Name: Microscopía intravital de dos fotones del pulmón de ratón trasplantado (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 16 s
Description: Aprende microscopía intravital de dos fotones para estudiar mecanismos inmunes en trasplante pulmonar de ratón. Esta técnica revela interacciones celulares dinámicas y respuestas inmunológicas únicas en tiempo real.

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<meta charset="utf8"></head><body>Monitorización en tiempo real de la dinámica celular en el trasplante de pulmón de ratón

<table><tbody><tr><td>0.75% povidona-yodo</td><td>Aplicare</td><td>NDC 52380-0126-2</td><td>Para desinfectante</td></tr><tr><td>Catéter intravenoso de 1 pulgada 20G</td><td>Terumo</td><td>SROX2025CA</td><td>Para tubo endotraqueal (ETT)</td></tr><tr><td>Cinta de seda de 1 pulgada</td><td>Durapore</td><td>3M ID 7100057168</td><td>Para asegurar el mouse en su posición</td></tr><tr><td>Lente de objetivo largo de inmersión en agua de 20x</td><td>Olympus</td><td>N20X-PFH</td><td></td></tr><tr><td>3M Pegamento</td> <td>VetbondMedi-Vet.com</td><td>10872</td><td>Para pegar cubreobjetos en el pulmón</td></tr><tr><td>655 nm puntos cuánticos no dirigidos</td><td>ThermoFisher</td><td>Q21021MP</td><td>Para el etiquetado de vasos sanguíneos</td></tr><tr><td>70% etanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EX0281</td><td>Para desinfectante</td></tr><tr><td>Argent High Temp Pluma de cauterización de punta fina</td><td>McKesson</td><td>231</td><td></td></tr><tr><td>Black Junta tórica (2 cm)</td><td>Ferretería</td><td>N/A</td><td>Para imágenes personalizadas perno</td></tr> de la cámara <tr><td>(2)</td><td>Ferretería</td><td>N/A</td><td>Para la cámara de imagen a medida</td></tr><tr><td>Tuerca de mariposa de latón (2)</td><td>Ferretería</td><td>N/A</td><td>Para la cámara de imagen personalizada</td></tr><tr><td>Buprenorfina 1,3 mg/mL</td><td>Fidelis Animal Health</td><td>NDC 86084-100-30</td><td>Para el control del dolor</td></tr><tr><td>Camaleón láser pulsado de femtosegundo de titanio-zafiro Coherente</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos (24 mm x 50 mm)</td><td>Thomas Scientific</td><td>1202F63</td><td>Para cámara de imagen</td></tr><tr><td>personalizada Pinza antimosquitos curvada (1)</td><td>Fine Science Tools</td><td>13009-12</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de calentador de doble canal</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras finas (1)</td><td>Fine Science Tools</td><td>15040-11</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio vertical de platina fija</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>Gasa (cortada a 1 cm x 3 cm)</td><td>McKesson</td><td>476709</td><td>Para colocar debajo del pulmón izquierdo</td></tr><tr><td>Grasa de alto vacío</td><td>Dow Corning</td><td>N/A</td><td>Para adherir el cubreobjetos a la placa superior</td></tr><tr><td>Isoflurano 1%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>26675-46-7</td><td>Para anestesia</td></tr><tr><td>Clorhidrato de ketamina 100 mg/mL</td><td>Vedco</td><td>NDC 50989-996-06</td><td>Para anestesia</td></tr><tr><td>Lámina de metal (3 cm x 7 cm)</td><td>Ferretería</td><td>N/A</td><td>Para cámara de imagen a medida</td></tr><tr><td>Aplicadores puntiagudos con punta de algodón</td><td>Solon</td><td>56225</td><td>Para manipular el pulmón y para la disección roma</td></tr><tr><td>Power Pro Ultra</td><td>clipper Oster</td><td>078400-020-001</td><td></td></tr><tr><td>Puralube Vet ungüento ocular</td><td>Medi-Vet.com</td><td>11897</td><td>Para prevenir la desecación ocular</td></tr><tr><td>Ventilador para animales pequeños</td><td>Harvard Aparato</td><td>55-0000</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas rectas (1)</td><td>Fine Science Tools</td><td>91113-10</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de obturador de tres canales</td><td>Uniblitz</td><td>VMM-D3</td><td>Escáner resonante</td></tr><tr><td>x.y.z motor paso a paso óptico Prior</td><td>Scientific</td><td>OptiScan II</td><td></td></tr><tr><td>Xilacina 20 mg/mL</td><td>Akorn</td><td>NDC 59399-110-20</td><td>Para el control del dolor</td></tr></tbody></table>

microscopía intravital de dos fotones del pulmón de ratón trasplantado

Intravital Two-Photon Microscopy of the Transplanted Mouse Lung

Después de 1 h de almacenamiento isquémico en frío a 4 °C, trasplantamos ortotópicamente el pulmón izquierdo de un ratón B6 a un B6. LysM-GFP en ratón4, y luego se realizaron imágenes intravitales de dos fotones, como se describió anteriormente. Realizamos imágenes en dos momentos post-trasplante: 2 h (Figura 3A) y 24 h (Figura 3B). Los vasos sanguíneos están marcados en rojo por los puntos q inyectados inmediatamente antes de la toma de imágenes. Además, podemos visualizar monocitos que han ocupado puntos q a las 24 h4. En el vídeo correspondiente se puede ver a los neutrófilos derivados del receptor marcados en verde infiltrándose en el injerto pulmonar a las 24 h después del trasplante (vídeo complementario 1). Los alvéolos se pueden visualizar como cráteres oscuros debido a la SHG del colágeno (flechas blancas en la Figura 3). Observamos que a las 24 h post-trasplante hay más neutrófilos en el pulmón en comparación con las 2 h post-trasplante (Figura 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66566/66566fig01.jpg"> Figura 1: Preparación del ratón para la obtención de imágenes de dos fotones. (A) Piel reabierta sobre la toracotomía izquierda. (B) Piel y tejidos blandos extirpados sobre el tórax izquierdo. (C,D) Las costillas se sujetan durante 10 s antes de dividirse. (E)3ª-5ª costillas izquierdas resecadas para crear una ventana que mide ~0,8 cm craneocaudalmente x 1,0 cm anteroposterior. (F) Pulmón izquierdo elevado fuera del tórax izquierdo y colocado sobre una tira de gasa. (G) Una cámara de imágenes con una ventana de imágenes se superpone al pulmón izquierdo. (H) La cámara de imagen colocada en la platina del microscopio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66566/66566fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66566/66566fig02.jpg"> Figura 2: Configuración de la cámara de imagen. (A) La cámara de imagen colocada en la platina del microscopio. (B) Vista ampliada del mecanismo de perno accionado por resorte para asegurar la placa superior sobre el pulmón izquierdo. (C) Parte delantera y trasera de la placa superior con junta tórica y vidrio de cobertura aplicados. Las líneas blancas representan el área donde se aplica la grasa de vacío para adherir el cubreobjetos a la placa superior. El círculo gris representa un anillo de pegamento para aplicar al vidrio de la cubierta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66566/66566fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66566/66566fig03.jpg"> Figura 3: Imagen intravital de dos fotones de un trasplante de pulmón izquierdo de ratón de B6 a B6. Ratón LysM-GFP con 1 h de almacenamiento isquémico en frío. Las imágenes se realizan a las (A) 2 h y (B) 24 h después del trasplante. El rojo representa los puntos q. El verde representa los neutrófilos de B6. Receptor de LysM-GFP. El azul representa el SHG de los alvéolos ricos en colágeno. Las flechas blancas muestran los espacios aéreos alveolares. La barra de escala representa 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66566/66566fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Figura complementaria 1: Placa superior con dos resistentes unidas para proporcionar calefacción adicional. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66566/Supplemental%20Figure%201.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Video complementario 1: Imágenes de lapso de tiempo de dos fotones de pulmón izquierdo de ratón trasplantado de B6 a B6. LysM-GFP en ratón con 1 h de almacenamiento isquémico en frío, realizado a las 24 h después del trasplante. El rojo representa los puntos q. El verde representa los neutrófilos del receptor de LysM-GFP. El azul representa la segunda generación armónica a partir de los alvéolos ricos en colágeno. La barra de escala representa 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66566/Supplemental%20Video%201.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Microscopía intravital de dos fotones del pulmón de ratón trasplantado

Complications after lung transplantation are largely related to the host immune system responding to the graft. Such immune responses are regulated by ...

intravital-two-photon-microscopy-of-the-transplanted-mouse-lung

Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Hemos desarrollado nuevas herramientas de laboratorio y protocolos para la adquisición de imágenes intravital del timo. Nuestra técnica debería ayudar en la identificación de "nichos" en el timo en el desarrollo de células T se produce.

Imagen intravital del timo de ratón utilizando 2-Photon Microscopy

Este protocolo describe el uso de la microscopía multifotónica para realizar imágenes unicelulares de alta resolución a largo plazo del pulmón intacto en tiempo real utilizando una ventana de imagen estabilizada por vacío.

A largo plazo de alta resolución Microscopia intravital en el pulmón con una ventana de imagen vacío Estabilizado

Este protocolo describe la imagen intravital de ratones transgénicos que expresaban marcadores fluorescentes específicos de la célula. La proyección de imagen intravital proporciona un método no invasivo para observaciones de alta resolución en animales vivos utilizando windows implantables a través del cual es posible la visualización microscópica de los procesos. Este método es especialmente útil para estudiar procesos longitudinales.

La microscopia intravital de la utilización de la vasculatura asociada a Tumor avanzado Dorsal cámaras de ventana pliegues cutáneos en ratones transgénicos fluorescentes

En este estudio, presentamos un protocolo para realizar dos fotones intravital proyección de imagen y de la célula análisis de interacción en la mucosa traqueal murina después de la infección con virus de la gripe. Este Protocolo será relevante para los investigadores que estudian la dinámica celular inmune durante las infecciones respiratorias.

Proyección de imagen de interacción de células en Mucosa traqueal durante la infección del Virus de la Influenza usando microscopia Intravital de dos fotones

El protocolo introdujo aquí permite la caracterización de la capacidad de pulmón homing de linfocitos humanos primarios en condiciones inflamatorias en vivo. La infiltración pulmonar de células inmunes humanas eventualmente transferidas en un modelo murino de inflamación alérgica puede ser reflejada y cuantificada mediante microscopía de fluorescencia de luz hoja de tejido pulmonar químicamente limpia.

Avanzadas de la proyección de imagen de pulmón Homing de linfocitos humanos en un Experimental en modelo Vivo de inflamación alérgica basada en microscopia de luz hoja

La imagen in vivo es una herramienta poderosa para el estudio de la biología en la salud y la enfermedad. Este protocolo describe imágenes transpupilares de la retina del ratón con un microscopio estándar de dos fotones. También demuestra diferentes métodos de imagen in vivo para etiquetar fluorescentemente múltiples cohortes celulares de la retina.

Imágenes transpupilares de dos fotones in vivo de la retina del ratón

Aquí, presentamos un protocolo para la implantación quirúrgica de una ventana óptica permanentemente permanente para el tórax murino, que permite obtener imágenes intravitales de alta resolución del pulmón. La permanencia de la ventana la hace muy adecuada para el estudio de los procesos celulares dinámicos en el pulmón, especialmente aquellos que evolucionan lentamente, como la progresión metastásica de las células tumorales diseminadas.

Una ventana permanente para investigar la metástasis del cáncer en el pulmón

Describimos el trasplante intraparenquimatoso de células progenitoras neurales humanas transducidas con un vector informador dual que expresa la proteína fluorescente verde luciferasa (GFP) en el cerebro del ratón. Después del trasplante, la señal de luciferasa se mide repetidamente utilizando bioluminiscencia in vivo y células injertadas que expresan GFP identificadas en secciones cerebrales mediante microscopía de fluorescencia.

Trasplante intracerebral y seguimiento de bioluminiscencia in vivo de células progenitoras neurales humanas en el cerebro de ratón

El manuscrito describe una metodología para el establecimiento y seguimiento longitudinal del crecimiento de las metástasis pulmonares espontáneas de tumores de mama inyectados ortotópicamente, susceptibles de intervención en todas las etapas de la cascada metastásica.

In vivo Diagnóstico por imágenes para medir la metástasis pulmonar espontánea de células tumorales de mama inyectadas ortotópicamente

La terapia celular ofrece una intervención prometedora para la fibrosis pulmonar mediante el uso de células progenitoras para reparar el tejido dañado y mejorar la función pulmonar. Dado que las imágenes desempeñan un papel fundamental en el seguimiento de la integración celular, en este trabajo describimos el seguimiento in vivo guiado por imágenes magnéticas de la terapia celular para la fibrosis pulmonar en un modelo de ratón.

Seguimiento in vivo guiado por imágenes de células progenitoras epiteliales pulmonares distales trasplantadas para fibrosis pulmonar mediante imágenes de partículas magnéticas

Aquí presentamos un protocolo para la imagen intravital de un Mycobacterium tuberculosis atenuado aprobado por BSL-2. Cepa en el pulmón murino utilizando una ventana pulmonar permanente. Este enfoque permite un análisis longitudinal con resolución de célula única de las interacciones tempranas huésped-patógeno, incluyendo la localización bacilar, la dinámica vascular y la captación de macrófagos dentro del mismo microambiente pulmonar.

Imagen intravital de Mycobacterium tuberculosis auxotrófico atenuado en el pulmón murino durante una infección intravascular temprana

Aprende microscopía intravital de dos fotones para estudiar mecanismos inmunes en trasplante pulmonar de ratón. Esta técnica revela interacciones celulares dinámicas y respuestas inmunológicas únicas en tiempo real.

Microscopía intravital de dos fotones del pulmón de ratón trasplantado

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