Name: Ensayo de migración in vitro en tiempo real para linfocitos T murinos CD8+ primarios (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: Aprende a realizar ensayos de migración in vitro en tiempo real para linfocitos T CD8+ murinos primarios mediante microscopía de lapso temporal. Este protocolo permite analizar dinámicas celulares y vías de señalización con precisión.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos a los miembros anteriores y actuales del Kim Lab que han contribuido al desarrollo de estos protocolos a lo largo del tiempo. Los datos representativos fueron posibles gracias a P01 AI102851/AI/NIAID, NIH HHS/Estados Unidos y P01 HL018208/HL/NHLBI, NIH HHS/Estados Unidos. Esta publicación fue posible en parte gracias a la subvención número T32 GM135134 del Premio Institucional Ruth L. Kirschstein del Servicio Nacional de Investigación.

Los protocolos con animales fueron aprobados por el Comité Universitario de Recursos Animales de la Universidad de Rochester. Los ratones de este estudio se mantuvieron en el espacio libre de patógenos de las instalaciones de animales de la Universidad de Rochester. Para el presente estudio se utilizaron ratones macho/hembra C57BL/6, de 6 a 12 semanas de edad (15-30 g). El aislamiento del tejido del ratón se puede realizar en una mesa de trabajo con guantes para cubrir las manos y una mascarilla para cubrir la nariz y la boca, o dentro de un gabinete de bioseguridad. Todos los cultivos celulares y la preparación de placas deben realizarse en una cabina de bioseguridad. Los reactivos y equipos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Purificación y activación de células T CD8+
<ol><li>Preparación de materiales<ol><li>Para la selección negativa de linfocitos T CD8+ : Prepare un medio de selección negativo a partir del sobrenadante de los anticuerpos GK1.5 y M5/114 de las líneas celulares de hibridoma GK1.5 y M5/114, que producen anti-CD4 y anti-MHCII, respectivamente. Mezclar el sobrenadante en una proporción de 1:1, filtrarlo y almacenarlo a 4 °C para su uso futuro (>0,5 μg de cada anticuerpo/millón de células totales). Alternativamente, están disponibles kits comerciales de aislamiento de células T CD8+ .</li>
		<li>Para la activación de las células T: Añadir 500 μL de anticuerpos CD3 (10 μg/mL) y CD28 (16 μg/mL) en 1x DPBS (sin calcio ni magnesio) a una placa de 24 pocillos tratada con cultivo de tejidos (TC) y almacenar durante la noche a 4 °C para asegurar la unión de la placa. NOTA: Los anticuerpos y las proteínas recubren las placas/placas de cultivo no tratadas con TC mejor que las normales tratadas con TC, por lo que las placas de cultivo no tratadas con TC se utilizan para la generación de células T.</li>
	</ol></li>
	<li>Prepare una placa de cultivo de 10 cm (o equivalente) colocando un colador de células de 70 μm en la placa y dispense 2 mL de medio R9 en el filtro (medio R9: RPMI 1640x suplementado con 10% de FBS, 1% antibiótico-antimicótico, 20 mM de tampón HEPES, 1% de aminoácidos no esenciales MEM, 50 μM de β-mercaptoetanol).</li>
	<li>Obtener un ratón con antecedentes genéticos, sexo, edad y peso apropiados según lo determinado por el diseño experimental.</li>
	<li>Aplicar la eutanasia al ratón con CO2 seguido de luxación cervical, o estrategias de eutanasia apropiadas según lo definido por los protocolos locales de cuidado y uso de animales y aprobado por la institución.</li>
	<li>Coloque al ratón en una postura supina, estire las cuatro extremidades perpendiculares al cuerpo y sujete las almohadillas de los pies a un tablero de disección con alfileres T de disección de ratón o equivalentes. Realice una incisión central superficial a través de la capa cutánea en la parte inferior ventral del abdomen con tijeras de disección quirúrgica de ratón y corte directamente hasta la barbilla (~ 8 cm). Separe la piel del revestimiento peritoneal para exponer los ganglios linfáticos. Estire la piel perpendicularmente lejos del tronco y sujétela5.<ol><li>Extirpe suavemente los ganglios linfáticos cervicales, axiales, braquiales e inguinales bilateralmente con pinzas romas (o el tipo preferido de un kit de disección quirúrgica estándar para ratones). Transfiera al filtro de células preparado en el paso 1.2.</li>
		<li>Abra el peritoneo y extraiga el bazo. Transfiera al filtro de células preparado en el paso 1.2.</li>
		<li>Deseche el cadáver del ratón en el receptáculo de riesgo biológico adecuado.</li>
	</ol></li>
	<li>Prepare una suspensión unicelular de los tejidos linfoides secundarios mediante disrupción mecánica sobre el filtro celular de 70 μm con 2 mL de medio R9 del paso 1.2 girando la herramienta de disrupción tisular media vuelta en el sentido de las agujas del reloj y en el sentido contrario a las agujas del reloj repetidamente. NOTA: El extremo del émbolo de una jeringa Luer-Lock, ya sea de 3 ml o de 10 ml, funciona bien para triturar y homogeneizar el tejido. Se pueden utilizar materiales alternativos a discreción del usuario.</li>
	<li>Lave las células, el extremo de la jeringa, el colador y la placa de cultivo con 7 ml de medio, asegurándose de que el colador permanezca en posición vertical para evitar la transferencia de trozos más grandes de tejido o agregados celulares que puedan estar presentes en la suspensión unicelular.</li>
	<li>Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mL.</li>
	<li>Granular las células a 270 x g a temperatura ambiente (20 °C) durante 5 min y decantar el sobrenadante.</li>
	<li>Añadir 500 μL de tampón lisante durante 1 min para eliminar los glóbulos rojos. Diluir con 9,5 mL de medio R9 y centrifugar a 270 x g (20 °C) durante 5 min. Decantar el sobrenadante.</li>
	<li>Vuelva a suspender el pellet en 10 mL del medio de selección negativo previamente preparado que contiene anti-MHCII y anti-CD4 (paso 1.1.1). Mecer a temperatura ambiente (20 °C) durante 30 min.</li>
	<li>Granular las células a 270 x g durante 5 min y decantar el sobrenadante. Lavar 3 veces con 10 mL de R9 medio.</li>
	<li>Simultáneamente, en un tubo cónico de 15 mL, lavar 200 μL de perlas de IgG anti-ratas de oveja en 7 mL de medio. Coloque el tubo en un imán, retire el medio y repita el paso de lavado dos veces. Vuelva a suspender las perlas en 7 mL de medio R9.</li>
	<li>Granule las células a 270 x g (20 °C) durante 5 min, decante el sobrenadante y luego vuelva a suspender el pellet en 7 ml de suspensión de perlas del paso 1.13. Mecer a temperatura ambiente (20 °C) durante 45 min.</li>
	<li>Enriquezca las células T CD8+ mediante el agotamiento magnético de las perlas. Coloque el tubo cónico directamente sobre el imán sin tapa durante 3 minutos para eliminar las células unidas a anticuerpos/perlas. Las células CD8+ deben ser retenidas. Con el tubo aún en el imán, recoja la suspensión celular con una pipeta serológica o equivalente y transfiérala a un nuevo tubo de 15 ml. Centrifugar a 270 x g (20 °C) durante 5 min y lavar 3 veces a temperatura media.</li>
	<li>Lave la placa de activación prerrevestida (paso 1.1.2) con 1x DPBS dos veces sin pipetear directamente en la superficie inferior de la placa.</li>
	<li>Opcional: Realice una separación de linfocitos vivos y muertos para eliminar las células muertas.<ol><li>Transfiera las células a un tubo cónico de 15 mL. Agregue suavemente 2 mL de medio de separación de linfocitos al fondo de la suspensión celular. Centrífuga a 900 x g durante 10 min (a temperatura ambiente) a baja aceleración y desaceleración. NOTA: Las células vivas se separarán en la interfaz del medio y el medio de separación (capa blanca media). Las células muertas se desprenderán en el fondo del tubo y se pueden desechar al final.</li>
		<li>Transfiera la capa intermedia que contiene linfocitos vivos a un nuevo tubo y centrifugue a 270 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Decantar el sobrenadante.</li>
	</ol></li>
	<li>Resuspender el pellet en 12 mL de medio con 10 U/mL de IL-2 recombinante de ratón. Coloque 1 mL por pocillo en una placa de 24 pocillos no tratada con TC y transfiérala a 37 °C durante la noche.</li>
</ol>2. Levantar las células T CD8+ activadas
<ol><li>Visualice las células utilizando un microscopio óptico de sobremesa estándar, utilizando el objetivo 4x o 10x. NOTA: Las células T activadas aparecerán más grandes y redondas o alargadas en comparación con las células T inactivadas y deben tener grupos densos de células en todo el pocillo.</li>
	<li>Para levantar las células activadas, rompa las células con una pipeta de 1 mL, asegurándose de mezclar bien en los bordes de la placa. Transfiera las células a un nuevo tubo cónico de 15 mL. NOTA: Las células activadas son más pegajosas y requieren un pipeteo más vigoroso.</li>
	<li>Lave los pocillos con 1 mL de medio R9 para eliminar las células restantes. Repita una vez más si es necesario. Centrifugar las celdas a 270 x g (20 °C) durante 5 min. Deseche el sobrenadante.</li>
	<li>Realice una separación de linfocitos vivos/muertos para eliminar las células muertas como en los pasos 1.17-1.18.</li>
	<li>Mantenga las células T mediante la eliminación de células vivas/muertas cada 3-4 días en medio R9 con IL-2 en una placa de 6 pocillos no TC. NOTA: Las células T proliferan mejor en pocillos de pequeña dimensión durante la activación temprana, posiblemente debido a los contactos entre células T o a factores solubles derivados de células T que ayudan a su activación. La rápida proliferación de células T hace que el medio de cultivo amarillee dentro de las 24-48 horas posteriores al cultivo. En este punto, levante las células y transfiéralas a un pocillo más grande (placa de 6 pocillos sin recubrimiento, no TC) con suficiente medio de cultivo fresco para alimentar las células (generalmente 5 mL por pocillo). Reemplace el medio agotado por fresco siempre que lo indique el cambio de color del medio amarillo, o cada 3-4 días.</li>
</ol>3. Preparación del plato de vidrio
<ol><li>Prepare las cámaras o placas de migración de células de vidrio mediante un recubrimiento con 300 μL/cm2 de proteína A (0,1 mg/ml) durante la noche a 4 °C, lave dos veces con 1x DPBS dispensando en el plato y decantando antes de pasar al siguiente paso.</li>
	<li>Cubra la cámara o placa de migración con 300 μL/cm2 de quimera recombinante de ratón ICAM-1 o VCAM-1 Fc (0,1-2,75 mg/mL) junto con una quimiocina recombinante de ratón (0,1-10 μg/mL) durante 2-3 h a temperatura ambiente. Otros ligandos de integrina, como la fibronectina, el colágeno IV de ratón y la E-cadherina de ratón, se recubren directamente la cámara a 2,5-10 μg/ml durante la noche a 4 °C.<ol><li>Lave las cámaras dos veces con 1x DPBS dispensando en el plato y decantando inmediatamente después antes de agregar las celdas. NOTA: Las células T pueden migrar de manera diferente en diferentes concentraciones de ligandos de integrinas y quimiocinas dependiendo del estado de activación, diferenciación, sensibilización y cebado. Se sugiere encarecidamente analizar la migración celular en múltiples concentraciones diferentes.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloque las células adherentes en placas recubiertas de vidrio 24 horas antes del inicio de la obtención de imágenes si se cultivan células T con otras células, como las células cancerosas, para medir la destrucción de células T de las células cancerosas en tiempo real.</li>
</ol>4. Preparación de las células
<ol><li>Opcional: Teñir los linfocitos T y los linfocitos adherentes con el colorante rastreador celular de elección a 1 μg/mL por 1 x 107 celdas en 1x DPBS durante 15 min a 37 °C, o según el protocolo del fabricante.</li>
	<li>Cuente las células con un hemocitómetro o equivalente.</li>
	<li>Placa 1 x 105 linfocitos T CD8+ (o la cantidad deseada) en el medio L-15 de Leibovitz suplementado con 1-5 g/L de glucosa en una cámara a 37 °C. NOTA: El medio L-15 está formulado para su uso sin un sistema de bicarbonato de sodio CO2. Se tampona utilizando aminoácidos básicos libres, tampones de fosfato y galactosa para mantener los niveles de pH.</li>
	<li>Opcional: Realice el bloqueo de integrinas.<ol><li>Preincubar linfocitos T con un anticuerpo bloqueante contra una integrina (1-10 μg/mL, anti-ratón CD11a (M17/4), anti-ratón CD18 (M18/2), anti-ratón VLA-4 (9C10) durante 10 minutos y permitir que se arrastre en presencia del mismo anticuerpo.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Microscopía de lapso de tiempo
<ol><li>Realizar microscopía de video.</li>
	<li>En el caso de los linfocitos T, adquiera imágenes de campo claro y fluorescentes cada 10-60 s durante 10-60 minutos, o los ajustes de adquisición deseados. NOTA: La migración de linfocitos T es sensible a la temperatura, y la temperatura óptima para la migración de linfocitos T de ratón es de 37 °C. El sistema de control de temperatura que utiliza este protocolo consiste en una cubierta de microscopio cerrada y aislada con un sistema de calefacción adjunto. La cámara de imagen se encuentra en la plataforma de imagen. El perímetro de esta cámara tiene un pozo lleno de agua destilada que permite un calor y una humedad constantes durante la toma de imágenes. El micropocillo se coloca en el centro de la cámara de imágenes.</li>
</ol>6. Análisis asistido por software de la migración de células T
<ol><li>Utilice el software Volocity para evaluar la migración de células T.<ol><li>Abre Volocity y crea una nueva secuencia de imágenes.</li>
		<li>Seleccione y mueva todas las películas de microscopía de video de lapso de tiempo al área azul en Volocity.</li>
		<li>Ajuste el brillo y el contraste con la herramienta de mejora de contraste a la configuración deseada por el investigador.</li>
		<li>Compruebe el tamaño de las imágenes: 0,325 μm para 20x, 0,65 μm para 10x.</li>
		<li>Secuencia: establecer puntos de tiempo (por ejemplo: 81 imágenes si se toma una imagen cada 15 s durante 20 minutos, 4 por minuto).</li>
		<li>Desmarque todos los puntos de tiempo en la pestaña de medición.</li>
		<li>Encuentre objetos usando la intensidad: deslice la barra para que quede justo a la derecha del pico.</li>
		<li>Excluir objetos por tamaño: todas las celdas que tengan menos de 10 μm de diámetro y más de 100 μm para excluir restos celulares o partículas no celulares. Excluir los linfocitos T que están migrando durante menos del 20% del tiempo de registro (que puede variar dependiendo de la definición de cada investigador).</li>
		<li>Ignorar objetos estáticos (casilla de verificación).</li>
		<li>Unir automáticamente tramos rotos (casilla de verificación).</li>
		<li>Establezca la ruta más corta en no más de 20 μm.</li>
		<li>La pista de la migración de una célula es la línea que conecta la ubicación de la misma célula a lo largo del tiempo. Asegúrese de que el algoritmo de seguimiento realiza un seguimiento mediante la detección de dónde se detectan los objetos individuales mediante la segmentación en cada fotograma, y que los objetos coinciden entre fotogramas.</li>
		<li>Guarde un nuevo protocolo eligiendo Mediciones > Guardar protocolo > Nombre Nuevo protocolo.</li>
		<li>Haga clic en medir todos los puntos de tiempo en la pestaña de medición.</li>
		<li>Ordene las pistas por intervalo de tiempo, de mayor a menor.</li>
		<li>Registre los números de identificación de pista para todas las celdas con buenas pistas según lo definido por el investigador. Después del seguimiento automático de células, es necesaria una evaluación manual de cada pista de célula para excluir las pistas identificadas falsamente o rotas. Excluya las celdas con pistas incorrectas.</li>
		<li>Exporte el archivo como texto separado por comas y transfiera los datos al software de análisis deseado. NOTA: Parámetros básicos: Velocidad (μm/min), desplazamiento (movimiento neto, μm), longitud de la pista (longitud total del trayecto, μm) e índice de meandros (MI; desplazamiento neto/longitud de la pista. MI = 1 indica una pista lineal completamente recta).</li>
	</ol></li>
	<li>Realice el seguimiento manual con la imagen J.<ol><li>Abra los complementos y seleccione seguimiento y seguimiento manual. Establezca los parámetros: intervalos de tiempo, calibración x/y (tamaño de píxel) y calibración z (en modo de seguimiento manual). Inicie el seguimiento de celdas individuales haciendo clic en agregar pista, seleccionando una celda en el primer punto de tiempo y continuando a través de todos los puntos de tiempo. A continuación, haga clic en Finalizar pista. Repítelo para todas las celdas de interés. NOTA: Trackmate, otra herramienta para el seguimiento de celulares, es un software de seguimiento automático disponible a través del complemento ImageJ.</li>
	</ol></li>
</ol>

Elucidación de la cinética de las células T: métodos para el análisis de la migración en tiempo real

<ol><li>Sun, L., Su, Y., Jiao, A., Wang, X., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">T cells in health and disease.</a> Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235(2023).</li>
<li>Fowell, D. J., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spatio-temporal+control+of+effector+T+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The spatio-temporal control of effector T cell migration.</a> Nat Rev Immunol. 21 (9), 582-596 (2021).</li>
<li>Tabdanov, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+t+cells+to+enhance+3d+migration+through+structurally+and+mechanically+complex+tumor+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Engineering t cells to enhance 3d migration through structurally and mechanically complex tumor microenvironments.</a> Nat Commun. 12 (1), 2815(2021).</li>
<li>Kameritsch, P., Renkawitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+leukocyte+migration+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Principles of leukocyte migration strategies.</a> Trends Cell Biol. 30 (10), 818-832 (2020).</li>
<li>Flaherty, S., Reynolds, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+naive+CD4%2B+T+cell+isolation+and+in+vitro+differentiation+into+t+cell+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse naive CD4+ T cell isolation and in vitro differentiation into t cell subsets.</a> J Vis Exp. (98), e52739(2015).</li>
<li>Sailer, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pd-1%28hi%29+CAR-T+cells+provide+superior+protection+against+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Pd-1(hi) CAR-T cells provide superior protection against solid tumors.</a> Front Immunol. 14, 1187850(2023).</li>
<li>Lim, K., Hyun, Y. M., Lambert-Emo, K., Topham, D. J., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+integrin+mac-1+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Visualization of integrin mac-1 in vivo.</a> J Immunol Methods. 426, 120-127 (2015).</li>
<li>Lim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+trails+guide+influenza-specific+CD8%2B+T+cells+in+the+airways%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil trails guide influenza-specific CD8+ T cells in the airways.</a> Science. 349, 4352(2015).</li>
<li>Lim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+neutrophil+efferocytosis+shapes+T+cell+immunity+to+influenza+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">In situ neutrophil efferocytosis shapes T cell immunity to influenza infection.</a> Nat Immunol. 21 (9), 1046-1057 (2020).</li>
<li>Reilly, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T%28rm%29+integrins+CD103+and+CD49a+differentially+support+adherence+and+motility+after+resolution+of+influenza+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">T(rm) integrins CD103 and CD49a differentially support adherence and motility after resolution of influenza virus infection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (22), 12306-12314 (2020).</li>
<li>Amitrano, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+control+of+CD8%28%2B%29+T+cell+metabolism+and+effector+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Optical control of CD8(+) T cell metabolism and effector functions.</a> Front Immunol. 12, 666231(2021).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+chemokine+receptor+signal+and+t-cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of chemokine receptor signal and t-cell migration.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (17), 6371-6376 (2014).</li>
<li>Capece, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+intracellular+pool+of+IFA-1+is+critical+for+asymmetric+CD8%28%2B%29+T+cell+activation+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel intracellular pool of IFA-1 is critical for asymmetric CD8(+) T cell activation and differentiation.</a> J Cell Biol. 216 (11), 3817-3829 (2017).</li>
<li>Hirai, T., Whitley, S. K., Kaplan, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+and+function+of+memory+CD8%28%2B%29+T+cells+in+skin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Migration and function of memory CD8(+) T cells in skin.</a> J Invest Dermatol. 140 (4), 748-755 (2020).</li>
<li>Mouchacca, P., Schmitt-Verhulst, A. M., Boyer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+cytolytic+T+cell+differentiation+and+granule+exocytosis+with+T+cells+from+mice+expressing+active+fluorescent+granzyme+B%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Visualization of cytolytic T cell differentiation and granule exocytosis with T cells from mice expressing active fluorescent granzyme B.</a> PLoS One. 8 (6), e67239(2013).</li>
<li>Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+neutrophil+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of neutrophil chemotaxis.</a> Methods Mol Biol. 370, 23-36 (2007).</li>
<li>Heit, B., Tavener, S., Raharjo, E., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intracellular+signaling+hierarchy+determines+direction+of+migration+in+opposing+chemotactic+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">An intracellular signaling hierarchy determines direction of migration in opposing chemotactic gradients.</a> J Cell Biol. 159 (1), 91-102 (2002).</li>
<li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ability+of+polymorphonuclear+leukocytes+to+orient+in+gradients+of+chemotactic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors.</a> J Cell Biol. 75 (2), Pt 1 606-616 (1977).</li>
<li>Jowhar, D., Wright, G., Samson, P. C., Wikswo, J. P., Janetopoulos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+access+microfluidic+device+for+the+study+of+cell+migration+during+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Open access microfluidic device for the study of cell migration during chemotaxis.</a> Integr Biol (Camb). 2 (11-12), 648-658 (2010).</li>
<li>Sai, J., Walker, G., Wikswo, J., Richmond, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IL+sequence+in+the+LLKIL+motif+in+CXCR2+is+required+for+full+ligand-induced+activation+of+Erk%2C+Akt%2C+and+chemotaxis+in+HL60+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The IL sequence in the LLKIL motif in CXCR2 is required for full ligand-induced activation of Erk, Akt, and chemotaxis in HL60 cells.</a> J Biol Chem. 281 (47), 35931-35941 (2006).</li>
<li>Choi, Y., Sunkara, V., Lee, Y., Cho, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exhausted+mature+dendritic+cells+exhibit+a+slower+and+less+persistent+random+motility+but+retain+chemotaxis+against+ccl19%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Exhausted mature dendritic cells exhibit a slower and less persistent random motility but retain chemotaxis against ccl19.</a> Lab Chip. 22 (2), 377-386 (2022).</li>
<li>Harding, M. G., Zhang, K., Conly, J., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+crawling+in+capillaries%3A+A+novel+immune+response+to+staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Neutrophil crawling in capillaries: A novel immune response to staphylococcus aureus.</a> PLoS Pathog. 10 (10), e1004379(2014).</li>
<li>Rommerswinkel, N., Niggemann, B., Keil, S., Zanker, K. S., Dittmar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cell+migration+within+a+three-dimensional+collagen+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of cell migration within a three-dimensional collagen matrix.</a> J Vis Exp. (92), e51963(2014).</li>
<li>Wu, P. H., Giri, A., Sun, S. X., Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+migration+does+not+follow+a+random+walk%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell migration does not follow a random walk.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (11), 3949-3954 (2014).</li>
<li>Lammermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+leukocyte+migration+by+integrin-independent+flowing+and+squeezing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing.</a> Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).</li>
<li>Overstreet, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation-induced+interstitial+migration+of+effector+CD4%28%2B%29+T+cells+is+dependent+on+integrin+%CE%B1v%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inflammation-induced interstitial migration of effector CD4(+) T cells is dependent on integrin αv.</a> Nat Immunol. 14 (9), 949-958 (2013).</li>
</ol>

Los autores declaran que toda la investigación y la preparación del manuscrito se llevaron a cabo en ausencia de relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un posible conflicto de intereses.

Comprender el impacto biológico de las señales convergentes in vivo es un desafío y no es fácil de interpretar. Los protocolos presentados en este documento proporcionan un método razonable para comprender la migración de células T en condiciones altamente definidas y biológicamente relevantes. Estas condiciones se pueden especificar según la discreción del investigador, y los protocolos se pueden modificar para adaptarse a las necesidades de varias poblaciones de células T, el estado de activación y el fenotipo de la célula. Además, muchos ligandos y receptores pueden ser interrogados a través de estos procedimientos definidos de bloqueo de anticuerpos 7,8 y de vidrio recubierto de ligandos 8,9,10. Esta técnica también ha sido una plataforma crítica para el desarrollo de células inmunitarias modificadas11,12.
Los pasos importantes del protocolo incluyen el aislamiento del tejido linfoide secundario, la activación de las células T, el recubrimiento de las placas de imagen de vidrio y el análisis de datos. Para el ojo inexperto, los ganglios linfáticos incrustados en el tejido pueden ser difíciles de identificar y extraer. Esto se puede superar con la práctica. Una vez que las células T se han aislado y purificado, la etapa de activación da como resultado células pegajosas que, si no se levantan correctamente, pueden resultar en un bajo rendimiento. Esto se puede evitar con un lavado generoso y cuidadoso de los pozos. Los platos de vidrio deben estar debidamente recubiertos con el ligando de interés y lavados antes de la adición de células. Esto asegurará que haya una capa robusta de proteína disponible para que las células se adhieran, al tiempo que garantiza que el exceso de reactivo no interrumpa la biología. La unión superficial de la proteína A-vidrio y la unión de la proteína Fc-A en el pH fisiológico y la concentración de sal son lo suficientemente fuertes como para resistir el lavado al verter y decantar suavemente el tampón. Las proteínas residuales, si las hay, en el medio no causan ninguna toxicidad, aunque podrían perturbar la interacción celular con los ligandos unidos si los no unidos están en altas concentraciones. Descartamos esta posibilidad enjuagando el vidrio recubierto un par de veces. Por último, existen muchos programas informáticos comerciales y no comerciales fáciles de usar que permiten a los investigadores detectar incluso diferencias sutiles en los comportamientos y morfologías celulares. No se puede exagerar la importancia de asegurar los resultados analizados manualmente para excluir los errores que podría cometer el software.
Los métodos para la purificación y activación de células T pueden modificarse para adaptarse a las necesidades del investigador para obtener el estado celular y el fenotipo adecuados para recapitular las observaciones in vivo. Se pueden utilizar varios tipos y estados celulares para abordar diferentes mecanismos de infección y respuesta inmune 7,8,9,10,11,13, incluido el abordaje del comportamiento de las células T ingenuas y de memoria y varios aspectos de la respuesta de memoria, como el cebado y el reclutamiento, en condiciones específicas de tejido14. Este método se puede utilizar para el cocultivo con diferentes tipos de células para comprender mejor las interacciones celulares, incluidos los tiempos y la duración del contacto entre células 7,9, la presentación de antígenos 9,13 y la destrucción de células diana6. Se pueden utilizar indicadores y etiquetas adicionales para evaluar las estructuras subcelulares7, gránulos15, apoptosis6 y más.
El protocolo es una excelente herramienta para guiar experimentos in vivo adicionales basados en observaciones en condiciones simplificadas y altamente definidas. Si bien la evaluación in vitro de la motilidad celular puede ser altamente reductora, es un paso importante para descomponer las actividades biológicas complejas. Con los resultados de estos experimentos, los investigadores pueden abordar el trabajo in vivo de una manera más fisiológicamente relevante y específica.
La simplicidad de este método también representa su mayor limitación; Aunque representativos de las actividades in vivo, todos los resultados pueden confirmarse aún más utilizando la microscopía multifotónica intravital, por ejemplo. El método descrito en este documento es uno de los más simples que está completamente disponible para los laboratorios de investigación con un microscopio de campo claro y/o un microscopio de epifluorescencia con una cámara digital integrada en el sistema de microscopio o colocada por separado en el objetivo del endoscopio. Por otro lado, hay más opciones para el análisis avanzado de la migración de células inmunitarias in vitro. En primer lugar, las células inmunitarias a menudo son impulsadas por gradientes de quimiocinas en el sistema biológico. El análisis del comportamiento de las células inmunitarias bajo gradientes de quimiocinas se puede lograr de varias maneras. Un método simple es usar un portaobjetos especialmente diseñado (ver Tabla de Materiales). Este sistema de pozos canalizados, cuando su parte inferior está recubierta con ligandos de integrinas, permite el análisis de la migración de células inmunitarias bajo un gradiente de quimiocinas estático. Otros ensayos sencillos para la quimiotaxis de células inmunitarias incluyen la microscopía de lapso de tiempo de la migración celular a una punta de micropipeta que libera quimiocinas16, bajo el ensayo de agarosa17 y la cámara de Zigmond18. Para ensayos de migración más sofisticados bajo gradientes de quimiocinas controlados, se requieren portaobjetos personalizados con generadores de gradientes microfluídicos19,20. En segundo lugar, las células inmunitarias pueden migrar en condiciones físicas únicas utilizando diferentes mecanismos, a veces sin utilizar la adhesión dependiente de integrinas a los ligandos. El ensayo de migración in vitro en una dimensión se puede realizar con o sin recubrimiento de ligando de integrina y reproduce la motilidad de las células inmunitarias en los vasos capilares21,22. Otra opción es el ensayo de migración celular en el espacio tridimensional23,24 para investigar los mecanismos subyacentes a la migración intersticial de las células25,26. En general, hemos esbozado métodos simples, reproducibles y confiables para estudiar los eventos dinámicos de migración celular.

Las células T son los principales efectores de la respuesta inmunitaria adaptativa específica de antígeno. A nivel poblacional, las células T son heterogéneas, compuestas por subconjuntos celulares con distintas funciones especializadas. Es importante destacar que los linfocitos T CD8+ son los principales efectores citolíticos del sistema inmunitario, que eliminan directamentelas células infectadas o disfuncionales.
Las células T CD8+ maduras residen en el tejido y circulan a través de la sangre y los vasos linfáticos en busca de antígenos. Durante la infección, las células T se presentan con antígenos en la sangre o el tejido y drenan rápidamente al bazo o al ganglio linfático de drenaje más cercano para comenzar una respuesta inmunitaria productiva. En cualquier caso, las células T se activan, experimentan una expansión clonal y abandonan el sistema linfático para ingresar a la sangre, si aún no están allí. Durante este proceso, la señalización intracelular confiere la regulación a la baja de los receptores linfáticos y la regulación al alza de numerosos receptores de integrinas y quimiocinas esenciales para la migración específica del tejido2. En última instancia, la migración dirigida de las células T a los sitios de infección está impulsada por señales ambientales convergentes que incluyen la señalización de integrinas y quimiocinas.
Las quimiocinas se pueden clasificar en dos clases principales: (1) señales homeostáticas, que son esenciales para la diferenciación, la supervivencia y la función basal, y (2) señales inflamatorias, como CXCL9, CXCL10 y CCL3, que son necesarias para la quimiotaxis. Generalmente, las quimiocinas crean un gradiente de señal que impulsa la migración direccional, conocida como quimiotaxis, además de activar la expresión de integrinas1. La quimiotaxis está finamente regulada y es altamente sensible, con células T capaces de responder a pequeños cambios en el gradiente que pueden llevarlas hacia una dirección o ubicación específica.
Además de estos factores relacionados con las células T, la migración también se ve afectada por la composición y la densidad de la matriz extracelular (MEC). La MEC está formada por una densa red de proteínas, entre las que se incluyen el colágeno y los proteoglicanos, que proporcionan el andamiaje para los receptores de integrinas adhesivas en las células T. Las integrinas son una familia diversa de proteínas transmembrana, cada una con dominios de unión altamente especializados y efectos de señalización posteriores. La expresión dinámica de los receptores de integrinas en la superficie de una célula T permite una rápida adaptación a sus entornos cambiantes3. Es importante destacar que las integrinas conectan la MEC y las redes de actina del citoesqueleto intracelular que trabajan juntas para generar la fuerza propulsora necesaria para el movimiento de las células T.
En resumen, los patrones de migración varían en función del fenotipo de las células inmunitarias o de las señales ambientales. Estos complejos procesos biológicos están estrechamente regulados por la expresión de citocinas, quimiocinas e integrinas en la superficie de la célula T, las células circundantes y el tejido local infectado. In vivo, estos mecanismos migratorios pueden ser complejos y pueden ser el resultado de varias señales aditivas4. Debido a esta complejidad, puede ser imposible establecer una relación causal entre variables aparentemente entrelazadas. Para superar esto, existen varios enfoques in vitro para estudiar aspectos específicos de la migración de células T, como la respuesta a señales específicas de quimiocinas y la interacción entre las integrinas de células T y las proteínas de unión a la MEC. Este protocolo aborda métodos para aislar y activar células T CD8+ murinas, con ensayos de migración in vitro en espacio bidimensional y herramientas de análisis computacional para analizar la migración de células T especificadas. Estos métodos son ventajosos para el usuario porque no requieren materiales o dispositivos sofisticados, como ocurre con algunos otros ensayos de migración celular descritos en la literatura. Los datos de migración celular generados con estos métodos pueden proporcionar evidencia de respuestas inmunitarias de una manera simplista que permite una investigación más profunda e informada in vivo.

<table><tbody><tr><td>Plato de 10 cm</td><td>Corning</td><td>353003</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Tubo cónico de 15</td><td>mL ThermoFisher</td><td>339650</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>1x DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td>sin calcio y sin magnesio</td></tr><tr><td>Placa de 6 pocillos no tratada con TC</td><td>Corning</td><td>3736</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>70 &micro; Filtro de células</td><td>FisherScientific</td><td>352350</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Tampón de lisado ACK</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>A1049201 o equivalente</td></tr><tr><td>Centrífuga Allegra 6KR</td><td>ThermoScientific</td><td>sorvall 16R con rotor TX400 3655 y cucharón</td> o <td>equivalente</td></tr><tr><td>Beta mercaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>CellTrace Violet</td><td>ThermoFisher</td><td>C34571</td><td>O equivalente</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>ThermoScientific</td><td>Sorvall ST 16R</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Colágeno (IV)</td><td>Corning</td><td></td><td>354233 o</td></tr><tr><td>equivalente Placa de cultivo DeltaT de .17 mm de espesor vidrio transparente</td><td>Bioptechs</td><td>04200417C</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Ovejas anti-Rata IgG</td><td>Invitrogen</td><td>11035</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag 15 Imán</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12301D</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Kit de aislamiento de células T Easy sep</td> mouse <td>Stem Cell</td><td>19851</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>SigmaAldrich</td><td>F2442-500ML</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>SigmaAldrich</td><td>10838039001</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Fiji</td><td></td><td>http://fiji.sc/</td> <td>weblink</td></tr><tr><td>Cubos de filtro</td><td>Nikon u Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GK1.5</td><td>ATCC</td><td>TIB-207</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>ThermoFisher</td><td>15630080</td><td>o cámara</td></tr><tr><td>CCD HQ</td> equivalente CoolSNAP <td>o equivalente</td><td>ImageJ</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>http://imagej.nih.gov/ij/h</td><td>enlace web</td></tr><tr><td>ImageJ complemento</td><td></td> de seguimiento automático <td>en http://imagej.net/TrackMate</td><td>enlace web</td></tr><tr><td>Seguimiento manual de ImageJ enchufe https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html</td><td></td><td></td><td>enlace web</td></tr><tr><td>L-15</td><td>Varios</td><td>Ver Materiales</td><td>Medio Receta: Leibovitz' s Medio L-15 sin rojo fenol (Gibco) suplementado con 1-5 g/L</td></tr><tr><td>de glucosa Medio L-15 de Liebovitz, sin rojo fenol</td><td></td> Jeringa desechable ThermoFisher <td>21083027</td><td></td></tr><tr><td>Luer Lok</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-459</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Medio de separación de linfocitos</td><td>Corning</td><td>25-072-CI</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>M5/114</td><td>ATCC</td><td>TIB-120</td><td></td></tr><tr><td>MEM Aminoácidos no esenciales</td><td>ThermoFisher</td><td>11140050</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Sistema de calentamiento de microscopio</td><td>Okolab</td><td>okolab.com</td><td>Diseños personalizados disponibles</td></tr><tr><td>Diapositiva Millicell EZ</td><td>Millipore</td><td>C86024</td><td></td></tr><tr><td>Mojosort ratón CD8+ Na&iuml; kit de aislamiento de células T</td><td>Biolegend</td><td>480043</td><td></td></tr><tr><td>Mouse E-cadherin</td><td>R& Sistemas D</td><td>8875-EC-050</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Kit de disección quirúrgica de ratón</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-820-096</td><td>o elementos</td></tr><tr><td>NIS</td> equivalentes <td>Nikon</td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td>no TC 24wp</td><td>Corning</td><td>353047</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Proteína A</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>R9</td><td>Varios Ver</td><td>Materiales</td><td>Medio Receta: RPMI 1640x suplementado con 10 % FBS, 1 % antibiótico-antimicótico (Gibco), 20 mM de tampón HEPES (Gibco), 1 % de MEM Aminoácidos no esenciales (Gibco), 50 &mu; M &beta;-mercaptoetanol (Sigma-Aldrich)</td></tr><tr><td>Ratón recombinante ICAM-1 Fc quimera</td><td>R& Sistemas D</td><td>796-IC-050</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Ratón recombinante IL2</td><td>Biolegend</td><td>575410</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>RPMI 1640x</td><td>ThermoFisher</td><td>11875093</td><td>o pines T equivalentes</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>S99385</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Microscopio TE2000-U</td><td>Nikon</td><td></td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Varios quimiocinas recombinantes de ratón</td><td>R& Sistemas D</td><td></td><td>o equivalentes</td></tr><tr><td>VCAM-1 Fc quimera</td><td>R& D systems</td><td>643-VM-050</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Volocity</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Software</td></tr></tbody></table>

ensayo de migración in vitro en tiempo real para linfocitos t murinos cd8+ primarios

Real-Time In Vitro Migration Assay for Primary Murine CD8+ T Cells

La respuesta inmunitaria adaptativa depende de la capacidad de una célula T para migrar a través de la sangre, la linfa y los tejidos en respuesta a patógenos y cuerpos extraños. La migración de células T es un proceso complejo que requiere la coordinación de muchas entradas de señales del medio ambiente y de las células inmunitarias locales, incluidas las quimiocinas, los receptores de quimiocinas y las moléculas de adhesión. Además, la motilidad de las células T está influenciada por las señales ambientales dinámicas circundantes, que pueden alterar el estado de activación, el paisaje transcripcional, la expresión de la molécula de adhesión y más. In vivo, la complejidad de estos factores aparentemente entrelazados hace que sea difícil distinguir las señales individuales que contribuyen a la migración de las células T. Este protocolo proporciona una serie de métodos, desde el aislamiento de células T hasta el análisis asistido por computadora, para evaluar la migración de células T en tiempo real en condiciones ambientales altamente específicas. Estas condiciones pueden ayudar a dilucidar los mecanismos que regulan la migración, mejorando nuestra comprensión de la cinética de las células T y proporcionando una fuerte evidencia mecanicista que es difícil de lograr a través de experimentos con animales. Una comprensión más profunda de las interacciones moleculares que afectan la migración celular es importante para desarrollar terapias mejoradas.

La confirmación de la activación de los linfocitos T se puede lograr mediante citometría de flujo, buscando un aumento de la expresión de CD69 y CD44, que son marcadores canónicos de activación en los linfocitos T murinos6. Además, la pureza de la población de células T se puede determinar mediante citometría de flujo para células T CD3+ CD8+ . Este método produce una población de linfocitos T CD8+ del &gt;90 %.
La migración de células T se puede evaluar con programas de seguimiento celular asistidos por software que son reproducibles y ajustables para adaptarse a las necesidades del investigador. Algunos parámetros básicos utilizados para determinar los efectos experimentales incluyen la velocidad celular (longitud de la migración por un tiempo determinado para determinar qué tan rápido se mueve una célula), el desplazamiento (distancia de migración, una línea recta desde el punto de inicio hasta el punto final, para determinar qué tan lejos migra una célula), la longitud de la pista (la distancia de migración, la longitud total de la ruta de migración, para determinar qué tan lejos migra una célula), y el índice de meandros (el IM está entre 0 y 1 para determinar la rectitud de la migración, 1 = recto). Estos parámetros se emplean para evaluar las diferencias migratorias en las células T CD8+ naïve y activadas que se arrastran a lo largo del vidrio recubierto con ICAM-1 con CXCL12 (Figura 1). Se observó un aumento de la velocidad media, el desplazamiento y el índice de meandros en los linfocitos T CD8+ activados en comparación con los naïve, lo que indica que los linfocitos T activados tienen una mayor capacidad de migración. Del mismo modo, con estos métodos se puede dilucidar el impacto de diferentes quimiocinas en los patrones de migración celular. Por ejemplo, las células T CD8+ activadas exhiben una mayor migración en presencia de CXCL12, pero no de CCL2 o CCL22, y la migración aumenta de manera dependiente de la dosis a una concentración saturante (Figura 2). Además, el seguimiento celular asistido por software permite la caracterización de la migración celular individual, lo que permite comprender los efectos de los ligandos individuales en el comportamiento de las células T. En la Figura 3 se pueden ver rastros representativos de las células.
Tomados en conjunto, estos datos respaldan la eficacia de los métodos actuales al confirmar que podemos (1) rastrear la migración celular sobre una base de células individuales, y (2) distinguir las diferencias en la migración de las células T CD8+ en función del estado de activación y en presencia de diferentes quimiocinas y moléculas de adhesión. Este ensayo es un paso crítico en la disección de mecanismos de señalización complejos e informar experimentos in vivo enfocados que pueden abordar aún más las contribuciones biológicas de señales específicas de una manera específica para el tipo de célula.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66580/66580fig01.jpg"> Figura 1: Ensayos in vitro para la migración de linfocitos T CD8+ vírgenes y activados. Se permitió que las células T CD8+ de ratón naïve o activadas por CD3/ CD28 migraran en ICAM-1 más CXCL12 durante 10 min. La velocidad, el desplazamiento y el índice de meandros de la migración celular se analizaron mediante microscopía de lapso de tiempo y Volocity. Cada grupo tiene 36 células T individuales (media ± SEM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66580/66580fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66580/66580fig02.jpg"> Figura 2: Ensayos in vitro para la migración dependiente de quimiocinas de células T CD8+ activadas. Se permitió que las células T CD8+ de ratón activadas por CD3/CD28 migraran en ICAM-1 más una quimiocina indicada. Las proporciones del número de células que se arrastran más de 50 μm durante 20 min (porcentaje del total) se determinaron en un campo de visión. Un solo ensayo analizó &gt;10 células (n = 3 ensayos por grupo media ± SEM). Prueba t no apareada, *p&lt; 0,05 en comparación con el control. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66580/66580fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66580/66580fig03.jpg"> Figura 3: Huellas migratorias de linfocitos T CD8+ activados en ICAM-1 más CXCL12 durante 20 min. Cada línea de color indica la trayectoria migratoria de cada célula T en una dirección desde el punto de la célula hasta el opuesto. En este ensayo en particular, 24 de las 38 células migraron en una longitud significativa (al menos la distancia de su ancho de celda según nuestra definición). Las células T migraron en diferentes longitudes de distancia, lo que indica que cada célula estaba en un estado diferente de activación o cebado. Todas las células migratorias se movían en diferentes direcciones bajo la condición de que la superficie estuviera cubierta uniformemente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66580/66580fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Este protocolo proporciona un método de aislamiento primario de células T murinas y microscopía de lapso de tiempo de la migración de células T en condiciones ambientales específicas con análisis cuantitativo.

Ensayo de migración in vitro en tiempo real para linfocitos T murinos CD8+ primarios

The adaptive immune response is reliant on a T cell&#39;s ability to migrate through blood, lymph, and tissue&#160;in response to pathogens and foreign ...

El objetivo de nuestra investigación es comprender los patrones de migración de las células T en condiciones ambientales altamente definidas para permitir la experimentación in vitro informada y descifrar las interacciones moleculares que afectan la migración. Las imágenes en vivo, como la microscopía multifotónica intravital, se utilizan para la comprensión in vivo de la cinética de las células inmunitarias. Pero los dispositivos microfluídicos son una herramienta in vitro común que ofrece un control preciso sobre el microambiente que no se puede permitir en un espécimen vivo.Nuestro protocolo nos permite analizar intrincadas vías de señalización y proporciona una mejor comprensión de los experimentos in vitro dirigidos para abordar aún más las funciones biológicas de las señales individuales de una manera específica para el tipo de célula. Nuestro método es simple, reproducible y de fácil acceso en laboratorios de investigación que tienen un microscopio de campo claro con una cámara digital conectada. Por lo tanto, nuestro enfoque garantiza un conjunto confiable de métodos para estudiar los eventos dinámicos de migración celular.Nuestro laboratorio se centrará en investigar la migración de las células inmunitarias, incluidas las células T y los neutrófilos, en una variedad de entornos de enfermedades, como tumores e infecciones, comprendiendo así los mecanismos que son importantes para regular la migración de las células inmunitarias. Esto ayudará a desarrollar los métodos terapéuticos para ayudar a tratar y prevenir enfermedades.

real-time-in-vitro-migration-assay-for-primary-murine-cd8-t-cells

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

La migración de los linfocitos T se produce durante la recalada de los órganos linfoides, la salida de la vasculatura, y entrar en los tejidos periféricos. Aquí se describe un protocolo que se puede utilizar para analizar la migración de los linfocitos...

Aislamiento de linfocitos T humanos, cultura y análisis de la migración In Vitro</em

Competitiva experimentos homing permiten la evaluación directa de las propiedades migratorias de dos poblaciones diferentes de células en un ratón. Aquí se ilustra este procedimiento mediante la comparación de la migración de los ex vivo generado intestino tropicales versus no-gut células T trópico.

Los análisis competitivos de Homing para el Estudio de la tripa-trópico migración de células T

Este video describe las imágenes de las células T CD8 residentes infiltrantes de tumores marcadas con anticuerpos acoplados fluorescentemente dentro de cortes de tumores de pulmón humanos. Esta técnica permite analizar en tiempo real la migración de linfocitos T CD8 mediante microscopía confocal.

Análisis en tiempo real de la migración de células T residentes en diferentes regiones tumorales mediante microscopía confocal

De uso general, se describen métodos muy accesibles para el examen de la migración celular y la invasión in vitro. El primer método es el ensayo de cierre de la herida de células que mide la motilidad celular. El segundo método es la migración y la invasión de ensayo Transwell que evalúa la quimiotaxis y la capacidad invasiva de las células.

En la migración celular y la invasión ensayos in vitro

Un método cuantitativo para estudiar la migración espontánea de las células en un microambiente confinado unidimensional se describe. Este método tiene la ventaja de canales microfabricados y se puede utilizar para estudiar la migración de gran número de células bajo diferentes condiciones en los experimentos individuales.

Estudio de la Migración celular en Canales Microfabricated

Los mecanismos que regulan la motilidad intersticial de las células T CD4 efectoras en sitios de inflamación son relativamente desconocidos. Se presenta un enfoque no invasivo para visualizar y manipular en las células T CD4 in vitro -primed en la dermis para los oídos inflamados, lo que permite el estudio del comportamiento dinámico de estas células in situ.

La migración de células T CD4 obtener imágenes intersticial en la dermis inflamadas

Protocolos para la evaluación cuantitativa de la migración y Quimiotaxis de linfocitos son herramientas importantes para la investigación de la inmunología. Aquí, se describe un protocolo en vitro que permite en tiempo real, multiplexado evaluación de migración celular, así como un complementario en vivo técnica que permite seguimiento de células nativas del bazo.

Cuantificación de la Quimiotaxis de monocitos humanos In Vitro y linfocitos murinos, tráfico en Vivo

Describimos aquí un protocolo para investigar la citotoxicidad de CD8 pre-activado+ T las células contra las células cancerosas mediante la detección de apoptosis cáncer células vía en tiempo real la microscopia. Este protocolo puede investigar los mecanismos detrás de la supresión de la célula de T inducida por la célula mieloide y evaluar compuestos destinados a reposición de T las células vía bloqueo de células mieloides supresores inmunes.

Tiempo real detección de Vitro Tumor de la célula apoptosis inducida por CD8+ T las células para el estudio de las funciones inmunológicas de supresores de Tumor infiltrante de células mieloides

En este protocolo, los linfocitos se colocan en la cámara superior de un sistema de transmigración, separados de la cámara inferior por una membrana porosa. La quimiocina se añade a la cámara inferior, lo que induce la migración activa a lo largo de un gradiente de quimiocina. Después de 48 h, los linfocitos se cuentan en ambas cámaras para cuantificar la transmigración.

Evaluación de la migración de linfocitos en un sistema de transmigración ex Vivo

Aquí, presentamos un protocolo de trasplante tumoral para la caracterización de linfocitos infiltrados tumorales inherentes y derivados de la periferia en un modelo de tumor de ratón. El rastreo específico de la afluencia de células inmunes derivadas del receptor con citometría de flujo revela la dinámica de los cambios fenotípicos y funcionales de estas células durante las respuestas inmunes antitumorales.

Trasplante de tumores para evaluar la dinámica de las células T CD8+ infiltrantes de tumores en ratones

Aquí, detallamos un protocolo simple, rápido y confiable de citometría de flujo multiparamétrica y asistida por tumores en un chip para monitorear y caracterizar los pasos que constituyen el ciclo de inmunidad al cáncer. De hecho, una comprensión profunda de las interacciones entre el cáncer y las células inmunitarias proporciona información crítica para burlar a los tumores y guiar la atención clínica.

Cocultivo de sistemas in vitro para reproducir el ciclo cáncer-inmunidad

Aprende a realizar ensayos de migración in vitro en tiempo real para linfocitos T CD8+ murinos primarios mediante microscopía de lapso temporal. Este protocolo permite analizar dinámicas celulares y vías de señalización con precisión.

Ensayo de migración in vitro en tiempo real para linfocitos T murinos CD8+ primarios

Explorar más videos