped, los genes de virulencia se inducen a temperaturas fisiológicas del huésped (37 °C) y se reprimen estrictamente a temperaturas más bajas (p. ej., 30 °C)54. Para garantizar la expresión de los genes de virulencia, el subcultivo bacteriano y las infecciones deben llevarse a cabo a 37 °C, con los cuidados adecuados para garantizar que la temperatura no descienda por debajo de los 37 °C. Un plásmido de virulencia grande de 220 kilobases, que codifica la maquinaria molecular necesaria para la invasión y la infección de las células epiteliales, es un determinante de virulencia esencial para todas las especies de Shigella 5. El paso repetido y el crecimiento prolongado a 37 °C promueven la inestabilidad de los plásmidos de virulencia, lo que resulta en la pérdida de plásmidos y hace que las células de Shigella sean avirulentas55. Para garantizar el mantenimiento del plásmido de virulencia y la expresión de genes de virulencia cruciales, se recomienda volver a rayar las bacterias directamente de las existencias del congelador cada dos semanas en placas indicadoras frescas de TSB + Congo rojo. El agar rojo Congo se puede utilizar para diferenciar entre colonias virulentas de tipo salvaje (rojo, CR+) y colonias avirulentas (blancas, CR-) que han perdido el plásmido de virulencia45. Si se observa repetidamente inestabilidad del plásmido de virulencia, los cultivos nocturnos de Shigella pueden incubarse a 30 °C para evitar la pérdida de plásmidos de virulencia, seguido de un subcultivo a 37 °C para promover la expresión génica de virulencia43. Por último, si se realizan análisis con cepas mutantes y/o complementarias, en las que hay marcadores antibióticos presentes en estas cepas bacterianas, se recomienda utilizar la selección antibiótica adecuada durante las etapas de pernoctación y subcultivo bacteriano.
El uso de monocapas epiteliales HT-29 tiene muchas ventajas para estudiar in vitro los mecanismos moleculares de la patogénesis de Shigella. Dado que Shigella es un patógeno adaptado al ser humano, los modelos de animales pequeños no reflejan con precisión la patogénesis característica de la shigelosis observada en los seres humanos36. Por lo tanto, el uso de protocolos estandarizados para la infección de líneas celulares derivadas de humanos permite la interrogación cuantitativa de los pasos individuales de la patogénesis bacteriana para caracterizar la interacción molecular entre este patógeno y su huésped nativo. Históricamente, las células HeLa se utilizaron predominantemente para estudiar las interacciones huésped-patógeno in vitro 25,56,57. Sin embargo, las células HeLa son una línea celular de cáncer de cuello uterino inmortalizada, que son células huésped no nativas de patógenos bacterianos entéricos. Por lo tanto, los estudios in vitro de la patogénesis entérica han cambiado al uso de líneas celulares de adenocarcinoma de colon (p. ej., HT-29, Caco-2 y T84), que recapitulan más fielmente la morfología epitelial intestinal y pueden cultivarse en transpocillos como monocapas epiteliales con superficies apicales y basolaterales diferenciadas 58,59,60. Aunque cada línea celular tiene sus fortalezas y debilidades individuales, las células HT-29 se utilizan en los ensayos descritos aquí debido a las similitudes fenotípicas con los enterocitos intestinales y la expresión robusta de los receptores de la superficie celular y las citocinas proinflamatorias 58,59,61. Sin embargo, cada uno de estos modelos discutidos son líneas celulares derivadas del cáncer con fenotipos metabólicos y de crecimiento aberrantes que no representan con precisión el estado fisiológico natural del epitelio colónico in vivo58. Los avances recientes en las técnicas de cultivo de tejidos humanos han permitido el cultivo de células madre intestinales humanas, obtenidas a partir de biopsias de tejidos, en organoides o monocapas celulares bidimensionales individuales que recapitulan los diversos tipos de células presentes en el tracto gastrointestinal (GI) humano 62,63,64. Los organoides intestinales se pueden diferenciar para incluir enterocitos, células caliciformes productoras de moco, células M y otros tipos de células específicas de tejidos. Estudios recientes han validado el uso de estos modelos organoides para el estudio de patógenos entéricos, incluyendo varios patógenos de Shigella spp., Salmonella enterica y Escherichia coli 62,63,64. Aunque los organoides son modelos más precisos del epitelio gastrointestinal humano e incluso pueden cultivarse en diversas condiciones de nutrientes para representar a la población mundial65, su complejidad relativa requiere una formación y conocimientos técnicos significativos, lo que se traduce en costes más elevados y tiempos de cultivo más largos en comparación con las líneas celulares cancerosas tradicionales58.
Este protocolo describe métodos de rendimiento medio, en los que se utilizan dos placas de 6 pocillos para un total de 12 monocapas disponibles para pruebas. Sin embargo, los experimentos se pueden escalar fácilmente para aumentar el número de monocapas sembradas con el fin de acomodar réplicas técnicas adicionales, o probar mutantes Shigella adicionales y señales ambientales. Las placas de cultivo de tejidos con más pocillos (p. ej., placas de 12 o 24 pocillos) también se pueden usar con los ajustes adecuados para tener en cuenta los pocillos con diámetros más pequeños. Bajo las condiciones de crecimiento de HT-29 descritas en el paso 3.2, los títulos de HT-29 son suficientes para sembrar alrededor de seis placas de 6 pocillos después del cultivo de un matraz T75, con suficientes células restantes para mantener el cultivo celular de HT-29. Además, la siembra de monocapas de HT-29 y la preparación de los pasos de inoculación de bacterias son idénticos entre los ensayos de adherencia bacteriana, invasión y replicación intracelular. Por lo tanto, los ensayos que prueban las mismas cepas de Shigella o las mismas condiciones de subcultivo se pueden realizar fácilmente en paralelo para examinar simultáneamente el papel de cada condición experimental en varios pasos de la infección por Shigella .
Los títulos de recuperación de las bacterias adherentes (paso 4), invadidas (paso 5) e intracelulares (paso 6) se determinan mediante la siembra de diluciones seriadas de células HT-29 infectadas después de la lisis, lo que permite una evaluación cuantitativa de la eficiencia de cada etapa de la infección por Shigella. Los pasos de centrifugación en los ensayos de invasión y replicación intracelular, basados en ensayos clásicos 49,50,51, promueven el contacto bacteriano con las células huésped para una invasión inmediata y mejoran las tasas de invasión. Así, la centrifugación "omite" el paso de adherencia, que más tarde se descubrió que era un aspecto importante de la infección por Shigella 17,18,19,66. Es esencial tener en cuenta que el paso de centrifugación no se puede realizar con células epiteliales polarizadas sembradas en pocillos trans. Sin embargo, para el ensayo de adherencia, la adherencia no es forzada por centrifugación, y no se agrega gentamicina a las células HT-29 infectadas antes de la lisis, lo que permite la enumeración de las células bacterianas adherentes. El volumen de los medios de cultivo de tejidos se reduce a 1 mL (en comparación con los 2 mL de los ensayos de invasión y replicación intracelular) para permitir un contacto más eficiente de las bacterias con las células HT-29. Además, dependiendo de la tasa de adherencia, puede ocurrir cierta invasión y replicación intracelular durante las 3 h de incubación, pero la cantidad suele ser insignificante (por ejemplo, solo el 0,05% de la población bacteriana recuperada después de la lisis de la célula huésped). Sin embargo, para tener en cuenta adecuadamente las bacterias adherentes frente a las intracelulares durante las 3 h de incubación, se recomienda realizar ensayos paralelos, en los que, además del protocolo establecido, se incuba una segunda placa con 50 μg/ml de gentamicina en 2 ml de DMEM por pocillo durante 45 min en total (15 min de incubación, lavado, DMEM fresco + gentamicina durante 30 min) para lisar completamente las bacterias extracelulares. Después de la lisis celular HT-29 como se indica en el protocolo, las bacterias intracelulares se pueden enumerar como se indicó anteriormente, y representarán el número de bacterias que invadieron. Este valor se puede restar de las bacterias enumeradas en la placa sin tratamiento con gentamicina para determinar adecuadamente las bacterias adherentes e invadidas. También se pueden realizar análisis paralelos para obtener más información sobre la replicación intracelular de Shigella dentro de las células HT-29 después de la invasión, por ejemplo, utilizando múltiples puntos de tiempo para realizar curvas de crecimiento intracelular. Finalmente, junto con la enumeración de bacterias intracelulares después de una incubación de gentamicina de 18 h, los sobrenadantes de cultivo se pueden recolectar y analizar para detectar la secreción de citocinas de células HT-29 infectadas. Por ejemplo, la IL-8 es una quimiocina secretada por las células epiteliales que funciona en gran medida para reclutar PMN en el sitio de la infección. La cantidad de IL-8 secretada en los medios de cultivo de células HT-29 infectadas puede analizarse con un ensayo ELISA de IL-867.
Las sales biliares han demostrado ser una señal de virulencia importante para Shigella durante el tránsito a través del sistema gastrointestinal humano, y se pueden usar para complementar los medios de crecimiento bacteriano en estos protocolos para replicar las condiciones gastrointestinales típicas. Naturalmente, las sales biliares se introducen en el duodeno o en la parte superior del intestino delgado para ayudar en la digestión; y en el íleon terminal o extremo del intestino delgado, el 95% de las sales biliares se eliminan y se reciclan de nuevo en circulación para su depósito final en la vesícula biliar68. Las sales biliares suelen tener una concentración entre el 0,2% y el 2,0% (p/v) en el intestino delgado y son bactericidas por naturaleza. Sin embargo, Shigella, junto con la mayoría de las bacterias entéricas, resiste las sales biliares y utiliza las señales para aumentar la infección47. Varios estudios han documentado cómo la exposición a las sales biliares, a veces junto con otras señales del intestino delgado como la glucosa, afecta la supervivencia de Shigella y la regulación de la virulencia antes de la infección. Se ha demostrado que Shigella resiste las sales biliares, altera la expresión génica y forma y dispersa una biopelícula en condiciones que reproducen el tránsito del intestino delgado17,69. Los estudios han demostrado que estos cambios dan lugar a un fenotipo hipervirulento, en el que la adherencia y la invasión son inducidas tras la posterior infección colónica por Shigella 17,18,19,48,66. Por lo tanto, las condiciones descritas anteriormente documentan cómo subcultivar Shigella en sales biliares para imitar el tránsito del intestino delgado antes de realizar los ensayos de adherencia, invasión o replicación intracelular. La formulación TSB especificada contiene glucosa añadida en relación con el caldo típico de Luria (LB)17. Por lo tanto, si se utiliza LB, es importante complementar también el medio con glucosa (0,5%-2,0% [p/v]) para considerar adecuadamente las señales de glucosa en el intestino delgado17. Además, como se mencionó anteriormente, todos los subcultivos de Shigella se lavan para eliminar las sales biliares e imitar la transición al colon para los análisis de infecciones.
Tradicionalmente, y como se destaca en los resultados anteriores (Figura 1 y Figura 2), los ensayos de infección son valiosos para determinar el papel de un gen particular en la infección por Shigella . Sin embargo, es posible que el fenotipo de varios mutantes no se aprecie realmente sin la suplementación adecuada de los medios de cultivo bacterianos. Como han demostrado investigaciones anteriores, las sales biliares alteran significativamente la expresión génica de S. flexneri , incluidos los genes del metabolismo central, los factores de transcripción, los transportadores de azúcar, la resistencia a los medicamentos y los genes de virulencia codificados en el cromosoma o en el plásmido de virulencia17. Estos genes proporcionan información sobre cómo Shigella utiliza las sales biliares como una señal para alterar la expresión génica y prepararse para una eventual infección del colon, por lo que los análisis mutacionales posteriores deben realizarse en los medios de crecimiento bacteriano suplementados apropiados antes de examinar los efectos sobre la virulencia en los ensayos de adherencia, invasión y replicación intracelular. Como se ha visto anteriormente en la Figura 1 y la Figura 2, la mutación ΔFV no afectó a la adherencia, pero sí a la invasión y a la replicación intracelular. Dado que la mutación mejoró la invasión y la replicación intracelular, actualmente se están llevando a cabo experimentos para determinar cómo el producto génico regula la infección. Los análisis de mutantes sirven como ejemplo de cómo se pueden estudiar nuevos conocimientos sobre la patogénesis de Shigella , especialmente en condiciones que replican mejor el tracto gastrointestinal humano. Se recomienda realizar análisis de complementación adecuados para validar los fenotipos de varios mutantes.
En combinación, estos procedimientos describen experimentos cuantitativos que proporcionarán información importante sobre los mecanismos moleculares de la adhesión, invasión y replicación de Shigella dentro de las células epiteliales colónicas HT-29 al imitar mejor el entorno natural del tracto gastrointestinal humano durante la infección. Los estudios futuros pueden ampliar los mutantes y las condiciones experimentales para obtener una mejor comprensión de cómo Shigella se prepara e infecta eficazmente a los huéspedes humanos. A pesar de décadas de investigación, todavía hay mucho más por descubrir sobre la infección por Shigella.

Las enfermedades diarreicas causadas por patógenos bacterianos entéricos son una importante carga para la salud mundial. En 2016, las enfermedades diarreicas fueron responsables de 1,3 millones de muertes en todo el mundo y fueron la cuarta causa de muerte en niños menores de cinco años 1,2. El patógeno bacteriano entérico gramnegativo Shigella es el agente causal de la shigelosis, una de las principales causas de muerte diarreica en todo el mundo3. La shigelosis causa una morbilidad y mortalidad significativas cada año en niños de países de ingresos bajos y medianos 4,5, mientras que las infecciones en los países de ingresos altos están relacionadas con brotes de guarderías, transmitidos por los alimentos y por el agua 6,7,8,9. El desarrollo ineficaz de vacunas10 y el aumento de las tasas de resistencia a los antimicrobianos (RAM)11,12 han complicado el tratamiento de los brotes de Shigella a gran escala. Datos recientes de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades muestran que casi el 46% de las infecciones por Shigella en los Estados Unidos mostraron resistencia a los medicamentos en 202013,14, mientras que la Organización Mundial de la Salud ha declarado a Shigella como un patógeno prioritario de la resistencia a los antimicrobianos para el que se necesitan urgentemente nuevas terapias15.
Las infecciones por Shigella se transmiten fácilmente por vía fecal-oral tras la ingestión de alimentos o agua contaminados, o por contacto humano directo. Shigella ha evolucionado hasta convertirse en un patógeno eficiente y adaptado al ser humano, con una dosis infecciosa de 10-100 bacterias suficiente para causar la enfermedad16. Durante el tránsito del intestino delgado, Shigella está expuesta a señales ambientales, como temperatura elevada y bilis17. La detección de estas señales induce cambios transcripcionales para expresar factores de virulencia que potencian la capacidad de la bacteria para infectar el colon humano 17,18,19. Shigella no invade el epitelio colónico desde la superficie apical, sino que transita a través de la capa epitelial después de ser absorbida por células especializadas de micropliegues presentadores de antígenos (células M) dentro del epitelio asociado al folículo 20,21,22. Después de la transcitosis, las células de Shigella son fagocitadas por los macrófagos residentes. Shigella escapa rápidamente del fagosoma y desencadena la muerte celular de los macrófagos, lo que resulta en la liberación de citoquinas proinflamatorias 5,23,24. A continuación, Shigella invade las células epiteliales del colon desde el lado basolateral, lisa la vacuola macropinocítica y establece un nicho replicativo en el citoplasma 5,25. Las citocinas proinflamatorias, en particular la interleucina-8 (IL-8), reclutan leucocitos neutrófilos polimorfonucleares (PMN) en el sitio de la infección, lo que debilita las uniones estrechas epiteliales y permite la infiltración bacteriana del revestimiento epitelial para exacerbar la infección basolateral5. Las PMN destruyen el revestimiento epitelial infectado para contener la infección, lo que da lugar a los síntomas característicos de la disentería bacilar (sanguinolenta)5. Aunque los mecanismos de invasión y replicación intracelular han sido ampliamente caracterizados, nuevas investigaciones están demostrando nuevos conceptos importantes en la infección por Shigella, incluyendo la regulación de la virulencia durante el tránsito gastrointestinal (GI)17, la adherencia19, la mejora del acceso basolateral a través de la permeabilidad de barrera26 y el porte asintomático en niños desnutridos27.
La capacidad de Shigella spp. para causar enfermedades diarreicas está restringida a humanos y primates no humanos (NHP)28. Se han desarrollado modelos de infección intestinal por Shigella para pez cebra29, ratones30, cobayas31, conejos 21,32,33 y cerdos34,35. Sin embargo, ninguno de estos sistemas modelo puede replicar con precisión las características de la enfermedad observadas durante la infección humana36. Aunque se han establecido modelos NHP de shigelosis para estudiar la patogénesis de Shigella, estos sistemas modelo son costosos de implementar y requieren dosis infecciosas artificialmente altas, hasta nueve órdenes de magnitud más altas que la dosis infecciosa de los humanos 37,38,39,40,41,42. Por lo tanto, la notable adaptación de Shigella para la infección de huéspedes humanos requiere el uso de cultivos celulares derivados de humanos para recrear modelos fisiológicamente relevantes para un interrogatorio preciso de la patogénesis de Shigella.
Aquí, se describen procedimientos detallados para medir las tasas de adherencia de Shigella , invasión y replicación dentro de las células epiteliales del colon HT-29. Utilizando estos protocolos estandarizados, se pueden interrogar los mecanismos moleculares por los cuales los genes de virulencia bacteriana y las señales ambientales afectan cada paso de la infección por Shigella para comprender mejor la relación dinámica de interacción huésped-patógeno.

<table><tbody><tr><td>0,22 y mu; m Filtro de PES</td><td>Millipore-Sigma</td><td>SCGP00525</td><td>Filtro estéril de polietersulfona para esterilizar medios de hasta 50 mL</td></tr><tr><td>Tubos de cultivo de 14 mL</td><td>Corning</td><td>352059</td><td>Tubos de ensayo de polipropileno de 17 mm x 100 mm con tapón</td></tr><tr><td>Tubos cónicos de 50 mL</td><td>Corning</td><td>430829</td><td>50 mL de polipropileno transparente tubos de centrífuga de fondo cónico con tapa a prueba de</td></tr><tr><td>fugas Placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos</td><td>Corning</td><td>3516</td><td>Las placas están tratadas para una fijación óptima de las células</td></tr> Sales <tr><td>biliares</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8756</td><td>Proporción 1:1 de colato a desoxicolato</td></tr><tr><td>Colorante rojo del Congo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6277</td><td>Un colorante diazo aniónico a base de bencidina, >85% de pureza</td></tr><tr><td>Portaobjetos de la cámara de recuento de células Countess</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td>Para usar con el contador de células automatizado Countess Dimethyl sulfóxido</td></tr><tr><td>(DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>A un reactivo orgánico altamente polar</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Medio de águila modificado (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>10569-010</td><td>DMEM se complementa con alto contenido de glucosa, piruvato de sodio, GlutaMAX y fenol Suero</td></tr><tr><td>bovino fetal rojo (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td>Gentamicina estéril e inactivada por calor</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3632</td><td>La concentración de existencias es de 50 mg/mL</td></tr><tr><td>Línea celular HT-29</td><td>ATCC</td><td>HTB-38</td><td>Línea celular de adenocarcinoma; colorrectal en origen</td></tr><tr><td>Película de parafina</td><td>Bemis</td><td>PM999</td><td>Película de sellado de laboratorio Placas de</td></tr><tr><td>Petri</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td>100 mm x 15 mm Placas de Petri para medios sólidos</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific 10010049</td><td></td><td>concentración 1x; pH 7.4</td></tr><tr><td>Seleccionar agar</td><td>Invitrogen</td><td>30391023</td><td>Una mezcla de polisacáridos extraídos de las paredes celulares de las algas rojas para hacer medios de recubrimiento bacteriano</td></tr><tr><td>Matraces T75</td><td>Corning</td><td>430641U</td><td>Matraces</td></tr><tr><td>de cultivo de tejidos Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Un tensioactivo y emulsionante no iónico común &nbsp;</td></tr><tr><td>Tinción de azul de tripán</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td>Un colorante para detectar células muertas de cultivo de tejidos; solo las células vivas pueden excluir el colorante</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>Reactivo para la disociación celular para el mantenimiento y paso de líneas</td></tr><tr><td>celulares Caldo de soja tríptico (TSB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8907</td><td>Medios de crecimiento bacteriano</td></tr></tbody></table>

análisis de infección de células epiteliales con shigella

Epithelial Cell Infection Analyses with Shigella

Shigella, patógeno bacteriano entérico adaptado al ser humano, causa millones de infecciones cada año, crea efectos de crecimiento a largo plazo entre los pacientes pediátricos y es una de las principales causas de muertes diarreicas en todo el mundo. La infección induce diarrea acuosa o sanguinolenta como resultado de que el patógeno transita por el tracto gastrointestinal e infecta las células epiteliales que recubren el colon. Con el asombroso aumento de la resistencia a los antibióticos y la actual falta de vacunas aprobadas, los protocolos de investigación estandarizados son fundamentales para estudiar este formidable patógeno. Aquí, se presentan metodologías para examinar la patogénesis molecular de Shigella utilizando análisis in vitro de adherencia bacteriana, invasión y replicación intracelular en células epiteliales del colon. Antes de los análisis de infección, el fenotipo de virulencia de las colonias de Shigella se verificó mediante la absorción del colorante rojo Congo en placas de agar. También se pueden considerar medios de laboratorio suplementados durante el cultivo bacteriano para imitar las condiciones in vivo. A continuación, las células bacterianas se utilizan en un protocolo estandarizado para infectar las células epiteliales del colon en placas de cultivo de tejidos en una multiplicidad establecida de infección con adaptaciones para analizar cada etapa de la infección. Para los ensayos de adherencia, las células de Shigella se incuban con niveles reducidos de medios para promover el contacto bacteriano con las células epiteliales. Tanto para los ensayos de invasión como para los de replicación intracelular, la gentamicina se aplica durante varios intervalos de tiempo para eliminar las bacterias extracelulares y permitir la evaluación de la invasión y/o la cuantificación de las tasas de replicación intracelular. Todos los protocolos de infección enumeran las bacterias adherentes, invadidas y/o intracelulares mediante la dilución en serie de lisados de células epiteliales infectadas y la siembra de unidades formadoras de colonias bacterianas en relación con los títulos de infección en placas de agar rojo Congo. En conjunto, estos protocolos permiten la caracterización independiente y las comparaciones para cada etapa de la infección por Shigella de las células epiteliales para estudiar este patógeno con éxito.

Se realizaron ensayos de adherencia, invasión y replicación intracelular comparando el tipo salvaje (WT) de S. flexneri 2457T con el ΔVF (ΔVF) de S. flexneri, un mutante que se supone que regula negativamente la virulencia de Shigella. Dado que Shigella utiliza sales biliares como señal para regular la virulencia 17,18,47, los experimentos se realizaron después de un subcultivo bacteriano en medios TSB, así como TSB suplementada con sales biliares al 0,4% (p/v) 18. La exposición a las sales biliares durante la etapa de subcultivo actúa como un pretratamiento para replicar el tránsito del intestino delgado antes de la infección colónica 17,18,47. En la Figura 1 se analiza el efecto de la mutación ΔVF sobre la capacidad de S. flexneri para adherirse a las células epiteliales colónicas HT-29. El porcentaje de adherencia se representa en el eje Y y representa la proporción de bacterias recuperadas después de la lisis HT-29 estandarizada con respecto al número de bacterias de entrada. Como era de esperar, tanto las cepas de S. flexneri WT como ΔVF tuvieron un aumento significativo en la adherencia cuando se subcultivaron con suplementación con sales biliares en comparación con TSB sin suplementación con sales biliares18. Sin embargo, no hubo diferencias en la adherencia a las células HT-29 entre las cepas mutantes WT y ΔVF dentro de cada condición de subcultivo. Estos datos indican que la mutación ΔVF no tiene ningún efecto sobre la capacidad de S. flexneri para adherirse a las células epiteliales HT-29 con o sin el tratamiento previo de las sales biliares.
En la Figura 2, se analizó el efecto de la mutación ΔVF sobre la capacidad de S. flexneri para invadir (Figura 2A) y replicarse (Figura 2B) dentro de las células epiteliales colónicas HT-29 con o sin sales biliares pre-tratamiento. El porcentaje de recuperación se representa en el eje Y y representa la proporción de células bacterianas recuperadas después de la lisis celular HT-29 estandarizada con respecto al número de bacterias de entrada. En la Figura 2A, se esperaba un aumento significativo en la capacidad de WT S. flexneri 2457T para invadir las células HT-29 después de la preexposición a las sales biliares48, mientras que el mutante S. flexneri ΔVF mostró un aumento menor en la invasión después de la preexposición a las sales biliares en comparación con la cepa WT. El mutante ΔVF tuvo mayores tasas de invasión de células HT-29 en comparación con el WT subcultivado en TSB, pero tuvo tasas de invasión similares a las de WT cuando se subcultivó en TSB suplementado con sales biliares (Figura 2A). Estos resultados sugieren que la mutación ΔVF mejora la capacidad de S. flexneri para invadir las células HT-29, lo que disminuye el efecto de las sales biliares antes de la exposición, a pesar de que la capacidad de invasión del mutante ΔVF aumentó aún más después del subcultivo de sales biliares.
En general, se recuperaron 10 veces más bacterias después de la incubación nocturna (Figura 2B) en comparación con la incubación de 90 minutos (Figura 2A), lo que demuestra las diferencias en el monitoreo del crecimiento intracelular frente a la invasión, respectivamente. Cuando las células HT-29 infectadas se incubaron durante 18 h para permitir la replicación intracelular de la bacteria (Figura 2B), el impacto del pretratamiento con sales biliares disminuyó tanto para las cepas WT como para ΔVF . Sin embargo, el efecto reducido del pretratamiento de las sales biliares durante la replicación intracelular fue más dramático para el mutante ΔVF . Dado que el aumento en la replicación intracelular de ambas cepas cuando se preexpusieron a las sales biliares fue menor que el aumento en las tasas de invasión en las mismas condiciones, planteamos la hipótesis de que las sales biliares tienen un mayor impacto en los primeros pasos en la patogénesis de S. flexneri . El mutante ΔVF mostró un aumento en el porcentaje de recuperación de la replicación nocturna dentro de las células HT-29 en comparación con WT (Figura 2B) después de ambas condiciones de subcultivo. Sin embargo, el porcentaje de recuperaciones del mutante ΔVF fue similar independientemente de las sales biliares antes de la exposición. Estas tendencias de datos sugieren que el mutante ΔVF se replica de manera más eficiente dentro de las células HT-29 en comparación con WT, y que la preexposición a las sales biliares no afecta la capacidad del mutante ΔVF para replicarse intracelularmente, como se observó para WT (Figura 2B). Dado que la diferencia entre las cepas mutantes y WT en la condición previa a la exposición a las sales biliares no se observó durante el ensayo de invasión de 90 minutos, planteamos la hipótesis de que el producto codificado por el gen VF delecionado también puede regular la replicación de S. flexneri dentro de las células HT-29. Combinados, ambos análisis demuestran que el mutante ΔVF es más virulento en relación con WT, lo que sugiere que el producto del gen VF es un regulador negativo de la virulencia de S. flexneri .
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66426/66426fig01.jpg"> Figura 1: Adherencia inducida por sales biliares antes de la exposición de S. flexneri a las células HT-29. Las células mutantes WT y ΔVF de S. flexneri 2457T se subcultivaron en TSB o TSB suplementadas con medios de sales biliares (TSB+BS) al 0,4% (p/v). A continuación, las bacterias se aplicaron a las células HT-29 a una multiplicidad de infección (MOI) de 100 y se incubaron durante 3 h para examinar la adherencia. Después de la incubación, las células HT-29 infectadas se lavaron y lisaron, y se sembraron diluciones seriadas de bacterias recuperadas para enumerar las unidades formadoras de colonias por ml (UFC/ml). El número de bacterias adherentes se representa en relación con los títulos de bacterias de entrada para establecer el porcentaje de adherencia. Los datos son representativos de una réplica biológica con tres réplicas técnicas (puntos individuales). Las barras de error indican el error estándar de la media (SEM). La significación estadística se determinó mediante la prueba t de Student (*p &lt; 0,05; ***p &lt; 0,001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66426/66426fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66426/66426fig02.jpg"> Figura 2: Las sales biliares antes de la exposición aumentaron la invasión de WT S. flexneri y la replicación intracelular. Las células mutantes WT y ΔVF de S. flexneri 2457T se subcultivaron en TSB o TSB suplementadas con medios de sales biliares (TSB+BS). A continuación, las bacterias se aplicaron a las células HT-29 a un MOI de 100, se centrifugaron en las células y se incubaron a 37 °C con 5% de CO2 durante 45 min. Las células se lavaron con PBS y las bacterias extracelulares se lisaron mediante la adición de gentamicina al DMEM para recuperar exclusivamente las bacterias intracelulares. Después de 90 min (A, invasión bacteriana) o 18 h (B, replicación intracelular), las células HT-29 infectadas se lavaron y lisaron, y se sembraron diluciones seriadas de bacterias recuperadas para enumerar las unidades formadoras de colonias por mL (UFC/mL). El número de bacterias intracelulares se representa en relación con los títulos de bacterias de entrada para establecer el porcentaje de recuperación. Los datos son representativos de una réplica biológica, cada una con tres réplicas técnicas (puntos individuales). Las barras de error indican SEM. La significación estadística se determinó mediante una prueba t de Student (*p &lt; 0,05). Tenga en cuenta las diferencias en las escalas del eje Y entre los paneles (A) y (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66426/66426fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

El presente protocolo describe ensayos de infección para interrogar la adherencia, invasión y replicación intracelular de Shigella utilizando líneas celulares epiteliales in vitro .

Análisis de Infección de Células Epiteliales con Shigella

The human-adapted enteric bacterial pathogen Shigella causes millions of infections each year, creates long-term growth effects among pediatric patients, ...

La Shigella es un importante patógeno mundial que causa tasas de infección devastadoras cada año. La Shigella infecta el tracto gastrointestinal y causa diarrea o disentería. Nuestra investigación tiene como objetivo mejorar nuestra comprensión de la infección para ayudar a desarrollar terapias más efectivas, como vacunas y otros productos antimicrobianos.En primer lugar, los modelos animales y las técnicas emergentes de cultivo de tejidos nos permiten comprender mejor la fisiología de la infección por Shigella y reproducir fielmente la complejidad del tracto gastrointestinal humano. En segundo lugar, la caracterización de los aislados clínicos de Shigella ha ayudado a capturar la diversidad de este género, identificar genes de virulencia importantes y mejorar nuestra comprensión de la infección. Hemos utilizado señales gastrointestinales como las sales biliares y la glucosa para comprender cómo la Shigella sobrevive al tránsito en el intestino delgado y regula la expresión génica de la virulencia para la infección en el intestino grueso.Hemos demostrado cómo la Shigella resiste a las sales biliares y hemos demostrado que la Shigella produce proteínas de adherencia para ayudar a iniciar el contacto con las células epiteliales para iniciar la infección. Estos protocolos están diseñados para analizar aspectos clave de la infección epitelial, como la adherencia, la invasión y la supervivencia intracelular de Shigella. Estamos realizando estos protocolos utilizando una línea celular epitelial estándar, pero también hemos adaptado los métodos para modelos gastrointestinales humanos sofisticados que ahora están disponibles.Estos protocolos consideran cada fase de la infección de forma independiente, lo cual es fundamental para comprender los pasos clave en la infección por Shigella. También destacan que los análisis combinados pueden facilitar una mayor comprensión de la infección por Shigella a nivel holístico.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Fuente: Vonaesch, P. et. al., Análisis de inmunofluorescencia de la formación de gránulos de estrés tras un desafío bacteriano en células de mamíferos. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demuestra la infección de las células epiteliales con la bacteria patógena Shigella flexneri y la respuesta celular del huésped resultante. Las proteínas efectoras bacterianas interrumpen la traducción del huésped, desencadenando la formación de orgánulos sin membrana llamados gránulos de estrés, que reflejan la...

Formación de gránulos de estrés durante la infección por Shigella de células epiteliales cancerosas

Source: Poore, K., et al. Epithelial Cell Infection Analyses with Shigella. J. Vis. Exp. (2024)This video demonstrates an in vitro assay to assess Shigella invasion and intracellular replication in human colonic epithelial monolayers. It highlights steps for infection, antibiotic selection, host cell lysis, and recovery of intracellular bacteria for downstream analysis.

Intracellular Replication Assay for Shigella in Human Colonic Epithelial Cells

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Aprende ensayos de infección con Shigella en líneas celulares epiteliales para estudiar adherencia, invasión y replicación intracelular. Este método ayuda a desarrollar terapéuticas efectivas contra infecciones bacterianas.

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