Análisis de la unión de extremos no homólogos y la eficiencia de recombinación homóloga en células HEK-293T utilizando sistemas reporteros basados en GFP

Las roturas de doble cadena de ADN representan las lesiones de ADN más peligrosas. En respuesta, las células emplean dos mecanismos principales para la reparación de roturas de doble cadena de ADN, NHEJ y HR. Cuantificar la eficiencia de la NHEJ y la HR por separado es crucial para explorar los mecanismos y factores relevantes asociados con ellos. El ensayo NHEJ y el ensayo HR son métodos establecidos que se utilizan para medir la eficiencia de NHEJ y HR. Estos métodos se basan en plásmidos meticulosamente diseñados que contienen un gen de proteína fluorescente verde interrumpido con sitios de reconocimiento para la endonucleasa I-SceI para la inducción de DSB.

El ensayo NHEJ y el ensayo HR se pueden realizar utilizando un enfoque cromosómicamente integrado o extracromosómico. El enfoque cromosómicamente integrado permite el análisis de la reparación de DSB dentro de una competencia cromosómica. Sin embargo, el enfoque cromosómicamente integrado requiere una célula prolongada y no es adecuado para estudios comparativos que involucren múltiples líneas celulares.

En este protocolo, describimos los ensayos extracromosómicos NHEJ y HR que involucran la transfección transitoria de los plásmidos GFP e I-SceI interrumpidos en células HEK-293T y el posterior análisis de citometría de flujo. Estos ensayos de reporteros no integrados se han empleado para evaluar la eficiencia de NHEJ y la eficiencia de RRHH por varios laboratorios, incluido el nuestro. A diferencia del enfoque cromosómicamente integrado, este enfoque extracromosómico permite un análisis rápido de la eficiencia de NHEJ o HR mediante la utilización de líneas celulares estables y establecidas.