Name: Modelo murino de íleo postoperatorio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-12T13:10:00.000+00:00
Duration: 4 min 26 s
Description: Aprende a establecer un modelo murino de íleo postoperatorio mediante manipulación intestinal. Este método permite estudiar la fisiopatología y evaluar nuevas estrategias antiinflamatorias en inmunidad intestinal.

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<meta charset="utf8"></head><body>Modelo murino para el estudio del íleo postoperatorio mediante manipulación intestinal

<ol><li>Chapman, S. J., Pericleous, A., Downey, C., Jayne, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postoperative+ileus+following+major+colorectal+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Surg%22%5BJournal%5D)">Postoperative ileus following major colorectal surgery.</a> Br J Surg. 105 (7), 797-810 (2018).</li>
<li>Farro, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR2-dependent+monocyte-derived+macrophages+resolve+inflammation+and+restore+gut+motility+in+postoperative+ileus%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">CCR2-dependent monocyte-derived macrophages resolve inflammation and restore gut motility in postoperative ileus.</a> Gut. 66 (12), 2098-2109 (2017).</li>
<li>Wouters, M. M., Vicario, M., Santos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mast+cells+in+functional+GI+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">The role of mast cells in functional GI disorders.</a> Gut. 65 (1), 155-168 (2016).</li>
<li>Engel, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+helper+type+1+memory+cells+disseminate+postoperative+ileus+over+the+entire+intestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">T helper type 1 memory cells disseminate postoperative ileus over the entire intestinal tract.</a> Nat Med. 16 (12), 1407-1413 (2010).</li>
<li>Schwartz, C., Voehringer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+murine+basophils+by+flow+cytometry+and+histology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of murine basophils by flow cytometry and histology.</a> Methods Mol Biol. 2163, 367-375 (2020).</li>
<li>Funk, E. K., Weissbrod, P., Horgan, S., Orosco, R. K., Califano, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+experience+with+a+novel+single-port+platform+for+transoral+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Surg+Endosc%22%5BJournal%5D)">Preclinical experience with a novel single-port platform for transoral surgery.</a> Surg Endosc. 35 (8), 4857-4864 (2021).</li>
<li>Nemoto, S., Mailloux, A. W., Kroeger, J., Mulé, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OMIP-031%3A+Immunologic+checkpoint+expression+on+murine+effector+and+memory+T-cell+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">OMIP-031: Immunologic checkpoint expression on murine effector and memory T-cell subsets.</a> Cytometry A. 89 (5), 427-429 (2016).</li>
<li>Brandi, J., Wiethe, C., Riehn, M., Jacobs, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OMIP-93%3A+A+41-color+high+parameter+panel+to+characterize+various+co-inhibitory+molecules+and+their+ligands+in+the+lymphoid+and+myeloid+compartment+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">OMIP-93: A 41-color high parameter panel to characterize various co-inhibitory molecules and their ligands in the lymphoid and myeloid compartment in mice.</a> Cytometry A. 103 (8), 624-630 (2023).</li>
<li>Swidsinski, A., Weber, J., Loening-Baucke, V., Hale, L. P., Lochs, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+organization+and+composition+of+the+mucosal+flora+in+patients+with+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Spatial organization and composition of the mucosal flora in patients with inflammatory bowel disease.</a> J Clin Microbiol. 43 (7), 3380-3389 (2005).</li>
<li>Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Swiss-rolling+technique+for+intestinal+tissue+preparation+for+immunohistochemical+and+immunofluorescent+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses.</a> J Vis Exp. (113), e54161(2016).</li>
<li>van Bree, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+method+for+studying+postoperative+ileus+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Physiol+Pathophysiol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Novel method for studying postoperative ileus in mice.</a> Int J Physiol Pathophysiol Pharmacol. 4 (4), 219-227 (2012).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1 M HEPES</td><td>Thermo 15630080</td><td></td><td></td></tr><tr><td>APC anti-ratón I-A/I-E (MHC-II)</td><td>Biolegend</td><td>107614</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-ratón TCRb</td><td>Biolegend</td><td>109212</td><td></td></tr><tr><td>APC/Cy7 anti-ratón CD4 Biolegend</td><td></td><td>100414</td><td></td></tr><tr><td>APC/Cy7 anti-ratón Ly6G</td><td>Biolegend</td><td>127624</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 anti-ratón CD69</td><td>Biolegend</td><td>104545</td><td></td></tr><tr><td>Violeta Brillante 421 anti-ratón F4/80</td><td>Biolegend</td><td>123132</td><td></td></tr><tr><td>Violeta Brillante 785 anti-ratón/humano CD44</td><td>Biolegend</td><td>103041</td><td></td></tr><tr><td>BUV395 anti-ratón CD8a</td><td>BD</td><td>563786</td><td></td></tr><tr><td>BUV737 anti-ratón CD3e</td><td>BD</td><td>612771</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de cultivo</td><td>CKX53</td><td>Olympus</td><td></td></tr><tr><td>Desoxirribonucleasa I de páncreas bovino (<fuerte>DNasa I</fuerte>)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25-5G</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol solución</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43816-10ML</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS-100G</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-ratón CD45</td><td>Biolegend</td><td></td><td></td>147709</tr><tr><td>FITC-dextrano (70 kWM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD70-100MG Ensayo de</td><td>tránsito gastrointestinal</td></tr><tr><td>kit de tinción HE</td><td>solarbio</td><td>G1120</td><td></td></tr><tr><td>PE anti-ratón CD11b Biolegend</td><td></td><td>101208</td><td></td></tr><tr><td>PE anti-ratón PD-1 Biolegend</td><td></td><td>114118</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 anti-ratón CD11c</td><td>Biolegend</td><td>117318</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE (Farmacia)</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Symphony A5 Citómetro de flujo</td><td>BD-Detección</td><td></td> <td>y clasificación de células inmunitarias</td></tr><tr><td>Tribromoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402</td><td>Anestesia</td></tr><tr><td>Varioskan LUX</td><td>Thermo</td><td>N16699</td><td>Lector de microplacas multimodo</td></tr><tr><td>Zombie Aqua Kit de viabilidad fijable</td><td>Biolegend</td><td>423102</td><td>Fluorescente tinte de viabilidad&nbsp;</td></tr></tbody></table>

modelo murino de íleo postoperatorio

Postoperative Ileus Murine Model

En este protocolo, la POI fue inducida quirúrgicamente por manipulación intestinal (IM), que es similar al efecto de la cirugía clínica. En el grupo simulado, se realizó una incisión sin el IM. Los ratones POI fueron sacrificados 24 horas después de la cirugía POI junto con ratones de control simulados. La función crítica del tracto digestivo, la función de tránsito del contenido, se detectó por sonda nasogástrica de FITC-dextrano. El modelo POI se consideró exitoso porque la intensidad de FITC aumentó en la parte proximal del intestino delgado (Figura 2B). Se calcularon las medias de GC para cuantificar la disfunción del tránsito del MI e indicar la consistencia de la operación (Figura 2C).
La tinción HE indicó la morfología de diferentes segmentos del tracto digestivo (Figura 3). La submucosa y la capa de músculo liso del duodeno y el íleon se hincharon 24 h después de la inducción de la IOP (Figura 3A,B). En comparación con las de ratones simulados, la tinción HE del duodeno reveló un aumento de la infiltración de células inmunitarias en ratones POI (Figura 3A).
El análisis citométrico de flujo multicolor es el método central para analizar la proporción, el estado y la función de las células inmunitarias. El tejido intestinal se digirió con colagenasa y desoxirribonucleasa y se separó en una suspensión unicelular para la citometría de flujo. Se utilizó la estrategia de compuerta para determinar las proporciones de linfocitos T CD3 y subpoblaciones relacionadas entre los LPL (Figura 4A). El marcador de activación y adhesión CD69 y la expresión de los linfocitos T CD4, los linfocitos T CD8 y los linfocitos T gd están regulados al alza en ratones POI (Figura 4B)7. Del mismo modo, la proporción de la subpoblación CD44+ PD-1+ (marcador de activación, diferenciación terminal y agotamiento) mostró una tendencia creciente (Figura 4C)7. Además de los linfocitos, las proporciones de subconjuntos de células mieloides (neutrófilos, células dendríticas y macrófagos) también aumentan después de la cirugía IM (Figura 4D)8.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66465/66465fig1v2.jpg"> 
Figura 1: Modelo murino de íleo postoperatorio. (A) Esquema del modelo murino de íleo postoperatorio. (B) Fijación del ratón después de la anestesia y el afeitado. (C) La incisión fue expuesta y cubierta con una gasa médica estéril. (D) Los tubos intestinales se exprimieron fuera de la cavidad abdominal a través de la incisión abdominal y se expusieron colocándolos sobre gasas estériles. (E) Todo el intestino delgado se expuso a un hisopo de algodón estéril humedecido. (F) La capa muscular se cerró con sutura quirúrgica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66465/66465fig1v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66465/66465fig02v2.jpg"> 
Figura 2: Ensayo de tránsito gastrointestinal para la evaluación de la función del tracto digestivo. A las 22,5 h después de la cirugía, los ratones simulados o POI fueron administrados con solución de FITC-dextrano y sacrificados 90 minutos después. (A) El tracto digestivo se dividió en 15 segmentos y se numeró de acuerdo con la posición fisiológica. (B) Intensidad de FITC de cada segmento del tracto digestivo de ratones simulados y POI. (C) Se calcularon los centros geométricos del FITC-dextrano administrado y se muestran como gráficos de violín. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66465/66465fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66465/66465fig03.jpg"> 
Figura 3: Tinción representativa de HE del intestino delgado de ratones POI. Tinción HE de secciones transversales del duodeno (A) y del íleon (B) de ratones simulados y POI. Barras de escala: 100 μm o 25 μm (imagen ampliada del recuadro). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66465/66465fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66465/66465fig04.jpg"> 
Figura 4: Análisis citométrico de flujo representativo de células inmunitarias del intestino delgado de ratones POI. (A) Estrategia de activación por citometría de flujo para poblaciones de células T de tejidos del intestino delgado de ratones POI 24 horas después de la cirugía. (B) Las proporciones del marcador activo de células T CD69+ en las células T CD4, las células T CD8 y las células T gd del intestino delgado de ratones simulados y POI. (C) Las proporciones de marcadores activos CD44+ PD-1+ entre las células T CD4, las células T CD8 y las células T gd en el intestino delgado de ratones simulados y POI. (D) Las proporciones de neutrófilos (Ly6G+ CD11b+), células dendríticas (CD11c+ MHC-II+) y macrófagos (CD11b+ F4/80+) entre las células inmunitarias vivas CD45+ Aqua- del intestino delgado de ratones simulados y POI. El número de cada panel representa el porcentaje de los respectivos tipos de celda. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66465/66465fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Modelo murino de íleo postoperatorio

Most patients experience postoperative ileus (POI) after surgery, which is associated with increased morbidity, mortality, and hospitalization time. POI ...

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Investigación

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