Name: Remodelación dependiente de la experiencia de la conectividad sináptica de las neuronas sensoriales olfativas del cerebro juvenil en un período crítico de la vida temprana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-01T14:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Descubre cómo la exposición olfativa controlada induce la remodelación sináptica en Drosophila mediante poda glial durante períodos críticos. Este modelo permite manipulaciones genéticas y farmacológicas para reactivar la plasticidad en adultos.

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<meta charset="utf8"></head><body>Remodelación sináptica inducida por la experiencia olfativa en el cerebro juvenil de Drosophila

<ol><li>English, S., Barreaux, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+sensitive+periods+in+development%3A+insights+from+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opinion+Behav+Sci%22%5BJournal%5D)">The evolution of sensitive periods in development: insights from insects.</a> Curr Opinion Behav Sci. 36, 71-78 (2020).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>For Smell Exposure</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drosophila viales</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-110</td><td></td></tr><tr><td>Butirato de etilo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E15701</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Aceite mineral</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3516</td><td></td></tr><tr><td>Cámaras de olor</td><td>Glasslock</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinceles</td><td>Winsor & Newton</td><td>Series 233</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Thermofisher</td><td>S37440</td><td></td></tr><tr><td>Malla de alambre</td><td>Scienceware</td><td>378460000</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Disección cerebral</fuerte></td>etanol, <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>190 pruebas</td><td>Decon Labs</td><td>2801</td><td>Diluido al 70%</td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td>Dumont #5</td></tr><tr><td>Paraformaldehído&nbsp;</td><td>Ciencias del Microscopio Electrónico</td><td>157-8</td><td>Diluido al 4%</td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>08-757-100B</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>70011-044</td><td>Diluida a 1x</td></tr><tr><td>sacarosa</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP220-1</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>Microscopio Electrónico Ciencias</td><td>24236-10</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>Brain Immunocytochemistry</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>488 cabra anti-pollo</td><td>Invitrogen</td><td>A11039</td><td></td></tr><tr><td>546 cabra anti-rata</td><td>Invitrogen</td><td>A11081</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Pollo anti-GFP</td><td>Abcam</td><td>13970</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>Avantor</td><td>48366-067</td><td>25 x 25 mm</td></tr><tr><td>Cinta adhesiva de doble cara</td><td>Scotch</td><td>34-8724-5228-8</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G&nbsp;</td><td>Electron Microscope Sciences</td><td>17984-25</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-2</td><td>75 x 25 mm</td></tr><tr><td>Esmalte de uñas</td><td>Sally Hansen</td><td>109</td><td>Xtreme Wear, Invisible</td></tr><tr><td>Normal suero de cabra</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Rata anti-CadN</td><td>Estudios del desarrollo Banco de hibridomas</td><td>AB_528121</td><td></td></tr><tr><td> Confocal Confocal/Análisis</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cualquier ordenador/portátil</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Zeiss 510 META&nbsp;</td></tr><tr><td>Fiji software</td><td>Fiji</td><td></td><td>Versión 2.14.0/1.54f</td></tr></tbody></table>

remodelación dependiente de la experiencia de la conectividad sináptica de las neuronas sensoriales olfativas del cerebro juvenil en un período crítico de la vida temprana

Experience-Dependent Remodeling of Juvenile Brain Olfactory Sensory Neuron Synaptic Connectivity in an Early-Life Critical Period

La Figura 1 muestra el flujo de trabajo para los métodos de imagen cerebral, exposición a odorantes y período crítico dependientes de la experiencia olfativa. El protocolo comienza con la coincidencia de edad de las pupas oscuras de farato inmediatamente antes de la eclosión (Figura 1A). Las pupas se colocan en cámaras odoríferas durante 4 h, y luego los adultos recién encerrados se voltean a viales nuevos en las cámaras odoríferas del vehículo o en las cámaras odoríferas EB dosificadas (Figura 1B). Por lo general, nos exponemos al odorante durante 24 horas, aunque es posible cualquier duración. Después de la exposición al odorante, la disección del cerebro comienza retirando la cabeza del tórax y luego retirando el exoesqueleto de la cutícula con pinzas finas (Figura 1C). El cerebro aislado se limpia de cualquier tejido asociado que pueda interferir con la imagen y luego se fija inmediatamente en paraformaldehído al 4% y sacarosa al 4% en PBS. Una solución corta de 30 minutos es suficiente para una buena integridad del tejido cerebral. El protocolo inmunocitoquímico comienza con un bloqueo de 1 h (p. ej., BSA, NGS), incubación nocturna en anticuerpos primarios (p. ej., anti-GFP, -CadN) y luego una breve incubación de 2 h en anticuerpos secundarios (Figura 1D). Los cerebros marcados se montan en portaobjetos de vidrio debajo de cubreobjetos sellados con la superficie dorsal del cerebro hacia arriba para obtener una mejor imagen de los lóbulos antenales (Figura 1E). Tenga en cuenta que todas las muestras se ciegan tanto al genotipo como a las condiciones de experiencia marcando el portaobjetos con una designación codificada para su posterior decodificación. Se utiliza un microscopio confocal de barrido láser con un objetivo de inmersión en aceite de 63x para obtener imágenes de los lóbulos de las antenas centrales del cerebro (Figura 1F). Se seleccionan líneas láser óptimas para los fluoróforos utilizados (por ejemplo, Argon 488 y HeNe 543) para obtener imágenes de la inervación de las neuronas sensoriales olfativas Or42a de VM7 en el contexto de los glomérulos circundantes.
Es importante seleccionar la ganancia, el desplazamiento, la resolución de imagen y el grosor de corte óptico óptimos para capturar toda la proyección de la pila Z de la inervación de las neuronas Or42a en los glomérulos VM7. Todos los genotipos y condiciones de experiencia que se van a comparar se visualizan con idénticos ajustes de microscopio. Las pilas Z se procesan utilizando el software ImageJ con cambios dependientes de la experiencia evaluados principalmente por el volumen de inervación 7,14. Hay dos formas en las que se han calculado las mediciones volumétricas. Se calcula el área de inervación rebanada por rebanada utilizando la función de lazo ImageJ y luego se multiplica cada valor por el grosor de cada rebanada (μm)8,9. El otro utiliza proyecciones Z de suma de segmentos y multiplica el número de segmentos de pila Z por el grosor del segmento para determinar el volumen promedio. Ambos métodos dan resultados consistentes. Además de las mediciones de volumen, la intensidad de fluorescencia también se puede evaluar con la proyección de intensidad máxima de VM7 glomérulos16. La suma ponderada de todos los píxeles se evalúa a través de la proyección máxima de corte de suma de ImageJ, con el número de píxeles en cada nivel de intensidad sumado para calcular la intensidad general 8,9. El fondo se puede restar cuantificando una región extraglomerular de tamaño idéntico. Este método de sustracción requiere más tiempo pero es más preciso, ya que tiene en cuenta los diferentes niveles de marcaje de anticuerpos de fondo en cada muestra de cerebro para producir una cuantificación más representativa de los valores de intensidad de fluorescencia de inervación. Las mediciones de intensidad se realizan en un rango típico de 18-30 cortes ópticos (0,37 μm/corte) dentro de una pila Z, promediada para cada cerebro16. En casi todos los casos, las mediciones de intensidad y volumen de fluorescencia por inervación dan resultados consistentes.
En todas las modalidades de medición, los resultados representativos siguen siendo inquebrantables; La experiencia temprana con el odorante EB resulta en una pérdida significativa de la inervación de las neuronas Or42a. El glomérulo VM7 puede identificarse de forma fiable por su tamaño, forma y ubicación, entre otros glomérulos olfativos del lóbulo antenal mapeados con precisión (Figura 2A) y por la expresión dirigida de la marca de membrana Or42a-mCD8::GFP acoplada al marcaje glomerular con cadherina antineural (CadN; Figura 2B). La exposición programada al control del vehículo odorante (aceite mineral) da como resultado una inervación de las neuronas Or42a indistinguible de la de un animal normal no tratado. Aun así, la experiencia con el odorante EB en los primeros días después de la eclosión (dpe) provoca la poda sináptica de los glomérulos (Figura 2C). Este mecanismo de poda está totalmente restringido al breve período crítico de los primeros años de vida 8,10. Por lo general, ahora utilizamos exposiciones a odorantes de 24 h para evaluar la poda sináptica de los glomérulos VM7 y la disminución resultante en el volumen de inervación en el cerebro juvenil de Drosophila. Una exposición de 24 h (0-1 dpe) al control del vehículo odorante (aceite mineral) mantiene la inervación normal y densa de Or42a-mCD8::GFP (verde) en los glomérulos sinápticos VM7 (círculos discontinuos blancos) en ambos lóbulos antenales del hemisferio cerebral (Figura 2D, izquierda). En contraste, la exposición de 24 horas (0-1 dpe) al 25% de olor EB disuelto en el aceite mineral da como resultado una fuerte poda de la inervación de Or42a-mCD8::GFP (verde) y una pérdida del volumen glomerular sináptico (Figura 2D, derecha). Estos resultados son visualmente obvios y consistentemente claros. Uno de los mayores atributos de este protocolo de experiencia odorífera es la claridad de los resultados de las imágenes cerebrales, que también son extremadamente susceptibles a cuantificaciones directas de inervación, fluorescencia, intensidad y volumen.
La principal ventaja de este protocolo de experiencia odorífera es la capacidad de aprovecharlo para el estudio de la restricción temporal y los mecanismos dependientes de la dosis odorífera durante la poda sináptica del período crítico. Para la eliminación de sinapsis de la neurona Or42a impulsada por EB en el glomérulo VM7, el mecanismo de remodelación se restringe principalmente a los juveniles tempranos (0-2 dpe), sin poda sináptica detectable dependiente de la experiencia en la madurez (7-9 dpe), excepto una modulación menor en los niveles más altos de exposición a EB8. Tal restricción temporal define un período crítico, y la comprensión de este mecanismo de tiempo es un objetivo importante. Otro atributo de este protocolo es que la poda sináptica dependiente de la experiencia depende de la dosis de EB (Figura 3). La exposición programada al control del vehículo odorante (aceite mineral) con odorante 0% EB da como resultado una inervación normal de las neuronas Or42a del glomérulo sináptico VM7, que es indistinguible de un animal no tratado. El cálculo del volumen tridimensional de inervación de la neurona Or42a muestra un tamaño típico de un cerebro juvenil normal (2260 μm3; Figura 3A, izquierda). Los resultados representativos muestran que el aumento de la concentración de odorante EB provoca una poda de glomérulos sinápticos progresivamente mayor. Por ejemplo, una exposición de 24 horas (0-1 dpe) al 15% de olor EB da como resultado una pérdida de inervación clara y consistente (Figura 3A, centro). La cuantificación del volumen de inervación 3D muestra una reducción sorprendente en comparación con los controles del vehículo (760 μm3 frente a 2260 μm3). Una exposición de 24 h (0-1 dpe) al 25% de olor EB causa aún más pérdida de inervación (281 μm3; Figura 3A, derecha). Las cuantificaciones representativas para este rango de concentraciones de odorante EB muestran resultados consistentes para la intensidad de fluorescencia (Figura 3B) y el volumen de inervación (Figura 3C). Esta dependencia de la dosis permite el estudio de los medios para prevenir la poda sináptica, así como mejorar la poda con exposiciones más bajas a los odorantes para demostrar una mayor remodelación sináptica de los glomérulos. Algunos estudios previos han demostrado el efecto contrario al aumento del volumen glomerular utilizando otros odorantes con este protocolo10. La exposición al odorante EB en el período crítico siempre resulta en una poda de glomérulos sinápticos impactante y fácilmente detectable.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66629/66629fig01.jpg"> Figura 1: Diagrama de flujo de los estudios de exposición a olores en el cerebro juvenil de Drosophila . (A) Las pupas oscuras de farato (90+ h después de la puparición a 25 °C) se recogen y se colocan en cámaras odoríferas. En condiciones de olor, se permiten 4 h para la eclosión, y luego las moscas juveniles se transfieren a un vial nuevo. (B) Las moscas de la misma edad se dividen en las condiciones de control del vehículo (100% de aceite mineral) o de butirato de etilo (EB; % v/v en aceite mineral). Una malla de alambre fina (recuadro) permite el acceso al odorante. Por lo general, las moscas se exponen durante 20 horas adicionales para un total de 24 horas de exposición, 0-1 día después de la eclosión (dpe). (C) Las moscas se diseccionan quitando primero la cabeza, y luego se utilizan pinzas finas para quitar delicadamente el exoesqueleto de la cutícula y aislar el cerebro juvenil. El cerebro aislado se limpia de todos los tejidos circundantes y de la tráquea que sobresale. (D) Los cerebros aislados se fijan, se bloquean y luego se incuban secuencialmente en anticuerpos primarios y secundarios. La gama de anticuerpos utilizados suele incluir una sonda de membrana general para revelar los glomérulos sinápticos del lóbulo antenal y una sonda de membrana específica para las neuronas sensoriales olfativas Or42a. (E) Los cerebros marcados se colocan en un medio de montaje en un portaobjetos de microscopio de vidrio con espaciadores de cinta debajo de un cubreobjetos sellado. La orientación correcta del cerebro (superficie dorsal hacia arriba) es fundamental para obtener imágenes óptimas de los lóbulos antenales. (F) Los cerebros se visualizan utilizando un microscopio fluorescente confocal de barrido láser. Todas las muestras se ciegan al genotipo y experimentan condiciones previas a la obtención de imágenes y a los análisis cuantificados posteriores. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66629/66629fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66629/66629fig02.jpg"> Figura 2: Poda de glomérulos sinápticos del período crítico dependiente de la experiencia odorante. (A) Los glomérulos olfativos del lóbulo antenal (AL) se mapean con precisión. Se muestran algunos glomérulos sinápticos representativos. La clase de neuronas sensoriales olfativas (OSN) del receptor Or42a inerva específicamente los glomérulos VM7. (B) Las neuronas marcadas con Or42a-mCD8::GFP (verde) inervan densamente los glomérulos VM7 emparejados en los lados izquierdo (L) y derecho (R) del cerebro, con el marcaje de anticuerpos N-Cadherina (CadN) de todos los glomérulos sinápticos AL (magenta). La línea de mosca es w1118; Or42a-mCD8::GFP/+. (C) Representación gráfica esquemática de la inervación OSN Or42a de los glomérulos sinápticos VM7 en la condición de control del vehículo (100% de aceite mineral; izquierda) y exposición al butirato de etilo (% EB v/v en aceite mineral; derecha) durante el período crítico juvenil. La poda de inervación dependiente de la experiencia solo ocurre con la exposición temprana a EB, con las sinapsis eliminadas y los axones perdidos, lo que resulta en una reducción del volumen de inervación. (D) Imágenes confocales representativas de la inervación OSN de Or42a de los glomérulos sinápticos VM7 emparejados (círculos de contorno blanco discontinuos; Or42a-mCD8::GFP, verde) después del control del vehículo de petróleo (izquierda) y una exposición al 25% de EB (derecha) durante 24 h (0-1 dpe). La experiencia odorífera de EB impulsa la poda sináptica y la pérdida de volumen de inervación. Este mecanismo dependiente de la experiencia está temporalmente restringido y transitoriamente reversible solo dentro de un período crítico olfativo bien definido en los primeros días después de la eclosión. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66629/66629fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66629/66629fig03.jpg"> Figura 3: Cuantificación de la inervación de los glomérulos sinápticos dependientes de la dosis de EB, intensidad y volumen de fluorescencia. (A) Inervación marcada con Or42a-mCD8::GFP en un glomérulo sináptico VM7 (verde) expuesto de 0-1 dpe al control de aceite mineral del vehículo odorante (0% EB, izquierda), 15% EB (centro) o 25% EB (derecha). Abajo: Las mismas imágenes con la inervación glomerular delineada (círculos blancos) y el volumen de inervación tridimensional calculado. El vehículo de control tiene inervación del glomérulo sináptico VM7 por neuronas Or42a que es indistinguible de los animales no tratados. La experiencia del período crítico con una exposición al 15% del odorante EB da como resultado una poda evidente del glomérulo sináptico, con una disminución del 66% en el volumen de inervación tridimensional en este caso. La exposición al nivel más alto de 25% de EB resulta en una mayor poda, con una pérdida de casi el 90% del volumen del glomérulo sináptico en este caso. Por lo tanto, se puede imaginar la poda dependiente de la dosis a medida que aumenta la experiencia del olor. (B) Resultados representativos de la intensidad de fluorescencia marcada con Or42a-mCD8::GFP dentro de los glomérulos sinápticos VM7 expuestos de 0-1 dpe al control del vehículo odorante (aceite, verde), 15% EB (medio, naranja) o 25% EB (derecha, negro). (C) Resultados representativos de los volúmenes de inervación tridimensional de los glomérulos VM7 en las mismas condiciones de exposición al odorante del período crítico. Los diagramas de dispersión muestran todos los puntos de datos individuales con la media ± SEM. La significación se indica como p≤0,05 (*), p ≤ 0,01 (**), p ≤ 0,001 (***) y p ≤ 0,0001 (****). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66629/66629fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Remodelación dependiente de la experiencia de la conectividad sináptica de las neuronas sensoriales olfativas del cerebro juvenil en un período crítico de la vida temprana

Early-life olfactory sensory experience induces dramatic synaptic glomeruli remodeling in the Drosophila juvenile brain, which is experientially ...

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Se describe un protocolo de inmunohistoquímica para estudiar el perfil de activación de las neuronas del hipocampo tras la exposición a una tarea de aprendizaje espacial en un modelo de ratón que se caracteriza por déficits cognitivos de origen del desarrollo neurológico. Este protocolo se puede aplicar a ambos modelos genéticos o farmacológicos de ratón caracterizadas por déficits cognitivos.

Visualización inmunohistoquímico de hipocampo Neurona Actividad Después espacial aprendizaje en un modelo de ratón de los trastornos del desarrollo neurológico

La identificación de moléculas y vías que controlan la plasticidad sináptica y la memoria sigue siendo un desafío importante en la neurociencia. Aquí, se describe un flujo de trabajo que aborda la cuantificación relativa de las proteínas sinápticas supuestamente involucradas en la reorganización molecular de las sinapsis durante el aprendizaje y la consolidación de la memoria en un paradigma de aprendizaje auditivo.

Alta Resolución cuantitativa Synaptic proteoma perfiles de cerebro de ratón Regiones Después de discriminación auditiva de aprendizaje

Aquí capacitamos a ratones en una tarea de aprendizaje asociativo para probar la discriminación de olor. Este protocolo permite también estudios sobre cambios estructurales inducidos por el aprendizaje en el cerebro.

Una prueba objetiva y Reproducible de aprendizaje olfativo y discriminación en ratones

Este es un protocolo para la preparación aguda de la rebanada de hipocampo adulto y envejecido del ratón que aprovecha la perfusión transcardial y el corte de rodajas con NMDG-aCSF helado para reducir el daño hipoxico al tejido. Las rebanadas resultantes se mantienen saludables durante muchas horas y son adecuadas para grabaciones de parches y de campo a largo plazo.

Minimizar la hipoxia en las rebanadas de hipocampo de ratones adultos y envejecidos

El protocolo presentado aquí proporciona información sobre la electroencefalografía simultánea (EEG) y la evaluación del comportamiento en tiempo real. Hemos discutido todos los pasos involucrados en este protocolo como una solución atractiva para los investigadores en muchos campos de la neurociencia, particularmente en las áreas de aprendizaje y memoria.

Monitoreo simultáneo de electrofisiología inalámbrica y prueba de comportamiento de memoria como herramienta para estudiar la neurogénesis del hipocampo

Este protocolo describe el procedimiento de disección, la condición de cultivo y las imágenes en vivo de un sistema de explante antena-cerebro para el estudio del ensamblaje del circuito olfativo.

Un sistema de explante para estudios de imágenes de lapso de tiempo del ensamblaje de circuitos olfativos en Drosophila

Descubre cómo la exposición olfativa controlada induce la remodelación sináptica en Drosophila mediante poda glial durante períodos críticos. Este modelo permite manipulaciones genéticas y farmacológicas para reactivar la plasticidad en adultos.

Remodelación dependiente de la experiencia de la conectividad sináptica de las neuronas sensoriales olfativas del cerebro juvenil en un período crítico de la vida temprana (Video) | JoVE Journal

Remodelación dependiente de la experiencia de la conectividad sináptica de las neuronas sensoriales olfativas del cerebro juvenil en un período crítico de la vida temprana

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