Name: Tomografía tridimensional de órgano entero de alta resolución de infecciones microbianas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-01T14:35:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Aprende tomografía tridimensional de órgano entero para detectar Salmonella en el bazo durante terapia antibiótica. Este método permite visualizar bacterias individuales y su relación espacial con células inmunes.

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El trabajo contó con el apoyo de la Fundación Nacional Suiza para la Ciencia 310030_156818, 310030_182315 y NCCR_ 180541 AntiResist (a DB).

Seguimiento de patógenos de todo el órgano mediante cuantificación de reporteros fluorescentes

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<li>Nakayama, K., Kelly, S. M., Curtiss III, R. J. B. t <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+an+Asd%2B+expression-cloning+vector%3A+stable+maintenance+and+high+level+expression+of+cloned+genes+in+a+Salmonella%5BTitle%5D)+AND+%22vaccine+strain%22%5BJournal%5D)">Construction of an Asd+ expression-cloning vector: stable maintenance and high level expression of cloned genes in a Salmonella.</a> vaccine strain. 6 (6), 693-697 (1988).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El contexto tisular local de los patógenos bacterianos es crucial para determinar los ataques locales del huésped, las adaptaciones bacterianas, el resultado local de las interacciones entre el huésped y el patógeno y la quimioterapia antimicrobiana, y las contribuciones individuales al resultado general de la enfermedad. Obtener imágenes de bacterias del tamaño de un micrómetro en órganos de centímetros ha sido un desafío. La tomografía seriada de dos fotones (STP) proporciona una resolución espacial suficiente para detectar células bacterianas individuales en órganos completos, secciones e imágenes automatizadas, y un rendimiento suficiente (~1 órgano por día)11. Si bien los antígenos del huésped se pueden teñir in vivo, las células patógenas deben expresar proteínas fluorescentes adecuadas para garantizar una detección completa de las células patógenas intracelulares. Los conjuntos de datos resultantes (0,5-1,5 TeraByte por órgano) plantean desafíos sustanciales para las infraestructuras de TI para el análisis y el almacenamiento de datos.
Hay varios pasos críticos en este método. En primer lugar, se requiere una cepa patógena con expresión detectable y homogénea de la proteína fluorescente GFP o YFP. Idealmente, se utiliza un casete de expresión cromosómica25 para minimizar la heterogeneidad de fluorescencia debido a la variación del número de copias del plásmido. Se requiere una intensidad de fluorescencia suficiente, pero deben evitarse niveles excesivos de proteína fluorescente para evitar alteraciones de la aptitud del patógeno23. Los niveles de expresión apropiados se pueden obtener mediante la selección de un promotor apropiado y el ajuste fino del sitio de unión ribosómico25 o de toda la región no traducida 5' (UTR)26. En segundo lugar, la fijación de la perfusión debe implicar un lavado inicial con tampón para eliminar la mayor cantidad posible de eritrocitos de la circulación sanguínea. Esto es particularmente crítico para el bazo y el hígado (aunque la eliminación completa de eritrocitos de estos órganos es difícil). Los eritrocitos restantes absorben la luz en la parte visible del espectro, comprometiendo la calidad de la imagen27. En tercer lugar, el almacenamiento de los tejidos fijados en el crioprotector es fundamental para reducir la autofluorescencia tisular, que es particularmente alta en los tejidos inflamados y puede eclipsar la fluorescencia comparativamente débil de las células patógenas11. En cuarto lugar, la reticulación efectiva del tejido con el bloque de agarosa circundante es fundamental para un corte suave del vibratomo sin que el tejido salte fuera del bloque de agarosa. En quinto lugar, las señales fluorescentes y su identificación como células patógenas deben verificarse de forma independiente utilizando enfoques ortogonales como la tinción con anticuerpos contra componentes patógenos (como el lipopolisacárido para bacterias gramnegativas) y la microscopía confocal de las secciones extraídas del tomógrafo11. Algunos tejidos infectados contienen partículas autofluorescentes con forma similar y espectros de fluorescencia superpuestos que pueden malinterpretarse fácilmente como células patógenas. En sexto lugar, la cantidad de células patógenas dentro de las microcolonias debe compararse con enfoques ortogonales como la microscopía confocal para evaluar la precisión. Las cargas bacterianas generales basadas en estos cálculos deben verificarse mediante la comparación con enfoques ortogonales como la citometría de flujo y la siembra.
Modificaciones importantes del protocolo STP ampliamente utilizado incluyen la colocación de un filtro de paso de banda estrecho de 510/20 nm frente al fotomultiplicador 211, para reducir la interferencia de la autofluorescencia verde-amarilla que es particularmente fuerte en el hígado infectado e inflamado, el bazo y los parches de Peyer. La fuerte autofluorescencia y el aumento de la dispersión de la luz de dichos órganos en comparación con el cerebro (que domina otras aplicaciones de STP) también genera la necesidad de una corrección más efectiva para la iluminación desigual. Como otra modificación, este protocolo emplea el enfoque CIDRE22 para este propósito (Figura 3) y la segmentación de bacterias basada en IA. Finalmente, el preprocesamiento tisular se modificó al incluir una etapa de incubación en crioprotector a -20 °C que reduce la autofluorescencia tisular y, por lo tanto, facilita la detección de células patógenas pequeñas con fluorescencia relativamente débil11.
La solución de problemas puede ser necesaria si no se pueden detectar señales de patógenos, o si la segmentación produce una sensibilidad insuficiente (se pasan por alto demasiadas células patógenas) o una precisión insuficiente (se segmentan demasiadas partículas de fondo como células patógenas). Si la autofluorescencia del tejido de fondo es detectable pero hay muy pocas señales de patógenos, es posible que los patógenos contengan cantidades insuficientes de proteínas fluorescentes. Esto puede ser probado usando microscopía confocal de secciones de tejido del mismo tejido infectado o citometría de flujo de homogeneizados de tejido19,28. Las razones subyacentes podrían ser niveles de expresión insuficientes o inestabilidad del casete de expresión. Las estrategias de mitigación podrían incluir promotores alternativos para impulsar la expresión, la adaptación al codón de los genes que codifican la proteína fluorescente para la especie patógena, el empleo de construcciones episomales con mayor número de copias o la estabilización de casetes de expresión mediante la integración cromosómica o la complementación letal equilibrada29. La elección de la proteína fluorescente también es importante, pero la detección es posible con GFP.mut2, mWasabi, YPet y TIMERbac. Si la segmentación es inexacta, esto podría deberse a una fluorescencia del patógeno demasiado débil que podría abordarse como se describió anteriormente, o a un fondo de autofluorescencia tisular demasiado alto. La perfusión extensiva de la solución de lavado o la incubación prolongada en el tampón de almacenamiento inmediatamente antes de la inclusión en el bloque de agarosa y la tomografía podrían resolver estos problemas. Por último, se requiere un entrenamiento suficiente de la red neuronal para una clasificación precisa, pero un entrenamiento excesivo puede conducir a un sobreajuste que perjudique el rendimiento de las nuevas muestras.
En la actualidad, ningún otro método puede obtener imágenes de órganos enteros con una resolución espacial suficiente en 3D para detectar bacterias individuales. Las mejoras futuras en la limpieza de tejidos y la microscopía de lámina ligera podrían lograr una resolución similar. Esto podría permitir la obtención de imágenes a mayor velocidad y con más canales fluorescentes.
Una limitación importante de STP es la resolución de píxeles en el plano de ~0,5 μm y la resolución vertical de 5 a 10 μm, que es insuficiente para resolver bacterias muy cercanas, por ejemplo, dentro de una microcolonia densamente empaquetada. Sin embargo, es posible recuperar secciones de tejido después de la tomografía para la microscopía confocal secundaria de alta resolución de partes de tejido seleccionadas. Otra limitación de STP es la disponibilidad de solo tres canales de fluorescencia, lo que restringe el número de fluoróforos que se pueden obtener imágenes simultáneamente. Una vez más, el análisis secundario de las secciones de tejido recuperadas con métodos de multiplexación puede revelar la ubicación y la intensidad de muchos más marcadores para partes de tejido seleccionadas. Esta información podría integrarse en la estructura 3D general del tejido circundante según lo determinado con STP.
En conclusión, este protocolo permite investigaciones detalladas de las interacciones huésped-patógeno a nivel local y de todo el órgano. El protocolo debe ser fácilmente adaptable a otros patógenos (siempre que se puedan obtener como cepas fluorescentes), otros órganos y diferentes especies huésped.

Las infecciones ocurren en tejidos con anatomía compleja y fisiología compartimentada. Los diversos microambientes que coexisten en el tejido infectado pueden determinar el destino de los subconjuntos de patógenos locales y sus contribuciones al resultado general de la enfermedad 1,2,3. Sin embargo, el mapeo 3D exhaustivo de patógenos microbianos en tejidos de tamaño CM sigue siendo un desafío4. La obtención de imágenes del cerebro y otros órganos es un campo de investigación muy activo con estrategias experimentales en constante mejora5, pero muchos métodos aún carecen de la resolución inferior a μm que se requeriría para identificar patógenos bacterianos de tamaño μm con confianza. Por el contrario, la tomografía seriada de dos fotones (STP)6 permite la obtención automática de imágenes multicolor y sin deformaciones de tejidos completos con una resolución en el plano inferior a μm, lo que produce conjuntos de datos volumétricos completos. Este método combina la sección física repetida del tejido utilizando un vibratomo con imágenes intermitentes de dos fotones de las caras de los bloques emergentes con luz infrarroja. La tomografía STP ha sido ampliamente utilizada para mapear axones delgados en el cerebro para establecer mapas de conectividad 7,8,9,10.
La tomografía STP también permite el mapeo 3D de células patógenas microbianas individuales (Salmonella, Toxoplasma) en todos los tejidos infectados11,12 utilizando un tomógrafo. La generación del segundo armónico revela vainas de colágeno alrededor de las arterias y en bandas fibrosas como las trabéculas del bazo, proporcionando así un contexto anatómico. Los anticuerpos fluorescentes inyectados in vivo se pueden utilizar para teñir las células huésped y revelar las interacciones entre las células patógenas individuales y las células inmunitarias infiltrantes, como los neutrófilos. Aquí, se describe la tubería que involucra el procesamiento del tejido, la obtención de imágenes, la unión de mosaicos de imágenes con corrección de iluminación, el apilamiento de imágenes en tres dimensiones y la segmentación mediante herramientas de aprendizaje automático. Esta tubería produce posiciones 3D de patógenos individuales, células y microcolonias dentro de su contexto de huésped. Contar el número de células individuales dentro de las microcolonias sigue siendo difícil debido a los límites de resolución, pero tales números se pueden estimar en función del brillo integrado de la microcolonia. La tubería se puede adaptar fácilmente a otros modelos de infección si se dispone de patógenos recombinantes que expresan GFP o YFP.

<table><tbody><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose Low Melt</td><td>Roth Art</td><td>. 6351.5 25g</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6768-500G</td><td></td></tr><tr><td>Adhesivo instantáneo Loctite 435</td><td>Henkel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Poli(etilenglicol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5413-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Polivinilpirrolidona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PVP-100G</td><td></td></tr><tr><td>Borohidruro de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71321-25g</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Merck</td><td>106453</td><td></td></tr><tr><td>Periodato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>311448-100G</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71640-250G</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio monobásico dihidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71500-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Tetraborato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221732-100g</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>AppliChem</td><td>A4734,1000</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada Tris (TBS)</td><td>Merck</td><td>T5912-1L</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Vacío filtración 500</td><td>TPP</td><td>TPP99250</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Equipo</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blade</td><td>Campden Instruments Limited&nbsp;</td><td>01-01-4692</td><td></td></tr><tr><td>MAITAI</td><td>Laser Spectra-Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Despegar el molde de plástico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6032-1CS</td><td></td></tr><tr><td>Tomógrafo TissueCyte 1000</td><td>TissueVision</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antibody/colorantes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Merck</td><td>D9542-5MG</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Primary anticuerpos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-LPS Salmonella, conejo</td><td>Sifin</td><td>REF TS 1624</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD169-PE, clon 3D6.112</td><td>Biolegend&nbsp;</td><td></td><td></td>142403</tr><tr><td>anti-Ly-6G-PE, clon 1A8</td><td>Biolegend&nbsp;</td><td>127608</td><td></td></tr><tr><td>Secondary antibodies</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pollo anti-conejo Alexa 647</td><td>Invitrogen</td><td>A-21443</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td>Company</td><td>Version</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>Image J</td><td>1.54g o posterior</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>2017b/2018b o posterior</td><td></td></tr><tr><td>Orchestrator (tomógrafo)</td><td>TissueVision</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software de visualización Imaris</td><td>Oxford Instruments</td><td>9.9.0 o posterior</td><td></td></tr></tbody></table>

tomografía tridimensional de órgano entero de alta resolución de infecciones microbianas

High&#45;Resolution Three&#45;Dimensional Whole&#45;Organ Tomography of Microbial Infections

La mayoría de las infecciones tienen lugar dentro de tejidos tridimensionales del huésped con una anatomía intrincada y una fisiología del huésped que varía localmente. La posición de las células patógenas dentro de este entorno diverso afecta significativamente sus niveles de estrés, respuestas, destino y contribución a la progresión general de la enfermedad y al fracaso del tratamiento. Sin embargo, debido a las dificultades técnicas para localizar células patógenas de tamaño μm dentro de órganos huésped de tamaño cm, esta área de investigación ha sido relativamente inexplorada. Aquí, presentamos un método para abordar este desafío. Empleamos tomografía seriada de dos fotones y análisis de imágenes mejorado por IA para localizar células individuales de Salmonella en todo el bazo, los lóbulos del hígado y los ganglios linfáticos completos de ratones infectados. Mediante el uso de reporteros fluorescentes y la administración de anticuerpos in vivo , se puede determinar la tasa de replicación de células individuales de Salmonella , su interacción local con células inmunitarias específicas y las respuestas bacterianas a los antibióticos. Estas metodologías abren vías para un examen exhaustivo de las infecciones, su prevención y tratamiento en el contexto de los tejidos tridimensionales.

El procedimiento descrito permite la detección de células individuales de Salmonella en órganos completos de ratón, como el bazo, el hígado, los ganglios linfáticos mesentéricos y los parches de Peyer11 (Figura 5 y Figura 6). También detecta parásitos Toxoplasma gondii en el cerebro de ratón12. Algunos tejidos infectados, como el hígado, las placas de Peyer y el bazo, emiten una autofluorescencia sustancial en el rango verde-amarillo. La autofluorescencia se ve reforzada por la fijación con paraformaldehído, que es necesaria para preservar la estructura del tejido. La detección de la fluorescencia verde de GFP, mWasabi y el componente verde de TIMERbac contra este fondo de autofluorescencia se mejora colocando un filtro de paso de banda estrecho de 510/20 nm (que transmite la mayoría de las emisiones de GFP pero bloquea una gran parte del espectro de autofluorescencia) frente al fotomultiplicador 2 (que recoge las emisiones verdes) y reduciendo la autofluorescencia tisular almacenando tejidos fijos durante 3 o más días en crioprotector11. Sin embargo, las bacterias aún deben expresar al menos unos pocos miles de copias por célula de GFP u otras proteínas fluorescentes. Por otro lado, se deben evitar los niveles excesivos de proteínas fluorescentes para minimizar los costos de aptitud física que podrían conducir a una virulencia atenuada23.
La segmentación correcta de las bacterias fluorescentes en los tejidos puede confirmarse mediante inmunohistoquímica de las secciones de tejido recuperadas después de la toma de imágenes. Específicamente, los objetos teñidos con un anticuerpo contra componentes bacterianos de la superficie, como el lipopolisacárido, se pueden alinear con la imagen de fluorescencia obtenida por tomografía STP (Figura 5). Es importante tener en cuenta que algunas células de Salmonella teñidas carecen de proteínas fluorescentes y, por lo tanto, de fluorescencia detectable tanto en la microscopía confocal como en la tomografía STP. Estas células son Salmonella que han sido eliminadas por el sistema inmune del huésped, como lo demuestra la clasificación por citometría de flujo y los cultivos de crecimiento de células individuales clasificadas, así como la estrecha correlación entre el número de unidades formadoras de colonias en placas de agar y el número de células fluorescentes de Salmonella según lo determinado por citometría de flujo24. Además, la pérdida de plásmidos puede dar lugar a células viables no fluorescentes y esto debe probarse mediante siembra en medios con y sin antibióticos apropiados correspondientes al marcador de selección en el plásmido. En el caso de los plásmidos derivados de pSC101, la pérdida de plásmidos in vivo es rara19. Para la mayoría de los casetes de expresión cromosómicamente integrados, como sifB::gfp utilizado en11, la pérdida de expresión es indetectable in vivo. Si la segmentación es incoherente con los datos de inmunohistoquímica, es necesario modificar la canalización de segmentación.
La resolución de la tomografía STP es insuficiente para resolver células bacterianas individuales dentro de microcolonias densamente empaquetadas. Sin embargo, la intensidad de fluorescencia total de la microcolonia permite estimar el número de células de Salmonella . Esto requiere una cepa fluorescente con niveles de fluorescencia altamente homogéneos, como Salmonella sifB::gfp11. La combinación del número estimado de células de Salmonella para todas las microcolonias y células individuales produce cargas totales de tejido bacteriano que son consistentes con métodos alternativos como la siembra o la citometría de flujo de homogeneizados de tejido11. La placa y la citometría de flujo no se pueden realizar directamente desde los mismos tejidos porque deben fijarse por perfusión para la tomografía STP. En cambio, tienen que hacerse con animales adicionales que no son fijos. Si la mediana de las cargas bacterianas determinadas por los distintos enfoques difiere en más de 3 veces, la viabilidad de las bacterias fluorescentes podría verse comprometida (en el caso de las unidades formadoras de colonias más bajas) o algunas bacterias podrían haber perdido la construcción del indicador fluorescente (en el caso de las unidades formadoras de colonias más altas). Se requerirá un experimento de control para identificar la fuente de tales discrepancias.
La tomografía STP proporciona la localización de células bacterianas dentro de la estructura 3D de los tejidos infectados. Las segundas señales armónicas del colágeno proporcionan puntos de referencia anatómicos como arterias y trabéculas. Además, las células huésped se pueden teñir in vivo inyectando un anticuerpo a los marcadores de superficie antes de la perfusión (Figura 5 y Figura 6). Esta tinción proporciona puntos de referencia adicionales para los compartimentos tisulares y microambientes específicos, incluidos los focos de inflamación (los marcadores intracelulares y algunos compartimentos con barreras de difusión, como la pulpa blanca esplénica o el cerebro, no son fácilmente accesibles, adecuados para esta tinción in vivo ). Este enfoque reveló que la pulpa blanca esplénica es un compartimento tisular que permite la supervivencia a largo plazo de Salmonella durante la quimioterapia antimicrobiana11.
Finalmente, la replicación de Salmonella a tasas moderadas o lentas puede ser identificada y localizada dentro de la estructura 3D de los tejidos utilizando cepas que expresan un temporizadorbac, un reportero de una sola célula para la tasa de replicación11,15.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig01.jpg"> Figura 1: Procedimiento para la obtención de imágenes de todo el órgano mediante tomografía seriada de dos fotones (STP). (A-B) El órgano se extrae después de la perfusión transcardíaca y se almacena durante la noche en paraformaldehído al 4% (PFA) a 4 °C. (C-E) El órgano se incrusta en agarosa oxidada y se reticula, luego el tejido se escanea y se corta mediante tomografía STP. Los cortes se recogen para su posterior inmunohistoquímica. (De Padres a Viernes) Canales de análisis computacional para cuantificar el número de bacterias, confirmar bacterias fluorescentes y reconstrucción 3D de posiciones bacterianas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig02.jpg"> Figura 2: Configuración de la tomografía seriada de dos fotones (STP). (A) Tomógrafo que incorpora (B) imágenes de 2 fotones con (C) corte de tejido en serie automatizado. (D) Cortes de tejido recolectados para investigaciones de seguimiento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig03.jpg"> Figura 3: Costura de azulejos y corrección de iluminación. Las baldosas se cosen y la iluminación desigual se corrige mediante distribuciones de intensidad corregidas mediante minimización de energía regularizada (CIDRE). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig04.jpg"> Figura 4: Segmentación de Salmonella que expresa la proteína verde fluorescente (GFP) utilizando una máquina de vectores de soporte (SVM) y una red neuronal convolucional (CNN). (A) Imágenes representativas de objetos GFP segmentados por SVM (izquierda) e imágenes correspondientes (derecha) con regiones segmentadas por SVM (barra de escala: 10 μm). (B) Distribución de valores agrupados rojo-verde-azul (RGB) para las regiones segmentadas. (C) Imágenes representativas de objetos no GFP identificados falsamente por la SVM como bacterias (izquierda). CNN los descarta correctamente como fondo (derecha, barra de escala: 10 μm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig05.jpg"> Figura 5: Detección de Salmonella expresando la proteína verde fluorescente (GFP) por tomografía y confirmación por inmunohistoquímica. Imágenes de la misma sección adquiridas por tomografía (izquierda) o microscopía confocal después de la tinción con un anticuerpo contra el lipopolisacárido de Salmonella (derecha). Los neutrófilos (rojos) se tiñeron mediante la inyección in vivo de un anticuerpo anti-Ly-6G marcado con PE antes de la perfusión. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig06.jpg"> Figura 6: Reconstrucción y localización 3D de Salmonella en bazo de ratón infectado. (A) Reconstrucción tridimensional (3D) de un corte de bazo de 5 mm de espesor y teñido in vivo antes de la perfusión con anticuerpo anti-CD169 (rojo). La señal azul representa el colágeno detectado por segundos armónicos. (B) Un plano óptico de la pila 3D que se muestra en (A). Las posiciones de las células o microcolonias de Salmonella están indicadas por estrellas. (C) Reconstrucción 3D de las posiciones (estrellas) de Salmonella en el hígado infectado. Las arterias son visibles en función de sus vainas de colágeno (azul). Barra de escala: 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Aquí, describimos un procedimiento que permite la detección de bacterias patógenas en todo el órgano durante la infección y la cuantificación de las actividades de los reporteros fluorescentes.

Tomografía tridimensional de órgano entero de alta resolución de infecciones microbianas

Most infections take place within three-dimensional host tissues with intricate anatomy and locally varying host physiology. The positioning of pathogen ...

Las infecciones bacterianas son una amenaza importante para la salud humana. La resistencia a los antimicrobianos está aumentando y todavía faltan vacunas para varios patógenos importantes. Para identificar nuevas vías para las estrategias de control, necesitamos saber más sobre cómo los patógenos responden al sistema inmunitario del huésped y a los antibióticos in vivo en los tejidos infectados.Las bacterias supervivientes pueden causar recaídas si los antimicrobianos no logran erradicar una infección. Mediante el uso de tomografía seriada, demostramos que la fiebre tifoidea que causa salmonela puede persistir durante el tratamiento en una parte específica del bazo. La inflamación es débil en esta región, lo que interrumpe la sinergia crítica entre los antibióticos y la inflamación para una eliminación efectiva.Las bacterias son objetos del tamaño de un micrómetro. Es difícil localizar objetos tan pequeños en su contexto tisular. La tomografía seriada de dos fotones puede detectar una sola bacteria en órganos de un centímetro y determinar su tasa de replicación.También podemos detectar células inmunitarias, como los neutrófilos, y determinar su relación espacial con las bacterias. Estudiamos las actividades de los antibióticos bacteriostáticos. Estos antibióticos pueden curar infecciones, aunque solo pueden inhibir el crecimiento bacteriano sin matar realmente al patógeno.También determinamos la propagación de mutantes bacterianos que carecen de ciertos factores de virulencia y el impacto de los defectos inmunes en la infección y el tratamiento.

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Research

Investigación

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Immunology and Infection

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