Name: Predicción y validación de dianas proteicas de compuestos de moléculas pequeñas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Aprende a predecir y validar dianas proteicas de compuestos de moléculas pequeñas mediante acoplamiento molecular y ensayo de desplazamiento térmico celular. Este protocolo reduce costos y tiempo garantizando reproducibilidad.

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Este trabajo contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82004031) y el Programa de Ciencia y Tecnología de Sichuan (2022NSFSC1303). Expresamos nuestro gran agradecimiento a Jiayi Sun, del Instituto Innovador de Medicina y Farmacia China de la Universidad de Medicina Tradicional China de Chengdu, por su ayuda con la mancha occidental.

Validación de la interacción de Xanthatin-Keap1 con el acoplamiento y CETSA

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<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+chemical-structure+TPOR+agonist%2C+TMEA%2C+promotes+megakaryocytes+differentiation+and+thrombopoiesis+via+mTOR+and+ERK+signalings%5BTitle%5D)+AND+%22Phytomedicine%22%5BJournal%5D)">Novel chemical-structure TPOR agonist, TMEA, promotes megakaryocytes differentiation and thrombopoiesis via mTOR and ERK signalings.</a> Phytomedicine. 110, 154637(2023).</li>
<li>Mateus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+proteome+profiling+for+interrogating+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Thermal proteome profiling for interrogating protein interactions.</a> Mol Syst Biol. 16 (3), 9232(2020).</li>
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<li>Liu, Y., Chen, W., Zheng, F., Yu, H., Wei, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xanthatin+alleviates+LPS-Induced+inflammatory+response+in+RAW264.7+macrophages+by+Inhibiting+NF-%CE%BAB%2C+MAPK+and+STATs+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Xanthatin alleviates LPS-Induced inflammatory response in RAW264.7 macrophages by Inhibiting NF-κB, MAPK and STATs activation.</a> Molecules. 27 (14), 4603(2022).</li>
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<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salidroside%2C+a+phenyl+ethanol+glycoside+from+Rhodiolacrenulata%2C+orchestrates+hypoxic+mitochondrial+dynamics+homeostasis+by+stimulating+Sirt1%2Fp53%2FDrp1+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ethnopharmacol%22%5BJournal%5D)">Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiolacrenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling.</a> J Ethnopharmacol. 293, 115278(2022).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La identificación de dianas patológicas y el descubrimiento y desarrollo de fármacos están estrechamente interrelacionados27. Al dirigirse con precisión a objetivos específicos, se pueden desarrollar candidatos a fármacos para tratar enfermedades particulares de manera más eficaz y, al mismo tiempo, minimizar los efectos secundarios asociados con los medicamentos28,29. Las dianas más utilizadas son las dianas proteicas30. Sin embargo, la identificación de dianas proteicas especiales plantea un inmenso desafío debido a la gran diversidad de proteínas dentro de las células30,31. En este artículo, adoptamos un enfoque que combina el acoplamiento molecular con CETSA para identificar y validar dianas proteicas. Los resultados revelaron una interacción directa entre la xanthatina y la proteína Keap1. La integración de la tecnología informática y los experimentos biológicos también puede emplearse en la investigación de otros fármacos y proteínas diana para determinar la presencia de una interacción directa entre el fármaco y la diana. Este enfoque, que combina la predicción con la verificación, reduce eficazmente tanto el consumo de tiempo como los costes económicos. Además, los instrumentos y materiales experimentales son fáciles de obtener y el proceso de operación no es complicado. Por último, las muestras de CETSA son fáciles de preparar y analizar mediante el método de Western blot, lo que garantiza la reproducibilidad de las muestras.
En nuestra experiencia, hay varios aspectos críticos que requieren especial atención durante los procedimientos experimentales. En primer lugar, es esencial seleccionar la estructura cristalina de la proteína resuelta por análisis de rayos X al elegir la estructura de la proteína antes del acoplamiento molecular. En segundo lugar, la densidad celular y el tiempo de congelación/descongelación son factores cruciales en los experimentos de CETSA. Las células en la fase de crecimiento logarítmico deben seleccionarse para los experimentos de CETSA, ya que su estado de crecimiento es estable y tiene un impacto mínimo en los resultados experimentales. Durante la congelación y descongelación repetida de las células, el tiempo debe controlarse bien y se debe utilizar nitrógeno líquido para la congelación hasta que se forme un sólido blanco, seguido de una descongelación inmediata a temperatura ambiente antes de los ciclos de congelación posteriores. Por último, los experimentos de Western blot deben completarse inmediatamente después de preparar las muestras de CETSA para evitar la degradación de las proteínas.
El acoplamiento molecular y la CETSA son técnicas bien establecidas que desempeñan un papel crucial en el campo del desarrollo de fármacos. El acoplamiento molecular es fundamental para predecir las interacciones a nivel molecular entre los compuestos y sus objetivos, lo que ofrece información valiosa sobre los posibles modos de unión10,11. CETSA, por el contrario, se centra en evaluar el impacto de los fármacos en la estabilidad térmica de las proteínas y sirve como herramienta para validar las interacciones fármaco-proteína17. Si bien CETSA es un método relativamente sencillo para la verificación, también es una forma de bajo rendimiento mediante el uso de Western blot para el estudio del desplazamiento térmico del complejo fármaco-proteína, y no debe ser la única técnica en la que se confíe. Además, los pasos de CETSA son complicados, y cualquier error de paso durante la operación puede tener un gran impacto en los resultados. Además, el método CETSA no puede determinar el sitio de unión específico y el modo de unión del compuesto a la proteína diana y no puede indicar si la unión es covalente o no covalente 17,18,23. Más allá del ensayo de desplazamiento térmico, otros tipos de ensayos energéticos, como la precipitación de proteínas dependientes del pH (pHDPP), también se pueden utilizar para el estudio de las interacciones ligando-proteína32. Además, el perfil térmico del proteoma es un método basado en energía para revelar las interacciones ligando-proteína, lo que permite un análisis a gran escala y de alto rendimiento de las interacciones proteína-fármaco mediante la combinación de proteómica con CETSA33.
Además, la resonancia de plasmón de superficie localizada (LSPR) puede proporcionar un análisis cualitativo y cuantitativo adicional34,35. No solo determina la existencia de interacciones entre un fármaco y su diana, sino que también mide los parámetros de afinidad y los parámetros cinéticos de estas interacciones intermoleculares, ofreciendo una comprensión más completa.
Más allá del ensayo de desplazamiento térmico, la precipitación de proteínas dependiente del pH (pHDPP) también se puede utilizar para el estudio de las interacciones ligando-proteína32. El acoplamiento molecular es un método de simulación basado en la fisiomecánica para predecir las interacciones entre moléculas pequeñas y biomoléculas. Este método tiene como objetivo lograr la unión optimizando la conformación y orientación de moléculas pequeñas para producir la mejor complementariedad entre ellas y las biomoléculas. La predicción de objetivos utiliza técnicas de inteligencia artificial para predecir los sitios de unión entre moléculas pequeñas y biomoléculas. Los dos enfoques tienen diferencias clave en la aplicación del método y la precisión de la predicción. Aplicación del método: el acoplamiento molecular se utiliza principalmente para el diseño y la optimización de fármacos, proporcionando una base teórica para el descubrimiento de nuevos fármacos. La predicción de objetivos, con la ayuda de una inteligencia artificial más avanzada, se aplica con mayor frecuencia al cribado de alto rendimiento y al descubrimiento rápido de compuestos principales para mejorar la eficiencia del descubrimiento de fármacos. Precisión de la predicción: Dado que el acoplamiento molecular se basa en simulaciones físicas, su precisión de predicción es mayor, pero el costo computacional también es relativamente alto. Si bien la predicción de objetivos tiene un costo computacional menor, la precisión de la predicción depende de la abundancia de datos de entrenamiento y la selección del modelo.

Las proteínas son macromoléculas muy importantes en los organismos vivos y poseen una amplia gama de funciones únicas dentro de las células, como la composición de la membrana, la formación del citoesqueleto, la actividad enzimática, el transporte, la señalización celular y la participación en los mecanismos intracelulares y extracelulares 1,2,3. Las proteínas manifiestan sus funciones biológicas principalmente a través de interacciones específicas con una variedad de moléculas, incluidas otras proteínas, ácidos nucleicos, ligandos de moléculas pequeñas e iones metálicos 1,4. Los ligandos son pequeños compuestos moleculares que se unen específicamente a las proteínas de un organismo. La interacción entre proteínas y ligandos ocurre en sitios específicos de la proteína, llamados sitios de unión, también conocidos como bolsas de unión5. En la investigación en química medicinal, el enfoque radica en la identificación de proteínas clave que están claramente asociadas con enfermedades, que sirven como dianas para los medicamentos6. Por lo tanto, obtener una comprensión profunda de los sitios de unión entre proteínas y ligandos es de suma importancia para promover el descubrimiento, el diseño y la investigación de fármacos 7,8.
El acoplamiento molecular es una herramienta computacional ampliamente utilizada para estudiar la unión proteína-ligando, que emplea las estructuras tridimensionales de proteínas y ligandos para explorar sus principales modos de unión y afinidades al formar complejos estables 9,10,11. La aplicación de la tecnología de acoplamiento molecular se originó en la década de 1970. Sobre la base del principio de emparejamiento de cerradura y llave y utilizando los algoritmos del software de acoplamiento molecular, se puede determinar la interacción entre los compuestos y los objetivos moleculares mediante el análisis de los resultados del acoplamiento. Este enfoque permite la predicción de sitios de unión activos tanto para el compuesto como para la molécula objetivo. En consecuencia, facilita la identificación de una conformación de unión óptima (aquí denominada modelo de unión) para las interacciones ligando-receptor, lo cual es crucial para comprender la mecánica de estos compromisos moleculares 12,13,14,15. Si bien el acoplamiento molecular proporciona valiosas predicciones basadas en computadora de las interacciones ligando-receptor, es importante tener en cuenta que estos son hallazgos preliminares. En consecuencia, es esencial una verificación experimental adicional para confirmar estas interacciones.
El ensayo de desplazamiento térmico celular (CETSA), propuesto inicialmente por el equipo de investigación de Pär Nordlund en 2013, sirve como método para validar las interacciones entre fármacos y proteínas diana. Esta técnica prueba específicamente la estabilidad térmica de las proteínas diana inducida por la unión a fármacos, proporcionando un enfoque práctico para confirmar las interacciones moleculares 16,17,18. Este enfoque se basa en el principio fundamental de que la unión de ligandos inicia un cambio térmico dentro de las proteínas objetivo y es aplicable a una amplia gama de muestras biológicas, incluidos lisados celulares, células vivas intactas y tejidos19,20. CETSA apoya el compromiso directo de pequeñas moléculas diana en células intactas mediante la detección de la estabilización termodinámica de las proteínas debido a la unión de ligandos y la vinculación de la respuesta fenotípica observada con el compuesto diana21,22. Entre las diversas metodologías derivadas de CETSA, el Western Blot-CETSA (WB-CETSA) se considera un enfoque clásico. Después de la preparación de la muestra mediante el método CETSA, se utiliza el análisis de Western blot para detectar alteraciones en la estabilidad térmica de la proteína objetivo. Esto permite determinar con precisión las interacciones fármaco-proteína dentro de los sistemas celulares17,23.
La xanthatina es un compuesto bioactivo aislado de la planta Xanthium L. con propiedades como antiinflamatoria, que se ha utilizado en la medicina tradicional china para tratar enfermedades como la sinusitis nasal y la artritis24,25. La proteína 1 asociada a la ECH similar a las algas kelch (Keap1) es un componente del complejo proteico multi-subunidad de ubiquitina ligasa Cullin-RING E3 basado en Cullin3 y un importante regulador de la homeostasis redox intracelular, que influye en la intensidad y duración de la respuesta inflamatoria mediante la modulación del estado redox intracelular26. En este estudio, primero utilizamos el acoplamiento molecular para investigar la interacción entre la xanthatina (molécula pequeña) y la proteína Keap1, con el objetivo de predecir su modo de unión. Posteriormente, empleamos el método CETSA para validar esta interacción evaluando el impacto de la xanthatina en la estabilidad térmica de la proteína Keap1.

<table><tbody><tr><td>0,45 &mu; m Membrana de fluoruro de polivinilideno</td><td>Millipore PR05509</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol anhidro</td><td>Chron chemicals</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>BioFroxx</td><td>4240GR100</td><td></td></tr><tr><td>Mezclas de inhibidores de proteasas de amplio espectro</td><td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td><td>AR1193</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td><td>PYG0040</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de quimioluminiscencia mejorado</td><td>Beyotime Biotechnology Co., Ltd</td><td>P0018S</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo GAPDH</td><td>ProteinTech Group Co., Ltd</td><td>10494-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>Instrumento de imagen en gel</td><td>E-BLOT</td><td>Touch Imager Pro</td><td></td></tr><tr><td>Gradient PCR instrumento</td><td>Biometra TADVANCED</td><td>Biometra Tadvanced 96SG</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td> <td>de congelación de alta velocidadBeckman Coulter</td><td>Allegra X-30R</td><td></td></tr><tr><td>Rábano picante conoxidasa conjugado affiniAnticuerpo puro de cabra</td><td>ProteinTech Group Co., Ltd</td><td>SA00001-2</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol isopropílico&nbsp;</td><td>Chron chemicals</td><td>67-63-0</td><td></td></tr><tr><td>Keap1 anticuerpo</td><td>Zen BioScience Co., Ltd</td><td>R26935</td><td></td></tr><tr><td>Baño de metal</td><td>Analytik Jena</td><td>TSC</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Chron chemicals</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Ncmblot tampón de transferencia rápida (20&times;)</td><td>NCM Biotech Co., Ltd</td><td>WB4600</td><td></td></tr><tr><td>Omni-Easy OneStep PAGE gel preparación rápida kie</td><td>Epizyme Biotech Co., Ltd</td><td>PG212</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de fosfato salino</td><td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td><td>PYG0021</td><td></td></tr><tr><td>Marcador de proteínas de color preteñido</td><td>Biosharp&nbsp;</td><td>BL741A Sistema de</td><td></td></tr><tr><td>electroforesis de transferencia de proteínas</td><td>Bio-Rad</td><td>MiniPROTEAN&Ograve; Tetra Cell</td><td></td></tr><tr><td>RAW264.7 célula</td><td>Beyotime Biotechnology Co., Ltd</td><td>C7505</td><td></td></tr><tr><td>RAW264.7 medio específico de células</td><td>Procell Life Science& Technology Co., Ltd</td><td>CM-0597</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE tampón de carga de proteínas</td><td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td><td>AR1112-10</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE tampón de polvo</td><td>Servicebio</td><td>G2018</td><td></td></tr><tr><td>Tris polvo salino tamponado</td><td>Servicebio</td><td>G0001</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>BioFroxx</td><td>1247ML100</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>Memmert</td><td>WNE10</td><td></td></tr><tr><td>Purificador de agua</td><td>Millipore</td><td>Milli- IQ 7005</td><td></td></tr><tr><td>Xanthatin</td><td>ChemConst Biotechnology Co., Ltd</td><td>CONST210706</td><td></td></tr></tbody></table>

predicción y validación de dianas proteicas de compuestos de moléculas pequeñas

Protein Target Prediction and Validation of Small Molecule Compound

Las proteínas son fundamentales para la fisiología humana, y sus objetivos son cruciales en la investigación y el desarrollo de fármacos. La identificación y validación de dianas proteicas cruciales se ha convertido en una parte integral del desarrollo de fármacos. El acoplamiento molecular es una herramienta computacional ampliamente utilizada para investigar la unión proteína-ligando, especialmente en el contexto de las interacciones entre fármacos y proteínas diana. Para la verificación experimental de la unión y para acceder directamente a la unión del fármaco y su diana, se utiliza el método de ensayo de desplazamiento térmico celular (CETSA). Este estudio tuvo como objetivo integrar el acoplamiento molecular con CETSA para predecir y validar las interacciones entre fármacos y dianas proteicas vitales. En concreto, predijimos la interacción entre la xanthatina y la proteína Keap1, así como su modo de unión, mediante un análisis de acoplamiento molecular, seguido de la verificación de la interacción mediante el ensayo CETSA. Nuestros resultados demostraron que la xanthatina podía establecer enlaces de hidrógeno con residuos de aminoácidos específicos de la proteína Keap1 y reducir la termoestabilidad de la proteína Keap1, lo que indica que la xanthatina podría interactuar directamente con la proteína Keap1.

El análisis de acoplamiento molecular predijo la interacción entre la xanthatina y la proteína Keap1. La Figura 2 muestra la formación de enlaces de hidrógeno entre la xanthatina y los residuos de aminoácidos Gly-367 y Val-606 de la proteína Keap1, con una longitud de enlace de hidrógeno de 2,17 Å para Gly-367 y 2,13 Å para Val-606. Además, la puntuación de acoplamiento calculada de -5,69 kcal/mol significa una buena afinidad de unión entre la xanthatina y la proteína Keap1.
El método CETSA demostró que la unión a xanthatina cambió la estabilidad térmica de la proteína Keap1, confirmando la interacción entre la xanthatina y la proteína Keap121. La figura 3 indica que la xanthatina cambia notablemente la estabilidad térmica de la proteína Keap1 dentro del rango de temperatura de 48 °C a 57 °C, en comparación con el grupo DMSO. Para garantizar la misma carga de muestra, en primer lugar, la densidad de inoculación celular en la que realizamos los experimentos fue consistente; en segundo lugar, las muestras celulares del grupo DMSO y del grupo xanthatin se mezclaron bien en las placas de cultivo celular y luego se distribuyeron uniformemente en dos tubos de microcentrífuga, lo que garantizó la cantidad constante de muestras celulares, y, el volumen de sobrenadante añadido a cada tubo de PCR fue de 60 μL y, por último, el volumen de cada muestra cargada en el Western blot fue de 20 μL, lo que garantizaba una carga uniforme para las muestras calentadas. La degradación de proteínas en muestras de alrededor de 51 °C se debe principalmente a cambios en la estructura de las proteínas y reacciones químicas aceleradas causadas por las altas temperaturas. Los resultados anteriores demuestran que la xanthatina podría unirse directamente a la proteína Keap1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66564/66564fig01.jpg"> Figura 1: Orden de carga de Western blot. La temperatura en orden de izquierda a derecha fue de 45 °C, 48 °C, 51 °C, 54 °C, 57 °C, 60 °C y 63 °C.  El primer carril se agregó con un marcador; se utilizaron dos carriles para cada temperatura; el primer carril era el grupo DMSO, y el segundo carril era el grupo xanthatin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66564/66564fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66564/66564fig02.jpg"> Figura 2: Interacción entre la xanthatina y la proteína Keap1 (PDB: 2FLU). (A) La representación 2D de xanthatin enlazada a Keap1. (B) La visualización en 3D de la xanthatina y la proteína Keap1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66564/66564fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66564/66564fig03.jpg"> Figura 3: Efecto de la xanthatina en la estabilidad térmica de la proteína Keap1. (A) Los efectos de la xanthatina sobre la estabilidad térmica de Keap1 fueron detectados por CETSA. (B) Las densidades ópticas de Keap1 se normalizaron a las obtenidas a 45 °C. Los datos se representan como media ± DE. El análisis estadístico se realizó mediante análisis de varianza de una vía (ANOVA de una vía). n = 3. *p &lt; 0,05, **p &lt; 0,01, p &lt; 0,001, p &lt; 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66564/66564fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

El experimento utilizado aquí muestra un método de acoplamiento molecular combinado con un ensayo de desplazamiento térmico celular para predecir y validar la interacción entre moléculas pequeñas y proteínas objetivo.

Predicción y validación de dianas proteicas de compuestos de moléculas pequeñas

Proteins are fundamental to human physiology, with their targets being crucial in research and drug development. The identification and validation of ...

Nuestra investigación se centra en dianas proteicas, predicción y validación de compuestos moleculares pequeños. El experimento utilizado aquí muestra un método de acoplamiento molecular combinado con un ensayo de desplazamiento térmico similar para predecir y validar la interacción entre moléculas pequeñas y proteínas objetivo. Estos pasos de CETSA son complicados y cualquier error de paso durante la operación puede tener un gran impacto en los resultados.Nuestro protocolo combina la predicción con la verificación, reduciendo eficazmente tanto el consumo de tiempo como los costes económicos. Además, los instrumentos y materiales experimentales son fáciles de utilizar. Por último, las muestras CETSA son fáciles de preparar en ensayo, lo que garantiza la productividad de las muestras.

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Describimos aquí un método para la identificación de proteínas de unión a moléculas pequeñas utilizando el marcaje de fotoafinidad. La ventaja de esta técnica es que la unión y el marcaje covalente de las proteínas diana se producen dentro del entorno celular vivo, lo que elimina el riesgo de alterar la estructura de la proteína nativa y las condiciones de unión durante la lisis celular.

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Aprende a predecir y validar dianas proteicas de compuestos de moléculas pequeñas mediante acoplamiento molecular y ensayo de desplazamiento térmico celular. Este protocolo reduce costos y tiempo garantizando reproducibilidad.

Predicción y validación de dianas proteicas de compuestos de moléculas pequeñas

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