Name: Hemostasia de heridas punzantes y preparación de muestras para el análisis de microscopía electrónica de área amplia montada (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 41 s
Description: Aprende a realizar heridas punzantes y preparar muestras para microscopía electrónica de área amplia montada en ratones. Este método permite analizar la formación de trombos y la función plaquetaria con alta resolución espacial.

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<meta charset="utf8"></head><body>Hemostasia de herida punzante y microscopía electrónica montada

<ol><li>Rhee, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Venous+puncture+and+wound+hemostasis+results+in+a+vaulted+thrombus+structured+by+locally+nucleated+platelet+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Comm+Biol%22%5BJournal%5D)">Venous puncture and wound hemostasis results in a vaulted thrombus structured by locally nucleated platelet aggregates.</a> Comm Biol. 4 (1), 1090(2021).</li>
<li>Pokrovskaya, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tethered+platelet+capture+provides+a+mechanism+for+restricting+circulating+platelet+activation+in+the+wound+site%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Pract+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Tethered platelet capture provides a mechanism for restricting circulating platelet activation in the wound site.</a> Res Pract Thromb Haemost. 7 (2), 100058(2023).</li>
<li>Yadav, S., Storrie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+basis+of+platelet+secretion%3A+emerging+structure%2Ffunction+relationships%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">The cellular basis of platelet secretion: emerging structure/function relationships.</a> Platelets. 28 (2), 108-118 (2017).</li>
<li>Joshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferric+chloride-induced+arterial+thrombosis+and+sample+collection+for+3D+electron+microscopy+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Ferric chloride-induced arterial thrombosis and sample collection for 3D electron microscopy analysis.</a> J Vis Exp. (193), e64985(2023).</li>
<li>Guerrero, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+von+Willebrand+factor%2Fglycoprotein+Ib-IX+axis+with+a+platelet-type+von+Willebrand+disease+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Visualizing the von Willebrand factor/glycoprotein Ib-IX axis with a platelet-type von Willebrand disease mutation.</a> Blood. 114 (27), 5541-5546 (2009).</li>
<li>Kato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+glycoprotein+VI+to+stable+platelet+adhesion+and+thrombus+formation+illustrated+by+targeted+gene+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The contribution of glycoprotein VI to stable platelet adhesion and thrombus formation illustrated by targeted gene deletion.</a> Blood. 102 (5), 1701-1707 (2003).</li>
<li>Tomaiuolo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrelationships+between+structure+and+function+during+the+hemostatic+response+to+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+NatlAcad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Interrelationships between structure and function during the hemostatic response to injury.</a> Proc NatlAcad Sci U S A. 116 (6), 2243-2252 (2019).</li>
<li>Cocchiaro, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+lipid+droplets+are+translocated+into+the+lumen+of+the+Chlamydia+trachomatis+parasitophorous+vacuole%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic lipid droplets are translocated into the lumen of the Chlamydia trachomatis parasitophorous vacuole.</a> Proc Natl Acad Sci. 105 (27), 9379-9384 (2008).</li>
<li>Pokrovskaya, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydia+trachomatis+hijacks+intra+-+Golgi+COG+complex+-+dependent+vesicle+trafficking+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Chlamydia trachomatis hijacks intra - Golgi COG complex - dependent vesicle trafficking pathway.</a> Cell Microbiol. 14 (5), 656-668 (2012).</li>
<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Str+Biol%22%5BJournal%5D)">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> J Str Biol. 152 (1), 36-51 (2005).</li>
<li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22J+Str+Biol%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> J Str Biol. 116 (1), 71-76 (1996).</li>
<li>Chan, N. C., Eikelboom, J. W., Weitz, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+treatments+for+arterial+and+venous+thrombosis%3A+role+of+the+direct+oral+anticoagulants%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Evolving treatments for arterial and venous thrombosis: role of the direct oral anticoagulants.</a> Circ Res. 118 (9), 1409-1424 (2016).</li>
<li>Kiernan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde%2C+formalin%2C+paraformaldehyde%2C+and+glutaraldehyde%3A+what+they+are+and+what+they+do%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Today%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde, formalin, paraformaldehyde, and glutaraldehyde: what they are and what they do.</a> Microscopy Today. 8 (1), 8-13 (2000).</li>
<li>Storrie, B., Attardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+mitochondrial+genome+in+HeLa+cells%3A+XV.+Effect+of+inhibition+of+mitochondrial+protein+synthesis+on+mitochondrial+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+CellBiol%22%5BJournal%5D)">Expression of the mitochondrial genome in HeLa cells: XV. Effect of inhibition of mitochondrial protein synthesis on mitochondrial formation.</a> J CellBiol. 56, 819-831 (1973).</li>
<li>Liu, S., Pokrovskaya, I. D., Storrie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+-+pressure+freezing+followed+by+freeze+substitution%3A+an+optimal+electron+microscope+technique+to+study+Golgi+apparatus+organization+and+membrane+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">High - pressure freezing followed by freeze substitution: an optimal electron microscope technique to study Golgi apparatus organization and membrane trafficking.</a> Meth Mol Biol. 2557, 211-223 (2023).</li>
<li>Klarhofer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+blood+flow+velocity+measurements+in+the+human+finger%5BTitle%5D)+AND+%22Mag+Res+Med%22%5BJournal%5D)">High-resolution blood flow velocity measurements in the human finger.</a> Mag Res Med. 45 (4), 716-719 (2001).</li>
<li>Chaudry, R., Miao, J. H., Rehman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology%2C+cardiovascular%5BTitle%5D)+AND+%22StatPearls%22%5BJournal%5D)">Physiology, cardiovascular.</a> StatPearls. , Treasure Island, FL, USA. (2022).</li>
<li>Pokrovskaya, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNARE+-+dependent+membrane+fusion+initiates+a-granule+matrix+decondensation+in+mouse+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Adv%22%5BJournal%5D)">SNARE - dependent membrane fusion initiates a-granule matrix decondensation in mouse platelets.</a> Blood Adv. 2 (21), 2947-2958 (2018).</li>
<li>Pokrovskaya, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+ultrastructural+analysis+of+a-granule%2C+dense+granule%2C+mitochondria%2C+and+canalicular+system+arrangement+in+resting+human+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Pract+Thrombosis+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">3D ultrastructural analysis of a-granule, dense granule, mitochondria, and canalicular system arrangement in resting human platelets.</a> Res Pract Thrombosis Haemostasis. 4 (1), 72-85 (2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Solución salina normal al 0,9%</td><td>Medline</td><td>BHL2F7123HH</td><td></td></tr><tr><td>27G x 3/4 EXELint set de venas para cuero cabelludo</td><td>Medline</td><td>NDA26709</td><td></td></tr><tr><td>30G x 1/2 EXELint agujas hipodérmicas</td><td>Medline</td><td>NDA264372</td><td></td></tr><tr><td>33G x 1/2 EXELint agujas hipodérmicas especiales</td><td>Medline</td><td>NDA26393</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubos Cónicos</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-443-20</td><td></td></tr><tr><td>Almohadillas de preparación con alcohol (70% de alcohol isopropílico)</td><td>Medline</td><td>MDS090670Z</td><td></td></tr><tr><td>papel de aluminio</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-100</td><td></td></tr><tr><td>Placa calefactora para animales</td><td>Physitemp Instruments</td><td>HP-1M</td><td></td></tr><tr><td>Araldite GY 502</td><td>Microscopía electrónica Sciences</td><td>10900</td><td></td></tr><tr><td>Axiocam 305 Color R2 Cámara de microscopía Carl</td><td>Zeiss</td><td>426560-9031-000</td><td></td></tr><tr><td>BD Jeringas Luer-Lok, 20 mL</td><td>Medline</td><td>B-D303310Z</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de Calcio</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Cultivo Celular 35mm x 10mm</td><td>Corning Inc.</td><td></td><td></td>430165</tr><tr><td>Aplicadores con punta de algodón</td><td>Medline</td><td>MDS202055H</td><td></td></tr><tr><td>DMP-30</td><td>Activador Microscopía Electrónica Sciences</td><td>13600</td><td></td></tr><tr><td>Anhídrido Dodecenil Sucínico/ DDSA</td><td>Microscopía Electrónica Sciences</td><td>13700</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de Apósito, 5", curvado, dentado, de punta estrecha</td> Pinzas de Apósito <td>Integra Miltex</td><td>6-100</td><td></td></tr><tr><td>, 5", estándar, dentado</td><td>Integra Miltex</td><td>6-6</td><td></td></tr><tr><td>EMBED 812 Resina</td><td>Microscopía Electrónica Ciencias</td><td>14900</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol etílico, anhidro 200 grados</td><td>Ciencias de Microscopía Electrónica</td><td>15055</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Rack de tubo de 4 vías</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-448-17</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Temporizador digital</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-649-17</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Bomba de infusión de jeringa única</td><td>Fisher Scientific</td><td>7801001</td><td></td></tr><tr><td>Esponjas de gasa de 2" x 2" - 4 capas</td><td>Medline</td><td>NON26224H</td><td></td></tr><tr><td>glutaraldehído (solución al 10%)</td><td>Microscopía electrónica Sciences</td><td>16120</td><td></td></tr><tr><td>Anestesia inhalante líquida de isoflurano, 100 mL</td><td>Medline</td><td>66794-017-10</td><td></td></tr><tr><td>Microfino estilo joyero Pinzas, Estilo 5F</td><td>Integra Miltex</td><td>17-305</td><td>Necesita 2 pares.</td></tr><tr><td>Tubo de bomba L/S, silicona, L/S 15; 25 pies</td><td>VWR</td><td>MFLX96410-15</td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-aspártico</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP374-100</td><td></td></tr><tr><td>Nitrato de plomo</td><td>Fisher Scientific</td><td>L-62</td><td></td></tr><tr><td>Verde de malaquita 4</td><td>Microscopía electrónica Sciences</td><td>18100</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S Cabezal de bomba Easy-Load II</td><td>VWR</td><td>MFLX77200-62</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S Variador de velocidad digital</td><td>VWR</td><td>MFLX07528-10</td><td></td></tr><tr><td>MSC Xcelite 5" Cortadores de alambre</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-191-9855</td><td></td></tr><tr><td>Tetróxido de osmio 4% solución acuosa</td><td>Microscopía electrónica Sciences</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído (solución al 16%)</td><td>Microscopía electrónica Ciencias</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Controlador</td> <td>de temperatura PhysitempPhysitemp Instruments</td><td>TCAT-2LV</td><td></td></tr><tr><td>Ferrocianuro de potasio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8131</td><td></td></tr><tr><td>Óxido de propileno, reactivo ACS</td><td>Ciencias de la microscopía electrónica</td><td>20401</td><td></td></tr><tr><td>Vasos de precipitados de vidrio Pyrex</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-555-25B</td><td></td></tr><tr><td>Sonda de temperatura rectal para ratones</td><td>Physitemp Instruments</td><td>RET-3</td><td></td></tr><tr><td>Cinta invisible Scotch Magic, 3/4" x 1000"</td><td>3M Compañía</td><td>305289</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de cacodilato de sodio 0.2M, pH 7.4</td><td>Microscopía Electrónica Ciencias</td><td>11623</td><td></td></tr><tr><td>SomnoFlo Vaporizador Electrónico de Bajo Flujo</td><td>Kent Scientific</td><td>SF-01</td><td></td></tr><tr><td>SomnoFlo Kit de inicio para ratones</td><td>Kent Scientific</td><td>SF-MSEKIT</td><td></td></tr><tr><td>Pines de Minutien de acero inoxidable</td> Fine <td>Science Herramientas</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico steREO Discovery.V12</td><td>Carl Zeiss Microscopía</td><td>495015-9880-010</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Elastómero de silicona</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYLG184</td><td>estera de silicona</td></tr><tr><td>Ácido tánico</td><td>Microscopía electrónica Sciences</td><td>21700</td><td></td></tr><tr><td>Tiocarbohidrazida (TCH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>88535</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de uranilo</td><td>Microscopía Electrónica Ciencias</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Spring Micro Tijeras</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Von Graefe Pinzas de apósito para ojos, 2.75", curvado, dentado</td><td>Integra Miltex</td><td>18-818</td><td>Necesita 2 pares.</td></tr><tr><td>Tijeras Wagner Herramientas de</td><td>Ciencia Fina</td><td>14068-12</td><td></td></tr><tr><td>Wahl MiniFigura Recortadora de Animales</td><td>Braintree Scientific</td><td>CLP-9868</td><td></td></tr><tr><td>Zen Lite Software</td><td>Carl Zeiss Microscopía</td><td>410135-1001-000</td><td></td></tr></tbody></table>

hemostasia de heridas punzantes y preparación de muestras para el análisis de microscopía electrónica de área amplia montada

Puncture Wound Hemostasis and Preparation of Samples for Montaged Wide-Area Electron Microscopy Analysis

Cuantificación de los efectos del fármaco sobre el tiempo de sangrado de la herida punzante Los tiempos de sangrado de las heridas punzantes proporcionan un modelo fisiológico del riesgo de un fármaco que puede llevarse a cabo fácilmente en ratones. Los resultados que se derivan de un experimento de herida punzante son predictivos. Aquí, mostramos una curva de sangrado dosis-respuesta de dabigatán. El dabigatrán, un inhibidor de la trombina, se utiliza como anticoagulante oral de acción directa, el llamado DOAC12. Se utilizó el modelo de herida punzante en la vena yugular para evaluar el riesgo inherente a diferentes dosis de dabigatrán a través de una posible hemorragia prolongada a través de la formación tardía de trombos en ratones. Se administró una dosis variable de 15, 50 o 150 μg/kg de dabigatrán por vía intravenosa (i.v.) 20 min antes de la punción de la vena yugular. Mostramos las medias del tiempo de sangrado a diversas concentraciones de dabigatrán (Figura 4). A nivel de dosis, se observa una prolongación significativa del tiempo de sangrado, p &lt;0,051. Esto indica un factor de riesgo significativo en el uso del medicamento en humanos. Experimentalmente, el fármaco a estas dosis tiene un efecto significativo sobre la ultraestructura del trombo en formación.
Evaluación del estado de activación plaquetaria en un trombo de herida punzante en formación El enfoque WA-TEM proporciona una visión general de un área de herida en un solo plano cuando se observa con un aumento más bajo y mucho detalle con un aumento más alto (Figura 5). Los detalles obtenidos se pueden situar directamente en el contexto de la visión general. Hemos utilizado este enfoque para evaluar el reclutamiento de plaquetas de forma discoide para un trombo de herida punzante en formación. Las plaquetas circulantes son discoides, de ahí su nombre, y contienen un conjunto completo de gránulos secretores. Una pregunta clave ha sido cómo las plaquetas circulantes pueden ser reclutadas para el trombo en crecimiento sin perturbar las propiedades de flujo libre de las plaquetas restantes. Nuestro trabajo apunta a una hipótesis de Tether and Activate en la que las plaquetas circulantes son reclutadas por el trombo, una por una, a través de un proceso de anclaje como plaquetas discoidales que contienen un conjunto completo de orgánulos2. La evidencia de esto proviene de la WA-TEM de trombos de la vena yugular 1 min después de la punción. Después de la sección para producir cortes completos del trombo desde el centro de la herida aún sangrante, tomamos imágenes de 500 a 800 fotogramas, 4.000 por 4.000 píxeles, 3.185 nm de tamaño de píxel en una cuadrícula ráster XY rectangular a lo largo de toda la dimensión del trombo en sección transversal utilizando una platina automatizada y un microscopio electrónico de transmisión utilizando el software SerialEM10. A continuación, los marcos se unieron con el software eTomo, que forma parte del paquete de programas IMOD11. Esto da como resultado una sola imagen de tamaño variable, por ejemplo, 120.000 píxeles por 90.000 píxeles que puede ser a pantalla completa con un zoom bajo, 0,02, o en detalle con un zoom más alto, de 0,25 a 1,0 utilizando el software 3DMOD, de nuevo como parte del conjunto de programas IMOD (Figura 5). En neto, el análisis basado en software encontró que las plaquetas discoides asociadas al trombo unidas periféricamente dentro del orificio de punción estaban espaciadas como cuentas en una cuerda. A una corta distancia dentro del trombo, la forma discoide era menos distintiva y las plaquetas estaban más estrechamente asociadas entre sí. Más adentro del trombo, las plaquetas estaban redondeadas, apretadas y parcialmente desgranuladas. Una secuencia de morfología sugirió la unión inicial de las plaquetas al trombo a través de una molécula de atadura larga, probablemente el factor de von Willebrand, y que cualquier paso adicional de activación plaquetaria se restringía al interior del trombo en formación. Por lo tanto, el reclutamiento de plaquetas al trombo podría ocurrir sin alterar la circulación de la sangre dentro de la vena yugular.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66479/66479fig01.jpg"> Figura 1: Montaje quirúrgico para realizar un experimento de trombo de herida por punción de vena yugular/arteria femoral. El equipo quirúrgico (A) y los instrumentos (B) están cuidadosamente dispuestos para la eficiencia del movimiento, ya que el tiempo es crítico durante el experimento. (C) Después de la fijación por perfusión, la porción del vaso que contiene el trombo de la herida punzante se fija a una estera de silicona en una placa de cultivo de 35 mm mientras se observa bajo el microscopio óptico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66479/66479fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66479/66479fig02.jpg"> Figura 2: Pasando de un vaso sanguíneo a muestras incrustadas en plástico que se seccionarán para WA-TEM o SBF-SEM. (A) Se muestra una arteria femoral con una herida punzante y formación de trombos extravasculares acumulados (círculo y flecha). (B) Un trombo (círculo y flecha) está incrustado en plástico para el corte de WA-TEM con un micrótomo para la posterior obtención de imágenes en 2D. (C) Un trombo (círculo y flecha) está incrustado en plástico, recortado para dar un palo corto, de menos de 1 mm, para sujetarlo a un alfiler dentro de una cámara de imágenes SBF-SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66479/66479fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66479/66479fig03.jpg"> Figura 3: Formación de la herida punzante al trombo: Esquema del flujo preparatorio desde una herida punzante (A) hasta un corte de imagen de un trombo (B) de la vena yugular postpunción de 1 min. La pared del vaso está etiquetada en azul en el corte de la imagen, los pequeños puntos negros cerca de la pared del vaso son glóbulos rojos y los agregados de plaquetas del trombo aparecen como áreas de color gris oscuro. Esta cifra ha sido modificada de1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66479/66479fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66479/66479fig04.jpg"> Figura 4: Un ejemplo de datos, en forma gráfica, generados en un experimento de herida punzante en la vena yugular. Se muestra una curva de sangrado dosis-respuesta de dabigatán. Esta cifra ha sido modificada de1. Las medias del tiempo de sangrado a varias concentraciones de dabigatrán se muestran junto con barras de error que indican más o menos la desviación estándar. El análisis estadístico mediante la prueba t de Student indicó un valor p de &lt;0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66479/66479fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66479/66479fig05.jpg"> Figura 5: Imágenes WA-TEM de un corte unido para formar un montaje. (A) Se recopilan fotogramas individuales de alta resolución y luego se unen con el fin de colocar las características en un contexto más amplio. (B) Al hacer zoom, se pueden resaltar detalles importantes en contexto (poli: leucocitos polimorfonucleares, endotelio: endotelio y col: fibras de colágeno). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66479/66479fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Hemostasia de heridas punzantes y preparación de muestras para el análisis de microscopía electrónica de área amplia montada

Hemostasis, the process of normal physiological control of vascular damage, is fundamental to human life. We all suffer minor cuts and puncture wounds ...

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Investigación

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Se describe un protocolo para la perfusión transcardiaca de los ratones, la eliminación y la sección del cerebro, así como la tinción con inmunoperoxidasa, la incrustación de resina, y ultrafinas de seccionamiento de las secciones del cerebro. Al término de estos procedimientos, el material immunostained está listo para el examen con microscopio electrónico de transmisión.

Preparación del tejido de cerebro de ratón para inmunomicroscopía

Cryo microscopios electrónicos, ya sea de barrido (SEM) o transmisión (TEM), son ampliamente utilizados para la caracterización de las muestras biológicas o de otros materiales con un alto contenido de agua 1. Un SEM / haz de iones focalizados (FIB) se utiliza para identificar las características de interés en muestras y extraer una lámina delgada, transparente-de electrones para la transferencia a un crio-TEM.

Cryo-Microscopía Electrónica de Preparación de Muestras por medio de un haz de iones focalizados

El objetivo de este protocolo es construir un equivalente de piel tridimensional de espesor completo, que se asemeje a la piel natural. Con un dispositivo de herida automatizado específicamente construido, se pueden generar heridas precisas y reproducibles bajo el mantenimiento de la esterilidad.

Generación de una tridimensional grosor de la piel completa y automatizada Equivalente Heridas

Aquí se muestra un método para visualizar la ultraestructura de la matriz extracelular en tejidos cardíacos descelularizados.

Microscopía Electrónica de Barrido de tejido macerado para visualizar la matriz extracelular

Se presenta un instrumento y métodos para la preparación de volúmenes nanoliter-tamaño de la muestra para microscopía electrónica de transmisión. No se requieren, evitando las consecuencias perjudiciales que esto puede tener para las proteínas, significativamente reducir la pérdida de muestra y que permite el análisis de lisado de proteómica visual única célula pasos papel-blotting.

Preparación de muestras miniatura para microscopia electrónica de transmisión

Aquí presentamos un protocolo para la combinación de dos técnicas de procesamiento de muestra, alta presión de congelación y procesamiento de las muestras asistida por microondas, seguido por la resina mínima inclusión para la adquisición de datos con un ion enfocado viga microscopio electrónico (FIB-SEM). Así lo demuestran con una muestra de nervio tibial de ratón y elegans de Caenorhabditis.

Preparación de muestras biológicas por congelación de alta presión, realce del contraste asistida por microondas y mínima inclusión de proyección de imagen de volumen

Aquí, proporcionamos una descripción detallada del procedimiento para inducir biopsias de pellizcar guiadas por colonoscópicas en ratones y el cierre de heridas de vía en tiempo real. Además, se proporcionan métodos para la preparación de tejidos para análisis histológicos, inmunohistoquímicos y moleculares del lecho de la herida.

Realización de biopsias de pellizcar guiadas por colonoscópicas en ratones y evaluación de cambios de tejido posteriores

Este protocolo describe cómo generar heridas de escisión bilaterales de espesor completo en ratones y cómo monitorear, cosechar y preparar las heridas para el análisis morfométrico. Se incluye una descripción detallada de cómo utilizar secciones histológicas seriales para definir, cuantificar y detectar defectos morfométricos con precisión.

Modelo de cicatrización de heridas excisionales de Murine y análisis de heridas morfométricas histológicas

Aquí, presentamos un protocolo para analizar la ultraestructura de los megacariocitos in situ utilizando microscopía electrónica de transmisión (TEM). Las médulas óseas murinas se recogen, se fijan, se incrustan en resina epoxi y se cortan en secciones ultrafinas. Después de la tinción por contraste, la médula ósea se observa bajo un microscopio TEM a 120 kV.

In situ Exploración de la megacariopoyesis murina mediante microscopía electrónica de transmisión

El presente protocolo describe cómo utilizar una lesión mediada por FeCl3 para inducir trombosis arterial, y cómo recoger y preparar muestras de lesión arterial en diversas etapas de trombosis para el análisis de microscopía electrónica.

Trombosis arterial inducida por cloruro férrico y recolección de muestras para análisis de microscopía electrónica 3D

Aprende a realizar heridas punzantes y preparar muestras para microscopía electrónica de área amplia montada en ratones. Este método permite analizar la formación de trombos y la función plaquetaria con alta resolución espacial.

Hemostasia de heridas punzantes y preparación de muestras para el análisis de microscopía electrónica de área amplia montada

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