Aislamiento de vectores virales adenoasociados mediante un protocolo de cromatografía de afinidad con heparina semiautomatizado y de un solo paso

En este trabajo, pretendemos desarrollar un protocolo mejorado para la producción, purificación y caracterización de vectores virales adenoasociados en mosaico que podría demostrar su valía en estudios preclínicos. A pesar de los esfuerzos por establecer líneas celulares productoras estables, la transfección transitoria en células de mamíferos sigue siendo el flujo de trabajo predominante para la producción de AAV. A continuación, los AAV se purifican mediante centrifugación en gradiente de densidad de ultra alta velocidad o mediante técnicas de cromatografía que se basan en las propiedades bioquímicas de las partículas virales.

Los métodos comúnmente utilizados para purificar AAV hacen uso de cloruro de cesio o ultracentrifugación en gradiente de densidad de iodixanol. A pesar de sus ventajas, tienen algunas limitaciones. Requieren mucho tiempo, tienen una escalabilidad limitada y, a menudo, dan resultados a algunos vectores de baja pureza.

Ahora, para superar estas limitaciones, varios investigadores han centrado su atención en las técnicas de cromatografía. Describimos un protocolo paso a paso para la generación de rAAVs en mosaico basado en la capacidad de unión a la heparina de AAV2. Este método hace que los rAAV de alta pureza y biológicamente activos estén listos para usar en seis días, lo que se presenta como una estrategia semiautomatizada, escalable y rentable para generar rAAV para estudios preclínicos.

Una vez demostrada la aplicabilidad de este método para la generación de rAAV en mosaico, el sistema de producción puede ajustarse ahora para lograr una mejor escalabilidad y rentabilidad mediante el establecimiento de una línea celular productora. Además, nuestro objetivo es eliminar las partículas vacías mediante la inclusión de un segundo paso de purificación de pulido.