Name: Modelo de trasplante heterotópico auxiliar de hígado entero en rata que utiliza una hepaticoureterostomía para estudios de rechazo de aloinjertos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-08T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Aprenda el trasplante hepático heterotópico auxiliar en rata para estudiar el rechazo de aloinjertos hepáticos. Este modelo reduce la complejidad quirúrgica y el estrés animal en investigación de trasplantes.

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<meta charset="utf8"></head><body>Trasplante de hígado en ratas y análisis de la permeabilidad del aloinjerto

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</ol>

<table><tbody><tr><td>3-0 Sutura de seda</td><td>Ethicon</td><td>C013D</td><td></td></tr><tr><td>5-0 Corbatas de seda</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>18020-50</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Corbatas de seda</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>18020-60</td><td></td></tr><tr><td>7-0 Corbatas de seda</td><td>Teleflex</td><td>103-s</td><td></td></tr><tr><td>9-0 Sutura de poliamida</td><td>AROSquirúrgico</td><td>T05A09N10-13</td><td>Negro</td></tr><tr><td>Cauterización bipolar</td><td>Codman y Shurtleff Inc.</td><td>P.H. 234</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina HCL</td><td>Hospira</td><td>409201232</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps Adson-Brown</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>11627-12</td><td>12,5 cm</td></tr><tr><td>Pinzas Dumont en ángulo</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>11253-25</td><td>Médico #5/45 11 cm</td></tr><tr><td>Fórceps, atado de suturas&nbsp;</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>18025-10</td><td>10 cm</td></tr><tr><td>Inyección de heparina sódica, USB</td><td>Fresenius Kabi</td><td>504015</td><td>10,000 unidades USP por 10 ml</td></tr><tr><td>Cánula de hidrodisección</td><td>Ambler Quirúrgico</td><td>1021E</td><td>27 gramos</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Productos veterinarios de Dechra</td><td>17033-091-25</td><td></td></tr><tr><td>Catéter intravenoso</td><td>Kendall</td><td>2619PUR</td><td>26 G x 3/4"</td></tr><tr><td>Sistema de retracción magnética</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>18200-50</td><td></td></tr><tr><td>Micro abrazaderas</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>18055-05</td><td>6 milímetros</td></tr><tr><td>Micro abrazaderas</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>18055-06</td><td>4 milímetros</td></tr><tr><td>Aplicador de micropinza</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>18057-14</td><td>14 cm</td></tr><tr><td>Micro portaagujas</td><td>S& T</td><td>C-14</td><td>14 cm</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Zeiss</td><td>Universal S3</td><td>Cabezal doble</td></tr><tr><td>Ungüento oftálmico</td><td>Puralube</td><td>14590500</td><td></td></tr><tr><td>Tubería de poliimidi</td><td>Cole Parmer</td><td>95820-04</td><td>DE 0.0215", ID 0.0195", pared 0.0010"</td></tr><tr><td>Salino</td><td>Baxter</td><td>281324</td><td>0,9% de cloruro de sodio</td></tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas de resorte</td><td>S& T</td><td>COSUDE-15</td><td>Blunt 14 cm</td></tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas de resorte</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>15021-15</td><td>Vanas 14 cm</td></tr></tbody></table>

modelo de trasplante heterotópico auxiliar de hígado entero en rata que utiliza una hepaticoureterostomía para estudios de rechazo de aloinjertos

Heterotopic Auxiliary Whole Liver Rat Transplant Model Utilizing a Hepaticoureterostomy for Allograft Rejection Studies

En la actualidad, se han utilizado 29 pares de ratas para establecer el protocolo HALT-PVA, 17 trasplantes singénicos y 12 trasplantes alogénicos. Los hígados trasplantados singénicos sobrevivieron a su criterio de valoración experimental designado de 8 o 30 días con una tasa de éxito del 70%, mientras que los hígados trasplantados alogénicos sobrevivieron a sus criterios de valoración designados de 3 u 8 días con una tasa de éxito del 50%. Los fracasos incluyen ratas que murieron debido a complicaciones quirúrgicas e hígados auxiliares que fallaron incluso cuando el receptor sobrevivió.
La duración media de la operación fue de 130 min, con un tiempo de isquemia fría de unos 35 min, y un tiempo de isquemia caliente de menos de 25 min. Siempre que no hubiera complicaciones intraoperatorias, los receptores se despertaron y se activaron en 10-20 minutos, comenzaron a beber y deambular en 1 h y 24 h después, se comportaron como ratas sanas normales.
Los injertos hepáticos singénicos mostraron una excelente coloración y permeabilidad del conducto biliar a los 30 días después del trasplante (Figura 3), mientras que la histología de hematoxilina y eosina (H&amp;E) mostró una estructura normal de los hepatocitos sin alteraciones parenquimatosas significativas en los puntos temporales de 8 y 30 días (Figura 4A, B). Después de solo 3 días, la histología de los trasplantes alogénicos mostró una inflamación portal significativa (Figura 4C), mientras que los injertos alogénicos de 8 días mostraron rechazo celular agudo con infiltración linfocítica extensa (Figura 4D).
Las muestras representativas de LTx alogénicas y singénicas fueron evaluadas por un patólogo hepático certificado, y el rechazo se puntuó mediante el índice de actividad de rechazo (RAI) del esquema de Banff12. La evaluación anatomopatológica determinó la ausencia de rechazo, con un RAI de Banff de 0, tanto en los trasplantes singénicos de 8 días como en los de 30 días, mientras que los aloinjertos de 8 días fueron rechazados severamente con una puntuación de RAI de Banff de 9 (Tabla 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66516/66516fig01.jpg"> 
Figura 1: Diagrama esquemático del procedimiento HALT-PVA de rata. La VP se arterializa con la arteria renal izquierda mediante un stent, la IHVC se anastomosa de extremo a extremo a la vena renal izquierda y el conducto biliar se conecta al uréter mediante un stent. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66516/66516fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66516/66516fig02.jpg"> 
Figura 2: Procedimiento quirúrgico. (A) Hidrodisección de PV. Disocie la PV del tejido conectivo circundante con una aguja de hidrodisección de 27 G. (B) Inserción de stent arterial. El stent arterial se inserta en una pequeña abertura en forma de embudo cortada en la horquilla de la bifurcación de la arteria renal. (C) Ensanchamiento de la vena renal. Con el fin de coincidir con el mayor ancho del IHVC del donante para la anastomosis, se hace un pequeño corte en la boca de pescado en la cara de la vena renal del receptor después de que se coloquen dos suturas de estancia. (D) Injerto de hígado perfundido inmediatamente después de la anastomosis. La colocación de la arteria renal y la conexión VP debajo de la vena renal y la IHVC es crucial para prevenir la trombosis del injerto. (E) Rata HALT-PVA in situ. El hígado auxiliar se coloca contra la pared izquierda del abdomen antes de devolver los intestinos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66516/66516fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66516/66516fig03.jpg"> 
Figura 3: HALT-PVA singénico a los 30 días del trasplante. (A) Después de 30 días, el hígado auxiliar tiene un color y textura similares al hígado nativo, mientras que (B) el conducto biliar y el stent PV permanecen permeables y sin restricciones. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66516/66516fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66516/66516fig04.jpg"> 
Figura 4: Histología de los injertos hepáticos auxiliares. Tinción H&amp;E de (A) injertos singénicos post-trasplante a los 8 días y (B) a los 30 días que exhiben una estructura normal de los hepatocitos junto con (C) injertos alogénicos a los 3 días y (D) a los 8 días que muestran inflamación portal e infiltración linfocítica. Barra de escala: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66516/66516fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tx's alogénicos</td>
			<td>Inflamación portal</td>
			<td>Lesión del conducto biliar</td>
			<td>Endoinflamación venosa</td>
			<td>Banff RAI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 días (LT-34)</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 días (LT-38)</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 días (LT-20)</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 días (LT-40)</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tx's singénicos</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 días (LT-13)</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 días (LT-19)</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 días (LT-28)</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 días (LT-32)</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 1: Esquema de Banff. Índice de actividad de rechazo (RAI) de LTx's alogénicos y singénicos de rata.

Modelo de trasplante heterotópico auxiliar de hígado entero en rata que utiliza una hepaticoureterostomía para estudios de rechazo de aloinjertos

Small animal transplant models are indispensable for organ tolerance studies investigating feasible therapeutic interventions in preclinical studies. Rat ...

El objetivo principal de nuestra investigación es investigar los mecanismos detrás de la tolerancia inmunológica después del trasplante hepático. Luego investigamos métodos para disminuir el rechazo hepático y mejorar la supervivencia de los receptores de trasplante hepático.El paso más difícil en este procedimiento de trasplante heterotópico es la anastomosis de extremo a extremo de la vena cava hepática inferior a la vena renal. Por lo tanto, cualquier persona que se sienta cómoda realizando una anastomosis de extremo a extremo de una vena de 3 milímetros por cualquier método tiene toda la habilidad técnica necesaria para realizar este procedimiento.Los modelos ortotópicos de trasplante de hígado de rata son operaciones técnicamente desafiantes que se complican por largos tiempos de isquemia anhepática e inferior del cuerpo, lo que dificulta la recuperación del animal receptor. El modelo de trasplante hepático heterotópico presentado aquí elimina estas complicaciones. Y no requiere habilidades microquirúrgicas avanzadas. La recuperación rápida del receptor, en ausencia de tiempo de isquemia anhepática o de la parte inferior del cuerpo, es una ventaja significativa del trasplante hepático heterotópico sobre el ortotópico en rata. Además, el estudio del rechazo después del trasplante hepático ortotópico a menudo se basa en la morbilidad o la muerte como criterio de valoración experimental, lo que no es el caso con este modelo heterotópico.La perfusión hepática ex vivo normoterómica es una nueva y emocionante estrategia para almacenar hígados antes del trasplante clínico. Sin embargo, faltan modelos animales pequeños debido a la alta demanda técnica de preparar un hígado para trasplante después de la perfusión normotérmica. Por lo tanto, nuestro objetivo es utilizar nuestro modelo de trasplante hepático heterotópico para trasplantar hígados con éxito después de la perfusión normotérmica de manera confiable y reproducible.[Narrador] Después de afeitar y desinfectar el abdomen, coloque la rata donante anestesiada en posición supina sobre una almohadilla quirúrgica caliente. Tras la incisión longitudinal, use hisopos de algodón húmedos para retraer cuidadosamente el hígado y diseccionar los ligamentos falciformes, triangulares, hepatogástricos y hepatoduodenales. Cauterizar los vasos paraesofágicos con fórceps bipolares y dividir aún más entre el lóbulo caudado lateral izquierdo y el lóbulo caudado anterior. Con fórceps angulares o portaagujas, diseccione detrás de la vena cava suprahepática inferior al diafragma. Luego pase una sutura de seda 5-0 debajo de la vena cava suprahepática y haga un nudo doble sin apretar para su uso posterior. Aísle la vena cava infrahepática desde el tejido retroperitoneal hasta la vena renal derecha. Luego ligar la vena suprarrenal derecha con una sutura de seda 6-0 lo más cerca posible de la vena cava infrahepática. Con una aguja de hidrodisección de calibre 27, disocie la vena porta del tejido conectivo circundante. Separe la vena porta de las venas pilóricas y esplénicas ligándolas y dividiéndolas con una sutura de seda 7-0. Después del aislamiento de la arteria hepática común, ligado con una sutura de seda 6-0 y dividido la arteria cerca de donde pasa por debajo de la vena porta. Ligue el conducto biliar con una sutura de seda 5-0 en la ramificación de la arteria gastroduodenal, asegurando la preservación del tejido graso alrededor del conducto biliar. Con unas tijeras de resorte, haga una pequeña incisión en la pared del conducto biliar proximal a la ligadura. Inserte un stent de tubo de poliamida en la luz del conducto biliar y asegúrelo con una sutura de seda 6-0, dejando un extremo de la sutura largo para un uso posterior. Corte entre las ligaduras 5-0 y 6-0 para dividir el conducto biliar. Marque la parte superior de la vena cava infrahepática y la vena porta con un tinte quirúrgico para ayudar con la alineación de los vasos durante la anastomosis. Luego asegure la vena porta con una pinza de microvasos lo más distal posible al hígado. Inserte una jeringa de 20 mililitros con una aguja de calibre 26 en la vena porta proximal a la pinza y perfunda el hígado con 10 a 15 mililitros de solución salina heparinizada helada, dividiendo simultáneamente la vena cava infrahepática con unas tijeras de resorte lo más cerca posible de la vena renal derecha. Para extirpar el hígado, diseccionar la vena porta proximal a la micropinza. A continuación, apriete la sutura 5-0 colocada previamente alrededor de la vena cava suprahepática y diseccione el diafragma para seccionar la vena cava intratorácica. Continúe diseccionando los ligamentos restantes en la parte posterior del hígado y divida la vena suprarrenal previamente ligada. Coloque el hígado extirpado en solución salina fría sobre hielo. Después de afeitar y desinfectar el abdomen, coloque la rata receptora anestesiada en posición supina sobre una almohadilla quirúrgica caliente. Tras la incisión longitudinal, use hisopos de algodón húmedos para retraer los intestinos hacia el lado derecho del abdomen y cúbralos con una gasa humedecida. Aplique gasa húmeda adicional para cubrir el estómago, el bazo y el hígado, exponiendo el riñón izquierdo y los vasos renales. Con una aguja de hidrodisección de calibre 27 y unas pinzas de punta roma, separe la vena renal izquierda de la arteria renal, eliminando con cuidado la grasa y el tejido conectivo de ambos vasos. Con pinzas bipolares, cauterizar todas las micro ramas laterales, aislando la vena renal y la arteria entre la aorta o vena cava y el riñón. Después de aislar las venas gonadal y suprarrenal, use seda 6-0 para ligarlas temporalmente proximales a la vena renal. Movilizó el uréter en el polo inferior y se ligó con una sutura de seda 6-0. Pinzar primero la arteria renal y luego la vena renal, con una pinza de microvasos lo más cerca posible de la aorta y la vena cava. Secar la arteria renal con unas tijeras de resorte justo después de la bifurcación del vaso y dividir la vena renal aproximadamente a la mitad entre la vena cava y el riñón. Movilice el riñón izquierdo del tejido conectivo circundante y extínelo. Enjuague los muñones de la arteria renal y la vena renal con solución salina heparinizada para eliminar toda la sangre restante. Con unas tijeras de resorte, haga un pequeño corte en la bifurcación de la arteria renal para crear una abertura en forma de embudo. Luego inserte un stent de 8 milímetros cortado de un catéter de calibre 26 y asegúrelo con una sutura de seda 6-0, dejando un extremo de la sutura largo. Introducir el hígado del donante y colocarlo con la vena porta, la vena cava infrahepática y el conducto biliar frente a la vena renal izquierda y la arteria del receptor. Usando una sutura de nailon 9-0, instaló dos suturas de permanencia en lados opuestos de la conexión de la vena renal de la vena cava infrahepática. Luego, use tijeras de resorte para hacer una pequeña incisión en la boca de pez en la cara de la vena renal hasta que el ancho coincida con la vena porta infrahepática del donante. Con una sutura de seda 9-0, anastomosar la vena porta infrahepática del hígado de extremo a extremo hasta la vena renal con nueve o 10 suturas continuas en las paredes frontal y posterior del vaso. Confirmar que la colocación de la arteria renal está debajo de la vena porta infrahepática. A continuación, inserte el stent previamente colocado en la arteria renal en la vena porta hepática y asegúrelo con una sutura de seda 6-0, dejando un extremo de la sutura largo para unirse al hilo opuesto en la arteria. Junte los extremos para evitar que cada uno se deslice fuera del stent. Secuencialmente, retire las micropinzas de la vena renal y luego de la arteria renal. Durante la reperfusión hepática, use gasas e hisopos de algodón para aplicar una ligera presión alrededor de la región de la anastomosis hasta lograr una anastomosis sin fugas. Retire las ligaduras temporales colocadas previamente en las venas suprarrenales y gonadales. Movilice con cuidado aproximadamente 10 milímetros por el extremo del uréter izquierdo desde el tejido conectivo circundante, dejando una cantidad significativa de tejido graso adherido. Con unas tijeras de resorte, haga una pequeña incisión en la pared del uréter proximal a la ligadura 6-0 colocada anteriormente. Inserte el stent de poliamida previamente conectado al conducto biliar en la pequeña incisión realizada en la pared del uréter. Asegure el stent con una sutura de seda 6-0 y ate un extremo con el hilo largo en el lado del conducto biliar del stent, juntando ambos extremos firmemente. Regrese los intestinos a su posición natural y riegue con dos a 3 mililitros de solución salina. Finalmente, cierre el abdomen en capas. A partir del segundo día después de la cirugía, inyectar heparina por vía subcutánea a los receptores de trasplantes alogénicos diariamente. 30 días después del trasplante, los injertos hepáticos singénicos mostraron un color óptimo y permeabilidad del conducto biliar. La histología de hematoxilina y eosina mostró una estructura normal de los hepatocitos sin alteraciones parenquimatosas significativas en intervalos de 8 y 30 días. Por el contrario, los trasplantes alogénicos demostraron una inflamación portal significativa tan pronto como 3 días después del trasplante y un rechazo celular agudo caracterizado por una infiltración linfocítica extensa a los 8 días.

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Investigación

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