Name: Detección de la interacción proteína-umbeliferona CD40 mediante fluorescencia diferencial de barrido (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-01T14:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: Aprende a detectar la interacción entre umbeliferona y proteína CD40 mediante fluorescencia diferencial de barrido. Este protocolo simplificado minimiza la pérdida de muestra y no requiere equipo especializado para estudios inmunológicos.

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Expresamos nuestro sincero agradecimiento por el apoyo financiero recibido del Proyecto de Construcción de la Connotación del 14º Plan Quinquenal de la Universidad de Medicina Tibetana (2022ZYYGH12), las Materias Abiertas 2022 del Laboratorio Clave de Medicina Tibetana y Educación Básica del Ministerio de Educación de la Universidad de Medicina Tibetana (ZYYJC-22-04), el Programa Clave de Investigación y Desarrollo de Ningxia (2023BEG02012), y el Proyecto de Promoción de la Investigación Xinglin Scholar de la Universidad de Medicina Tradicional China de Chengdu (XKTD2022013).

La solución compuesta, la solución proteica y el colorante se introdujeron en una solución de PBS. Posteriormente, las muestras se sometieron a un calentamiento gradual utilizando un baño seco de agitación de calentamiento digital, y se evaluó la estabilidad térmica de las proteínas midiendo el cambio en la intensidad de la fluorescencia dentro del complejo sistema. Los pasos detallados se describen a continuación, y la Figura 1 ilustra una descripción general del protocolo.
1. Preparación de la solución
<ol><li>Prepare una solución de umbeliferona de 1 mM añadiendo 0,1 mg de umbeliferona a 616,75 μL de solución de DMSO (ver Tabla de Materiales).</li>
	<li>Prepare una solución de proteína CD40 de 200 μg/mL añadiendo 0,1 mg de CD40 a 500 μL de solución ddH2O (ver Tabla de Materiales).</li>
	<li>Prepare una solución de colorante naranja 500x agregando 1 μL de colorante naranja 5000x a 9 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) (consulte la Tabla de materiales). NOTA: Realice las operaciones anteriores con hielo, y dado que la pipeta tiene un rango mínimo de 0,1 μL, diluya inicialmente el colorante proteico de naranja en un factor de 10 para facilitar su uso posterior.</li>
</ol>2. Pruebas de rendimiento del tinte
<ol><li>Agregue el tinte naranja 500x a una solución de PBS y dilúyalo para obtener proporciones de tinte: PBS de 1:500, 1:1000, 1:2000 y 1:4000. NOTA: Asegúrese de que la concentración final de DMSO no exceda el 2% (v/v).</li>
	<li>Encienda el lector de microplacas fluorescentes y precaliéntelo durante 10 min.</li>
	<li>Abra el ordenador y el software de adquisición de datos en secuencia (consulte la Tabla de materiales).</li>
	<li>Haga clic en Instrumento, elija el modelo de microplaca de fluorescencia correspondiente y seleccione OK en el software de adquisición de datos. NOTA: Espere a que la microplaca de fluorescencia termine de precalentarse y muestre la temperatura en el panel antes de abrir el software de adquisición de datos para garantizar una conexión exitosa entre el instrumento y el software.</li>
	<li>Haga clic en Configuración de adquisición y seleccione Fluorescencia en el software de adquisición de datos.</li>
	<li>Edite el programa en la interfaz Longitudes de onda : Lm1 = 470 nm, 570 nm y, a continuación, seleccione Aceptar. NOTA: El tinte naranja se puede excitar con luz ultravioleta a 300 nm o luz visible a 470 nm, y la emisión se puede medir a 570 nm.</li>
	<li>Agregue diferentes concentraciones de colorante naranja (1:500, 1:1000, 1:2000 y 1:4000) y PBS a placas de 96 pocillos a 100 μL/pocillo. NOTA: Disuelva la solución en DMSO antes de agregarla al PBS, y vértice a 2000 x g completamente durante el proceso de preparación para asegurar la disolución completa debido a la tendencia del tinte a precipitar.</li>
	<li>Coloque la placa de 96 pocillos en la etapa de detección del instrumento, haga clic en el botón Leer en el software de adquisición de datos y mida la fluorescencia de cada concentración de colorante 13 veces a temperatura ambiente, con un intervalo de 2 minutos cada vez.</li>
	<li>Haga clic en el botón Exportar después de cada determinación, seleccione Exportar a XML XLS TXT, elija Todas las placas, luego seleccione Placa en formato de salida y, finalmente, haga clic en Aceptar para guardar los datos en una carpeta en formato "XLS" para un análisis más detallado. NOTA: Estos pasos ayudan a determinar el impacto de la medición continua en la autofluorescencia del tinte naranja a temperatura ambiente e identificar la concentración óptima de tinción.</li>
	<li>Encienda el baño seco de agitación de calefacción digital, ajuste la temperatura de calentamiento a 35 °C y el tiempo de calentamiento a 2 min.</li>
	<li>Prepare la proporción óptima de dilución del colorante en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y colóquelo en el baño seco de agitación de calentamiento digital durante 2 minutos.</li>
	<li>Añada la solución de PBS y la solución de tinción, calentada a 35 °C, a la placa de 96 pocillos a un volumen de 100 μL por pocillo.</li>
	<li>Coloque la placa de 96 pocillos en la etapa de detección del instrumento y haga clic en el botón Leer en el software de adquisición de datos.</li>
	<li>Ajuste la temperatura de calentamiento a 40 °C y el tiempo de calentamiento a 2 min.</li>
	<li>Pipetee la solución de colorante en la placa de 96 pocillos nuevamente en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y caliéntelo en el instrumento durante 2 minutos.</li>
	<li>Repita las operaciones de los pasos 2.12-2.15 y 2.9 para probar la absorbancia de la solución de colorante a 35 °C, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C y 95 °C, respectivamente. NOTA: Estos pasos ayudan a determinar la estabilidad de la autofluorescencia del tinte naranja bajo calentamiento continuo en un gradiente de 35 °C a 95 °C. Es crucial trabajar con rapidez para evitar caídas rápidas de temperatura o agregar el líquido incorrecto, lo que podría conducir a errores experimentales.</li>
</ol>3. Detección de la temperatura de fusión (Tm) de la proteína
<ol><li>Combine la proteína CD40 y el colorante de naranja con la solución de PBS para lograr concentraciones finales de 5 μg/mL, 10 μg/mL, 15 μg/mL, 20 μg/mL y 1:500, respectivamente.</li>
	<li>Repita las operaciones descritas en los pasos 2.2-2.6 y 2.10-2.16 para evaluar la absorbancia de la solución de proteína CD40 a temperaturas de 35 °C, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C y 95 °C, respectivamente.</li>
	<li>Repita el paso 2.9 para guardar y analizar los datos, y posteriormente calcular el valor de Tm utilizando un software de análisis de datos (ver Tabla de Materiales).</li>
	<li>Agregue proteína CD40, umbeliferona y colorante naranja a la solución de PBS para obtener concentraciones finales de 5 μg/mL, 10 μg/mL, 15 μg/mL, 20 μg/mL, 10 μM y 1:500, respectivamente. NOTA: El vórtice vigoroso durante la preparación de la solución es esencial para asegurar una distribución uniforme del colorante, la proteína CD40 y la umbeliferona en PBS.</li>
	<li>Repita las operaciones de los pasos 3.2-3.3 para medir la absorbancia de la solución de complejos CD40-umbeliferona a temperaturas de 35 °C, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C y 95 °C, respectivamente. NOTA: Estos pasos se llevaron a cabo para determinar los valores de Tm de la proteína CD40 y los complejos CD40-umbeliferona, con el objetivo de identificar la concentración óptima de unión de la proteína CD40 a la umbeliferona.</li>
</ol>

Detección de alta sensibilidad de la unión de proteínas compuestas mediante fluorescencia

<ol><li>Cairang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+on+the+standardization+of+clinical+application+of+Tibetan+medicine+%26%2334%3Bfive+roots%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22Guid+J+Trad+Chin+Med+Pharm%22%5BJournal%5D)">Study on the standardization of clinical application of Tibetan medicine &#34;five roots&#34.</a> Guid J Trad Chin Med Pharm. 28 (11), 133136(2022).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Xigui+extract+on+immunosuppressive+mice+induced+by+cyclophosphamide%5BTitle%5D)+AND+%22Chin+J+Hosp+Pharm%22%5BJournal%5D)">Effects of Xigui extract on immunosuppressive mice induced by cyclophosphamide.</a> Chin J Hosp Pharm. 37 (03), 244-247 (2017).</li>
<li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Vicatia+thibertica+de+boiss+on+immunologic+and+hematopoietic+function+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dali+Univ%22%5BJournal%5D)">Effects of Vicatia thibertica de boiss on immunologic and hematopoietic function of mice.</a> J Dali Univ. 2 (02), 6-10 (2017).</li>
<li>Dong, S., Zhang, X., Hu, Y., Gong, X., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+constituents%2C+quality+control+and+pharmacology+research+progress+of+Xigui%5BTitle%5D)+AND+%22Chin+J+Ethnomed+Ethnopharm%22%5BJournal%5D)">Chemical constituents, quality control and pharmacology research progress of Xigui.</a> Chin J Ethnomed Ethnopharm. 27 (13), 40-42 (2018).</li>
<li>Lu, Z., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+total+flavone+extract+from+Shuiqin+%28Oenanthe+Javanica%29+on+immune+function+of+immunosuppression+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Chin+J+Trad+Med+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">Effects of total flavone extract from Shuiqin (Oenanthe Javanica) on immune function of immunosuppression mice.</a> Chin J Trad Med Sci Technol. 23 (04), 423-425 (2016).</li>
<li>Vonderheide, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40+agonist+antibodies+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Med%22%5BJournal%5D)">CD40 agonist antibodies in cancer immunotherapy.</a> Annu Rev Med. 71, 47-58 (2020).</li>
<li>Grewal, I. S., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40+and+CD154+in+cell-mediated+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD40 and CD154 in cell-mediated immunity.</a> Annu Rev Immunol. 16, 111-135 (1998).</li>
<li>Long, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN%CE%B3+and+CCL2+cooperate+to+redirect+tumor-infiltrating+monocytes+to+degrade+fibrosis+and+enhance+chemotherapy+efficacy+in+pancreatic+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">IFNγ and CCL2 cooperate to redirect tumor-infiltrating monocytes to degrade fibrosis and enhance chemotherapy efficacy in pancreatic carcinoma.</a> Cancer Discov. 6 (4), 400-413 (2016).</li>
<li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+regulatory+B+cells+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Res%22%5BJournal%5D)">The roles of regulatory B cells in cancer.</a> J Immunol Res. 2014, 215471(2014).</li>
<li>Eliopoulos, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40+induces+apoptosis+in+carcinoma+cells+through+activation+of+cytotoxic+ligands+of+the+tumor+necrosis+factor+superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">CD40 induces apoptosis in carcinoma cells through activation of cytotoxic ligands of the tumor necrosis factor superfamily.</a> Mol Cell Biol. 20 (15), 5503-5515 (2000).</li>
<li>Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+differential+scanning+fluorimetry+to+detect+ligand+interactions+that+promote+protein+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability.</a> Nat Protoc. 2 (9), 2212-2221 (2007).</li>
<li>Rosa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meltdown%3A+A+Tool+to+help+in+the+interpretation+of+thermal+melt+curves+acquired+by+differential+scanning+fluorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">Meltdown: A Tool to help in the interpretation of thermal melt curves acquired by differential scanning fluorimetry.</a> J Biomol Screen. 20 (7), 898-905 (2015).</li>
<li>Hellman, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+scanning+fluorimetry+based+assessments+of+the+thermal+and+kinetic+stability+of+peptide-MHC+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Differential scanning fluorimetry based assessments of the thermal and kinetic stability of peptide-MHC complexes.</a> J Immunol Methods. 432, 95-101 (2016).</li>
<li>Pantoliano, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+miniaturized+thermal+shift+assays+as+a+general+strategy+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">High-density miniaturized thermal shift assays as a general strategy for drug discovery.</a> J Biomol Screen. 6 (6), 429-440 (2001).</li>
<li>Gorny, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+nano-differential+scanning+fluorimetry+and+microscale+thermophoresis+to+investigate+VDAC1+interaction+with+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22J+EnzymeInhib+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Combining nano-differential scanning fluorimetry and microscale thermophoresis to investigate VDAC1 interaction with small molecules.</a> J EnzymeInhib Med Chem. 38 (1), 2121821(2023).</li>
<li>Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+denaturation+methods+in+the+study+of+protein+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Thermal denaturation methods in the study of protein folding.</a> Methods Enzymol. 259, 144-168 (1995).</li>
<li>Phiri, M. J., Mofokeng, J. P., Phiri, M. M., Mngomezulu, M., Tywabi-Ngeva, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical%2C+thermal+and+morphological+properties+of+polybutylene+succinate-waste+pineapple+leaf+fibres+composites%5BTitle%5D)+AND+%22Heliyon%22%5BJournal%5D)">Chemical, thermal and morphological properties of polybutylene succinate-waste pineapple leaf fibres composites.</a> Heliyon. 9 (11), 21238(2023).</li>
<li>Zhou, C., Yu, M., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparation+of+three+measuring+methods+for+thermodynamic+stability+of+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Test+Technol+Instruments%22%5BJournal%5D)">Comparation of three measuring methods for thermodynamic stability of protein.</a> Anal Test Technol Instruments. 27 (04), 252-259 (2021).</li>
<li>Hou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salidroside+intensifies+mitochondrial+function+of+CoCl2-damaged+HT22+cells+by+stimulating+PI3K-AKT-MAPK+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Phytomedicine%22%5BJournal%5D)">Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway.</a> Phytomedicine. 109, 154568(2023).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salidroside%2C+a+phenyl+ethanol+glycoside+from+Rhodiola+crenulata%2C+orchestrates+hypoxic+mitochondrial+dynamics+homeostasis+by+stimulating+Sirt1%2Fp53%2FDrp1+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ethnopharmacol%22%5BJournal%5D)">Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling.</a> J Ethnopharmacol. 293, 115278(2022).</li>
<li>Magnez, R., Bailly, C., Thuru, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+thermophoresis+as+a+tool+to+study+protein+interactions+and+their+implication+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Microscale thermophoresis as a tool to study protein interactions and their implication in human diseases.</a> Int J Mol Sci. 23 (14), 7672(2022).</li>
<li>Kamat, V., Rafique, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+binding+kinetic+assay+on+the+bio-layer+interferometry+%28BLI%29+biosensor+to+characterize+antibody-antigen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Designing binding kinetic assay on the bio-layer interferometry (BLI) biosensor to characterize antibody-antigen interactions.</a> Anal Biochem. 536, 16-31 (2017).</li>
<li>Freyer, M. W., Lewis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isothermal+titration+calorimetry%3A+experimental+design%2C+data+analysis%2C+and+probing+macromolecule%2Fligand+binding+and+kinetic+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isothermal titration calorimetry: experimental design, data analysis, and probing macromolecule/ligand binding and kinetic interactions.</a> Methods Cell Biol. 84, 79-113 (2008).</li>
<li>Sharma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atosiban+and+Rutin+exhibit+anti-mycobacterial+activity+-+An+integrated+computational+and+biophysical+insight+toward+drug+repurposing+strategy+against+Mycobacterium+tuberculosis+targeting+its+essential+enzyme+HemD%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Macromol%22%5BJournal%5D)">Atosiban and Rutin exhibit anti-mycobacterial activity - An integrated computational and biophysical insight toward drug repurposing strategy against Mycobacterium tuberculosis targeting its essential enzyme HemD.</a> Int J Biol Macromol. 253, 127208(2023).</li>
<li>Grädler, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+and+structural+characterization+of+the+impacts+of+MET+phosphorylation+on+tepotinib+binding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Biophysical and structural characterization of the impacts of MET phosphorylation on tepotinib binding.</a> J Biol Chem. 299 (11), 105328(2023).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+scanning+fluorimetry+and+its+application+in+the+study+of+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+of+Life%22%5BJournal%5D)">Differential scanning fluorimetry and its application in the study of protein.</a> Chemistry of Life. 38 (03), 351-357 (2018).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El DSF, también conocido como ensayo de desplazamiento térmico o ensayo de fluorescencia térmica, es una técnica empleada para detectar el proceso de desnaturalización térmica de las proteínas en las muestras mediante el seguimiento de los cambios en la señal de fluorescencia de la muestra de prueba o del colorante durante un aumento de temperatura lento y programado. Establecido inicialmente por Pantoliano14, DSF sirve como un método de alto rendimiento. El procedimiento principal consiste en elevar la temperatura en una placa calentada controlada por computadora, emitir luz de excitación utilizando una lámpara ultravioleta de longitud de onda larga y capturar los cambios en la intensidad de la señal fluorescente resultantes de la unión de tintes fluorescentes a proteínas a través de una cámara formadora de fases con dispositivo de carga acoplada.
El valor Tm, un indicador crucial que caracteriza la estructura de nivel superior de las proteínas, representa la temperatura correspondiente a la mitad de la desnaturalización del fármaco proteico durante un aumento de temperatura. Los valores más altos de Tm sugieren un mayor requerimiento de temperatura para la desnaturalización de la proteína, lo que indica una estructura proteica más estable. El método actualmente reconocido para detectar los valores de Tm es la calorimetría diferencial de barrido (DSC), que se inició en la década de 196015. El DSC mide la diferencia de potencia entregada al objeto que se está probando y a un objeto de referencia en función de la temperatura bajo control de temperatura programado para obtener la cantidad de calor absorbido y descargado. Se erige como el estándar de oro para el análisis de estabilidad térmica16,17.
El DSF ha ganado un uso generalizado debido a tres ventajas sobre el DSC: (1) Menor consumo de muestra: el DSC generalmente requiere un volumen de muestra de 400 μL, mientras que el DSF requiere solo 20-25 μL. (2) Mayor rango de concentraciones: el DSC generalmente requiere concentraciones de proteínas de 0.2-2 mg / mL para obtener un pico de desnaturalización significativo, mientras que DSF puede analizar muestras en el rango de 0.005-200 mg / mL. (3) Mayor rendimiento de muestras: DSC puede analizar solo una muestra a la vez, mientras que DSF puede escanear simultáneamente hasta 96 o más muestras18. Debido a estas ventajas, DSF se utiliza ampliamente en el estudio de la estabilidad de las proteínas, la estructura y conformación de las proteínas, las interacciones proteína-ligando y los efectos de los estabilizadores de proteínas, inhibidores, cofactores y más.
Además de DSF y DSC, existen otras técnicas de interacción molecular. La resonancia de plasmones superficiales (SPR) es un fenómeno óptico que ocurre en la interfaz de dos medios y puede ser inducido por fotones o electrones. Implica una reflexión total cuando la luz se emite desde un medio ópticamente denso a un medio ópticamente escaso. El ángulo en el que se produce la resonancia del plasmón superficial se conoce como ángulo SPR. Los biosensores SPR utilizan cambios en los ángulos SPR para monitorear las interacciones intermoleculares en tiempo real19,20. La termoforesis a microescala (MST) es una técnica para analizar las interacciones biomoleculares mediante la detección de cambios en el tamaño, la carga y la capa de hidratación de las biomoléculas causados por la unión. Registra los cambios de fluorescencia en la región irradiada por un láser infrarrojo dentro de la muestra antes, durante y después de encender el láser, lo que permite determinaciones relativamente rápidas21. La interferometría de biocapa (BLI) mide las reacciones de la superficie del sensor mediante el seguimiento de los cambios de desplazamiento en el espectro de interferometría. En los experimentos BLI, una molécula se inmoviliza en la superficie de un sensor sumergible para detectar otra molécula que pueda unirse a ella. La interacción de unión induce el desplazamiento de la interferencia, y el monitoreo en tiempo real de este cambio de desplazamiento produce la curva de enlace22. La calorimetría de titulación isotérmica (ITC) cuantifica las interacciones biomoleculares midiendo directamente el calor liberado o absorbido durante la unión biomolecular. Proporciona información termodinámica completa sobre las interacciones moleculares23. En comparación con estas tecnologías de interacción molecular, DSF tiene requisitos más bajos para instrumentos, consumibles y técnicas operativas. Puede detectar de manera eficiente las interacciones entre compuestos y proteínas en la mayoría de los laboratorios.
El procedimiento operativo de la tecnología DSF es relativamente sencillo. Inicialmente, las muestras de materia blanca, los tampones de reacción, los tintes fluorescentes y los ligandos candidatos se combinan en un sistema de reacción. A continuación, este sistema se transfiere a un instrumento de PCR de fluorescencia donde se establecen las condiciones de calentamiento y detección para la determinación de la fluorescencia24,25. El colorante proteico más utilizado para la FSD es actualmente el colorante naranja, y el instrumento de detección suele ser un instrumento de PCR cuantitativa de fluorescencia26. Sin embargo, debido a que la longitud de onda de excitación del tinte naranja es de 470 nm y la longitud de onda de emisión es de 570 nm, no todos los instrumentos de PCR cuantitativa de fluorescencia en el mercado son una combinación perfecta. Por lo tanto, este estudio adopta un lector de microplacas fluorescentes como un nuevo instrumento de detección para explorar las interacciones proteína-ligando.
Este enfoque ofrece dos ventajas principales sobre el DSF que utiliza un instrumento de PCR cuantitativa fluorescente. En primer lugar, el rango de longitud de onda del marcador de enzima fluorescente se puede personalizar, haciéndolo más compatible con el rango de longitud de onda del colorante y asegurando una detección de fluorescencia más precisa. En segundo lugar, el programa de un instrumento de PCR cuantitativa de fluorescencia no se puede detener una vez iniciado, lo que dificulta la resolución de cualquier problema durante el proceso de calentamiento. Por el contrario, un lector de microplacas fluorescentes permite la eliminación de interferencias mediante la modificación iterativa de la relación del sistema y las condiciones de detección a lo largo del proceso de detección. Sin embargo, el uso de un lector de microplacas fluorescentes para DSF también tiene ciertas desventajas, en particular la cantidad relativamente grande de muestra requerida, que generalmente oscila entre 50 y 200 μL, mientras que la DSF tradicional generalmente utiliza 20-25 μL de muestra.
En este artículo, se llevó a cabo la validación de DSF basada en un lector de microplacas fluorescentes para la detección de Tm utilizando proteína CD40 y umbeliferona dentro del rango de concentración de 5-20 μg/mL. Los resultados demostraron la alta especificidad y precisión del método, afirmando su idoneidad para la detección de Tm. La comparación posterior de los resultados de la detección de Tm a diferentes concentraciones de muestra reveló una tendencia decreciente en el valor de Tm de la proteína CD40 a medida que aumentaba la concentración, lo que sugiere un efecto potencial de la concentración en la detección de Tm (Figura 3). Además, el estudio detectó un aumento en el valor Tm de la proteína CD40 después de la adición de umbeliferona al sistema en comparación con antes de la adición. Esto indica que la umbeliferona posee la capacidad de unirse a la proteína CD40, lo que lleva a una mejora en la estabilidad térmica de la proteína CD40 tras su combinación (Figura 3).
Los pasos críticos del protocolo se identificaron como los pasos 2.7 a 2.16, cuya finalización exitosa influye directamente en la detección posterior de la fluorescencia de proteínas. En resumen, este estudio estableció un nuevo método de detección de DSF basado en los principios de la tecnología DSF, utilizando la proteína CD40 y la umbeliferona como ejemplo. El método analizó eficazmente la fuerza de unión entre proteínas y ligandos utilizando un lector de microplacas fluorescentes. Además, esta técnica puede extenderse para el análisis de la estabilidad de las proteínas y la investigación de la estructura de las proteínas, profundizando en la aplicación de la tecnología DSF en el estudio de las vías de señalización celular y explorando la patogénesis de la enfermedad.

Vicatia thibetica H. Boissieu, una planta de la familia de los umbelíferos, se usa comúnmente en la medicina tibetana y representa uno de los componentes esenciales de los cinco ingredientes básicos (Polygonatum sibiricum Delar. ex Redoute, Asparagus cochinchinensis (Lour.) Merr, Vicatia thibetica H. Boissieu, Oxybaphus himalaicus Edgew., y Gymnadenia conopsea (L.) R. Br.) 1. Distribuida principalmente en el suroeste de China, como el noroeste de Yunnan, el oeste de Sichuan, el Tíbet y otras áreas, su raíz seca sirve como sustituto local de la Angélica1. La raíz, conocida por su fragancia, se utiliza a menudo como condimento para guisos, y las hojas, conocidas como apio tibetano, contribuyen a deliciosos platos. Por lo tanto, Vicatia thibetica tiene importancia no solo como una planta medicinal única, sino también como fuente de alimento en el Tíbet.
Tanto las investigaciones nacionales como las internacionales indican que la Vicatia thibetica posee propiedades regeneradoras de la sangre y vigorizantes del qi (poder o energía), beneficiosas para regular la menstruación. Se emplea para tratar los síntomas de la dismenorrea menstrual irregular causada por palpitaciones y deficiencia de sangre, exhibiendo efectos farmacológicos como la regulación antioxidante de la inmunidad corporal2. El extracto alcohólico de Vicatia thibetica ha demostrado la capacidad de restaurar la masa corporal y el índice de órganos en ratones inmunocomprometidos inducidos por ciclofosfamida. Además, aumenta la actividad de la superóxido dismutasa en suero y reduce el contenido de malondialdehído, sugiriendo una mejora en la capacidad antioxidante y un efecto equilibrante sobre la peroxidación lipídica 2,3. Al mismo tiempo, aumenta el número de células sanguíneas y la hemoglobina, lo que no solo refleja objetivamente la función hematopoyética del cuerpo, sino que también desempeña un papel crucial en el sistema inmunológico 2,3.
La umbeliferona, caracterizada por cristales aciculares y un sabor amargo, posee un peso molecular pequeño, es volátil y se puede destilar con vapor. Se sublima fácilmente, tiene baja solubilidad en agua y alta solubilidad en materia orgánica. Como uno de los principales componentes químicos de Vicatia thibetica, la umbeliferona exhibe efectos inmunomoduladores sobre la inmunidad celular, la inmunidad humoral y la inmunidad inespecífica en modelos de ratón de inmunosupresión inducida por hidrocortisona 4,5.
La molécula de superficie celular CD40, miembro de la superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral, se expresa ampliamente en las células inmunitarias6. Su ligando homólogo, CD154, también conocido como CD40L, es una proteína transmembrana de tipo II expresada por linfocitos T activados. La activación de CD40 tiene la capacidad de regular al alza la expresión de moléculas coestimuladoras en la superficie de las células dendríticas (CD) y los monocitos. Este proceso promueve la función de presentación de antígenos de las principales moléculas del complejo de histocompatibilidad (MHC) y activa aún más las células T CD8+7.
Los macrófagos desempeñan un papel crucial en la formación y regulación del microambiente tumoral, y la activación de CD40 puede mejorar la remodelación del microambiente tumoral por parte de los macrófagos8. La activación de la señal CD40 influye significativamente en la proliferación y activación de las células B. Las células B, cuando son activadas por CD40, pueden funcionar como células presentadoras de antígenos efectivas. Presentan antígenos, generan actividad de linfocitos T efectores y, por lo tanto, contribuyen a los efectos antitumorales9. Además, la activación de CD40 en las células tumorales puede inducir la apoptosis e inhibir el crecimientotumoral 10. CD40 transduce principalmente señales mediante el control de la actividad de las proteínas quinasas tirosina no receptoras, incluidas Lyn, Fyn, Syk y otras. Además, tiene la capacidad de estimular las proteínas Bcl-xL, Cdk4 y Cdk6, activar los factores de transcripción Rel/NF-kB y fosforilar CG-2 y PI3K10.
El método de fluorescencia diferencial de barrido (DSF) se emplea ampliamente para evaluar el impacto de diversas condiciones ambientales, como la composición del tampón, la temperatura y los ligandos de moléculas pequeñas, en la estabilidad térmica de las estructuras de las proteínas. El tinte comúnmente utilizado para DSF es un tinte hidrofóbico naranja, sensible al medio ambiente. En condiciones normales, la estructura de la proteína está plegada, ocultando internamente su segmento hidrofóbico. A medida que aumenta la temperatura, la región hidrofóbica de la proteína queda más expuesta, lo que resulta en una descomposición gradual de la estructura natural de la proteína. El colorante se une selectivamente a esta porción de proteína expuesta, amplificando su fluorescencia. A continuación, se calculan los valores de Tm monitorizando los cambios en la detección de la señal de fluorescencia11. Hasta cierto punto, las variaciones en los valores de Tm pueden medir cambios en la estabilidad de las proteínas debidos a mutaciones, cambios en los tampones o unión de ligandos. Además, puede indicar alteraciones estructurales durante el proceso de plegamiento de proteínas12. Este enfoque ofrece datos precisos, un amplio rango de temperaturas, alta sensibilidad y una pérdida mínima de muestras de proteínas13.
En este estudio, la determinación de la fluorescencia se llevó a cabo utilizando un lector de microplacas fluorescentes en lugar de un aparato de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativa de fluorescencia. Esta modificación permite la detección de FSD en laboratorios que carecen de un instrumento de PCR cuantitativa fluorescente, lo que hace que el método sea menos complejo y reduce los pasos necesarios para la configuración del instrumento, simplificando así el proceso experimental. Sin embargo, este enfoque tiene ciertos inconvenientes. Si bien la complejidad se reduce, el procedimiento se vuelve más engorroso. Es necesaria la detección manual de fluorescencia a diferentes temperaturas, y no se puede lograr la recolección automática y continua de fluorescencia del sistema. Por lo tanto, este estudio utilizó la técnica DSF para explorar la interacción entre la proteína CD40 y la umbeliferona, proporcionando nuevos conocimientos sobre los mecanismos moleculares de la medicina tibetana.

<table><tbody><tr><td>Proteína CD40</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-P75408</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td><td>PYG0040</td><td></td></tr><tr><td>FlexStation 3 lector de microplacas multifuncional</td><td>Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTD</td><td>FlexStation 3</td><td></td></tr><tr><td>OriginPro 8 software OriginLab</td><td>Corporation</td><td>v8.0724(B724)</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato ( 1x)</td> <td>Gibco</td><td>8120485</td><td></td></tr><tr><td>SoftMax Pro 7.1</td><td>Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTD</td><td>SoftMax Pro 7.1</td><td></td></tr><tr><td>SSYPRO tinte naranja</td><td>Sigma</td><td>S5942</td><td></td></tr><tr><td>Umbeliferone</td><td>Shanghai Yuanye Biotechnology Co.</td><td>B21854</td><td></td></tr></tbody></table>

detección de la interacción proteína-umbeliferona cd40 mediante fluorescencia diferencial de barrido

Detection of CD40 Protein-Umbelliferone Interaction via Differential Scanning Fluorescence

La investigación de las interacciones entre diferentes moléculas es un aspecto crucial para comprender la patogénesis de la enfermedad y la detección de dianas farmacológicas. La umbeliferona, un ingrediente activo de la medicina tibetana Vicatia thibetica, exhibe un efecto inmunomodulador con un mecanismo desconocido. La proteína CD40 es un objetivo clave en la respuesta inmunitaria. Por lo tanto, este estudio emplea el principio de la tecnología de fluorescencia diferencial de barrido para analizar las interacciones entre la proteína CD40 y la umbeliferona utilizando marcadores enzimáticos fluorescentes. Inicialmente, se verificó experimentalmente la estabilidad de la proteína colorante naranja fluorescente y se determinó la relación de dilución óptima de 1:500. Posteriormente, se observó que el valor de fusión a temperatura (Tm) de la proteína CD40 tendía a disminuir con un aumento en la concentración. Curiosamente, se descubrió que la interacción entre la proteína CD40 y la umbeliferona mejora la estabilidad térmica de la proteína CD40. Este estudio representa el primer intento de detectar el potencial de unión de compuestos y proteínas de moléculas pequeñas utilizando microplacas de fluorescencia y colorantes fluorescentes. La técnica se caracteriza por una alta sensibilidad y precisión, lo que promete avances en los campos de la estabilidad de las proteínas, la estructura de las proteínas y las interacciones proteína-ligando, lo que facilita la investigación y la exploración posteriores.

El colorante naranja exhibió consistentemente una excitación de fluorescencia estable a Ex = 470 nm y Em = 570 nm, tanto a temperatura ambiente como a temperaturas elevadas. Se determinó una relación de dilución óptima de 1:500 (Figura 2A,B). La detección del valor de Tm resultó difícil cuando la concentración de la proteína CD40 estaba por debajo de 15 μg/mL (Figura 3A,B). Sin embargo, a una concentración de 15 μg/mL, se detectó un valor estable de Tm de 51,82 °C, que disminuyó a 45,79 °C con un aumento en la concentración de la proteína CD40 (Figura 3C,D).

Como se muestra en la Figura 3, es evidente que la unión de la proteína CD40 a la umbeliferona influye en el valor Tm de la proteína CD40. En concreto, los valores de Tm de la proteína CD40 a concentraciones de 15 μg/mL y 20 μg/mL, así como de umbeliferona de 10 μM, aumentaron a 62,08 °C y 65,27 °C, respectivamente.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66610/66610fig1.jpg"> Figura 1: Descripción general del protocolo. Diagrama de flujo del proceso de registro de la capacidad de unión de la proteína CD40 a la umbeliferona basado en el principio DSF utilizando un lector de microplacas fluorescentes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66610/66610fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66610/66610fig2.jpg"> Figura 2: Cribado de las proporciones de dilución del colorante naranja y pruebas de estabilidad. (A) Estabilidad de la fluorescencia de los colorantes con diferentes relaciones de dilución a temperatura ambiente. (B) Estabilidad de fluorescencia de colorantes con una relación de dilución de 1:500 a 35-95 °C. Las barras de error denotan la media ± SEM, n = 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66610/66610fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66610/66610fig3.jpg"> Figura 3: Gráficos de resultados del uso de un lector de microplacas fluorescentes para registrar la capacidad de unión de la proteína CD40 a la umbeliferona según el principio DSF. Perfiles de Tm (A-D) de 5 μg/mL, 10 μg/mL, 15 μg/mL, 20 μg/mL de proteína CD40 y CD40 + 10 μM de umbeliferona, respectivamente. Las barras de error denotan la media ± SEM, n = 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66610/66610fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Este protocolo describe un método único para detectar la unión entre compuestos y moléculas de proteínas, que ofrece las ventajas de una pérdida mínima de muestras de proteínas y una alta precisión de los datos.

Detección de la interacción proteína-umbeliferona CD40 mediante fluorescencia diferencial de barrido

The investigation of interactions between different molecules is a crucial aspect of understanding disease pathogenesis and screening for drug targets. ...

Nuestro protocolo proporciona una ventaja significativa al permitir su uso sin equipos especializados. A diferencia de los métodos tradicionales de PCR cuantitativa de fluorescencia, simplifica el proceso experimental, ya que requiere menos pasos y reduce la complejidad general, lo que lo hace más seguro y fácil de realizar. Este experimento requiere que el operador esté muy familiarizado con el procedimiento experimental y el lector de microplacas fluorescentes, y que no pierda demasiado tiempo durante el calentamiento de la solución y la detección de fluorescencia.Nos centraremos en el mecanismo molecular por el cual la umbeliferona se une a la proteína CD14 para producir efectos inmunitarios.

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Aprende a detectar la interacción entre umbeliferona y proteína CD40 mediante fluorescencia diferencial de barrido. Este protocolo simplificado minimiza la pérdida de muestra y no requiere equipo especializado para estudios inmunológicos.

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