Name: Aislamiento y cultivo de células epiteliales mamarias humanas primarias (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 5 s
Description: Aprende a aislar y cultivar células epiteliales mamarias humanas primarias mediante disociación enzimática. Este protocolo eficiente permite obtener HMECs viables para investigar la mastitis granulomatosa y desarrollar estrategias terapéuticas.

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Programa de Ciencia y Tecnología de MTC de la provincia de Zhejiang, China (2017ZA055; 2018ZA036), y el Proyecto de Ciencia y Tecnología de Zunyi, provincia de Guizhou, China (Zunyi City Kehe Support NS (2020) No. 18) a X. Xu. Los autores agradecen al Laboratorio de Biología Molecular de la Compañía de Tecnología Biomédica de Youjia (Hangzhou) por proporcionar capacitación en cultivos celulares.

Los tejidos mamarios normales frescos utilizados en este protocolo se recolectan de la cirugía alrededor de la lesión de mastitis lobulillar granulomatosa refractaria en el Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica China de Zhejiang de acuerdo con las pautas del Comité de Ética Médica del Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica China de Zhejiang (Protocolo No. ChiMCTR2100005281, Fecha: 2017-07-17).
1. Adquisición de tejido
<ol><li>Recoja tejidos mamarios frescos de muestras quirúrgicas tomadas de mujeres adultas en tubos estériles que contengan 10 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) con 3% de penicilina/estreptomicina (P/S). NOTA: Los tejidos mamarios deben manipularse de acuerdo con los siguientes detalles dentro de las 24 horas posteriores a la recolección de la cirugía.</li>
</ol>2. Pretratamiento de los tejidos
<ol><li>Retire el tejido adiposo del tejido mamario con dos pares de pinzas, asegurándose de que el tejido mamario restante tenga ~ 1 g de peso.</li>
	<li>Enjuagar el tejido mamario en una solución de etanol al 75% (5 mL) durante 5 s y luego lavar con 20 mL de solución de lavado (Tabla 1) durante 2 x 5 min.</li>
</ol>3. Digestión de los tejidos
<ol><li>Cortar el tejido mamario en fragmentos más pequeños, triturando el tejido con dos cuchillas quirúrgicas durante 15 min para obtener el tejido homogeneizado. Transfiera las piezas de tejido a un tubo centrífugo de 50 ml.</li>
	<li>Añadir 10 mL de 5,0 mg/mL de dispasa + 5,0 mg/mL de solución de colagenasa, 3 mL de tripsina al 0,25% y 7 mL de PBS a un total de 20 mL de solución de digestión en un tubo centrífugo de 50 mL que contiene los fragmentos de tejido mamario. Colocar el tubo en un baño de agua a 37 °C e incubar durante 1,5 h; Agite el tubo cada 20 min.</li>
	<li>Detenga el proceso de digestión inyectando 20 mL de la solución neutralizante. Mezcle el contenido pipeteando ~ 15x.</li>
	<li>Filtre la mezcla a través de un filtro de malla de 100 μm. Centrifugar a 156 × g durante 5 min.</li>
	<li>Retirar el sobrenadante y repetir la incubación del pellet con 20 mL de solución neutralizante. Mezclar el contenido pipeteando 15x y centrifugar a 156 × g durante 5 min.</li>
	<li>Retirar el sobrenadante con cuidado y resuspender el pellet celular con 10 mL de medio de cultivo inicial. Coloque la suspensión celular en una placa de cultivo celular de 100 mm.</li>
	<li>Cultivar las células en una incubadora de CO2 al 5% a 37 °C. Reemplace el medio de cultivo original con medio de células epiteliales frescas cada tres días. Revise las celdas y actualice el medio cada 2 días.</li>
</ol>4. Paso de celdas
<ol><li>Retire la placa de 100 mm de la incubadora cuando las células alcancen el 80%-90% de confluencia, deseche el medio usado y enjuague la placa 2 veces con 2 ml de PBS. Retire el PBS y luego agregue 2 ml de tripsina al 0,05% en cada plato de 100 mm. NOTA: Gire el plato para asegurarse de que la solución de tripsina tenga suficiente contacto con el fondo del plato.</li>
	<li>Coloque el plato de 100 mm en una incubadora a 37 °C durante ~7 min para el proceso de digestión.</li>
	<li>Examine las células con un microscopio utilizando un objetivo de 40x para asegurarse de que la mayoría de las células se hayan disociado del fondo de la placa.</li>
	<li>Detenga el proceso de digestión agregando 8 mL de solución neutralizante y transfiera las células a un tubo de 15 mL. Mezcle las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10-15 veces. Centrifugar las células a 156 × g durante 5 min.</li>
	<li>Retire el sobrenadante con cuidado, vuelva a suspender las células con 10 ml de medio celular epitelial y cuente el número de células.</li>
	<li>Añadir 1 × 106 células en 10 mL de medio de células epiteliales en una placa de 100 mm.</li>
	<li>Refresque el medio celular epitelial y observe las células cada 2 días.</li>
</ol>5. Criopreservación celular
<ol><li>Repita los pasos 4.1-4.4.</li>
	<li>Retire el sobrenadante con cuidado y vuelva a suspender las células en 2 ml de solución de criopreservación celular.</li>
	<li>Transfiera 1 mL de la solución de criopreservación que contiene las células a cada vial criogénico.</li>
	<li>Registre los nombres de las células criopreservadas, los números de paso y las fechas.</li>
	<li>Coloque los viales en un recipiente de congelación de velocidad controlada a -80 °C durante la noche.</li>
	<li>Retire los viales criogénicos del congelador a -80 °C y transfiéralos rápidamente a nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.</li>
</ol>

Protocolo para el aislamiento de células epiteliales mamarias de tejido humano

<ol><li>Smolarz, B., Nowak, A. Z., Romanowicz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer-epidemiology%2C+classification%2C+pathogenesis+and+treatment+%28review+of+literature%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Breast cancer-epidemiology, classification, pathogenesis and treatment (review of literature).</a> Cancers (Basel). 14 (10), 2569(2022).</li>
<li>Gudjonsson, T., Adriance, M. C., Sternlicht, M. D., Petersen, O. W., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myoepithelial+cells%3A+Their+origin+and+function+in+breast+morphogenesis+and+neoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Myoepithelial cells: Their origin and function in breast morphogenesis and neoplasia.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 10 (3), 261-272 (2005).</li>
<li>Faridi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+the+primary+epithelial+breast+cancer+cells+and+the+adjacent+normal+epithelial+cells+from+iranian+women%27s+breast+cancer+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of the primary epithelial breast cancer cells and the adjacent normal epithelial cells from iranian women's breast cancer tumors.</a> Cytotechnology. 70 (2), 625-639 (2018).</li>
<li>Tovar, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+rat+mammary+gland%3A+Isolation%2C+characterization%2C+and+culture+of+purified+mammary+epithelial+cells+and+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Dissecting the rat mammary gland: Isolation, characterization, and culture of purified mammary epithelial cells and fibroblasts.</a> Bio Protoc. 10 (22), e3818(2020).</li>
<li>Jiang, X., Yang, H., Jing, Q., He, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%26%2334%3Bselective+secondary+tissue+attachment%26%2334%3B+method+for+isolation+and+purification+of+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochem%22%5BJournal%5D)">A &#34;selective secondary tissue attachment&#34; method for isolation and purification of mammary epithelial cells.</a> Acta Histochem. 124 (8), 151972(2022).</li>
<li>Bernardini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+pig+mammary+epithelial+cell+culture+model+as+a+non-clinical+tool+for+studying+epithelial+barrier-a+contribution+from+the+imi-conception+project%5BTitle%5D)+AND+%22Animals+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Development of a pig mammary epithelial cell culture model as a non-clinical tool for studying epithelial barrier-a contribution from the imi-conception project.</a> Animals (Basel). 11 (7), 2012(2021).</li>
<li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transdifferentiation+of+goat+ear+fibroblasts+into+lactating+mammary+epithelial+cells+induced+by+small+molecule+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Transdifferentiation of goat ear fibroblasts into lactating mammary epithelial cells induced by small molecule compounds.</a> Biochem Biophys Res Commun. 573, 55-61 (2021).</li>
<li>Hammond, S. L., Ham, R. G., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-free+growth+of+human+mammary+epithelial+cells%3A+Rapid+clonal+growth+in+defined+medium+and+extended+serial+passage+with+pituitary+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Serum-free growth of human mammary epithelial cells: Rapid clonal growth in defined medium and extended serial passage with pituitary extract.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (17), 5435-5439 (1984).</li>
<li>Zubeldia-Plazaola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+methods+for+the+isolation+of+human+breast+epithelial+and+myoepithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparison of methods for the isolation of human breast epithelial and myoepithelial cells.</a> Front Cell Dev Biol. 3, 32(2015).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+and+efficient+method+to+isolate+primary+human+keratinocytes+from+adult+skin+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue.</a> J Vis Exp. (138), e57784(2018).</li>
<li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+primary+human+gingival+epithelial+cells+using+y-27632%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of primary human gingival epithelial cells using y-27632.</a> J Vis Exp. (177), e62978(2021).</li>
<li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+primary+human+mammary+epithelial+cells+isolated+and+propagated+by+conditional+reprogrammed+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Characterization of primary human mammary epithelial cells isolated and propagated by conditional reprogrammed cell culture.</a> Oncotarget. 9 (14), 11503-11514 (2018).</li>
<li>Böcker, W., Hungermann, D., Decker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+breast%5BTitle%5D)+AND+%22Pathologe%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the breast.</a> Pathologe. 30 (1), 6-12 (2009).</li>
<li>Kouros-Mehr, H., Slorach, E. M., Sternlicht, M. D., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gata-3+maintains+the+differentiation+of+the+luminal+cell+fate+in+the+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Gata-3 maintains the differentiation of the luminal cell fate in the mammary gland.</a> Cell. 127 (5), 1041-1055 (2006).</li>
<li>Wang, X., Reagan, M. R., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+adipose+tissue+models+for+studying+mammary+gland+development+and+breast+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Synthetic adipose tissue models for studying mammary gland development and breast tissue engineering.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 15 (3), 365-376 (2010).</li>
<li>Ethier, S. P., Mahacek, M. L., Gullick, W. J., Frank, T. S., Weber, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+isolation+of+normal+luminal+mammary+epithelial+cells+and+breast+cancer+cells+from+primary+and+metastatic+sites+using+selective+media%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Differential isolation of normal luminal mammary epithelial cells and breast cancer cells from primary and metastatic sites using selective media.</a> Cancer Res. 53 (3), 627-635 (1993).</li>
<li>Band, V., Sager, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinctive+traits+of+normal+and+tumor-derived+human+mammary+epithelial+cells+expressed+in+a+medium+that+supports+long-term+growth+of+both+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Distinctive traits of normal and tumor-derived human mammary epithelial cells expressed in a medium that supports long-term growth of both cell types.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (4), 1249-1253 (1989).</li>
<li>Taylor-Papadimitriou, J., Shearer, M., Tilly, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+properties+of+cells+cultured+from+early-lactation+human+milk%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Some properties of cells cultured from early-lactation human milk.</a> J Natl Cancer Inst. 58 (6), 1563-1571 (1977).</li>
<li>Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Y-27632+simplifies+the+isolation+procedure+of+human+primary+epidermal+cells+by+selectively+blocking+focal+adhesion+of+dermal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells.</a> J Tissue Eng Regen Med. 12 (2), e1251-e1255 (2018).</li>
<li>Yin, J., Yu, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+kinases+regulate+corneal+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rho kinases regulate corneal epithelial wound healing.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 295 (2), C378-C387 (2008).</li>
<li>Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., Mcbride, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+keratinocytes+are+efficiently+immortalized+by+a+rho+kinase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Human keratinocytes are efficiently immortalized by a rho kinase inhibitor.</a> J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).</li>
<li>Ścieżyńska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+human+primary+keratinocytes-a+methods+review%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of human primary keratinocytes-a methods review.</a> Exp Dermatol. 28 (2), 107-112 (2019).</li>
<li>Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispase%2C+a+neutral+protease+from+bacillus+polymyxa%2C+is+a+powerful+fibronectinase+and+type+IV+collagenase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Dispase, a neutral protease from bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase.</a> J Invest Dermatol. 93 (2), 287-290 (1989).</li>
<li>Ren, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cultures+of+mouse+small+intestinal+epithelial+cells+using+the+dissociating+enzyme+type+I+collagenase+and+hyaluronidase%5BTitle%5D)+AND+%22Braz+J+Med+Biol+Res%22%5BJournal%5D)">Primary cultures of mouse small intestinal epithelial cells using the dissociating enzyme type I collagenase and hyaluronidase.</a> Braz J Med Biol Res. 50 (5), e5831(2017).</li>
</ol>

Los autores declaran que no existen conflictos de interés con respecto a la publicación de este artículo.

Las HMEC son vitales para preservar la integridad anatómica y funcional del tejido mamario y son útiles en investigaciones científicas, implementaciones clínicas y dominios asociados15. Las células epiteliales primarias son un tipo de células especializadas que tienen pasajes limitados y vidas más cortas. Sin embargo, el crecimiento de las HMEC se ha visto obstaculizado por limitaciones técnicas, que en consecuencia han obstaculizado los avances en la investigación sobre el cáncer de mama y otras enfermedades inflamatorias relacionadas con la mama16.
Por lo tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar un método estable, factible y eficiente para obtener HMEC a partir de tejidos mamarios frescos. Hammond et al.8 y Band and Sager17 extrajeron y cultivaron con éxito células epiteliales de mama. Sin embargo, la composición del medio de cultivo requerido era demasiado compleja. Estudios previos de Taylor-Papidamitriou et al. demostraron que las células de caries de la leche materna podían cultivarse utilizando un medio suplementado con factores de crecimiento y suero18. Si bien su método permite la extracción directa de HMEC de la leche materna, la presencia de células no epiteliales puede afectar el crecimiento de HMEC, lo que dificulta la determinación precisa de los recuentos celulares. Jin et al. desarrollaron un método de reprogramación condicional que permitió a las HMEC primarias tener un ciclo de vida más largo y conservar la heterogeneidad celular en comparación con los métodos de cultivo tradicionales, pero dependía en gran medida de condiciones de cultivo específicas y restringía el uso de este método en otros laboratorios y aplicaciones12.
Un estudio del grupo de Zubeldia-Plazaola estableció un método de aislamiento optimizado que consistía en la digestión lenta (durante la noche) de fragmentos de tejido picado mediante una mezcla de colagenasa e hialuronidasa, seguida de tres centrifugaciones diferenciales al segundo día para separar las fracciones estromal/epitelio. Ese método de aislamiento más la adición de Y-27632 en el cultivo produjo un alto número de células epiteliales viables. Sin embargo, la cantidad de tejido mamario utilizado en su estudio fue de 40-75 g y el procedimiento de aislamiento duró casi 2 días9. Aquí, informamos el uso de solo 1 g de tejido en este protocolo, y probamos y descubrimos que este método también funcionó con tan solo 0,25 g de tejido. La mezcla enzimática de colagenasa, dispasa y tripsina digirió eficientemente 1 g de tejido en 1,5 h, y todo el procedimiento duró ~ 3 h. La adición de Y-27632 al medio de cultivo inicial puede promover la unión y proliferación de células epiteliales, pero también inhibir el crecimiento de células estromales19. Es importante destacar que en este estudio probamos los componentes del medio inicial y descubrimos que un 5% de FBS en DMEM para reemplazar el medio G utilizado en la publicación anterior fue suficiente para promover la unión y el crecimiento de las células epidérmicas10.
Después de 2 días de cultivo en el medio inicial, las células se cultivaron en un medio de queratinocitos libre de suero. El patrón de crecimiento celular para el cultivo inicial (P0) después de la inoculación se muestra en la Figura 2, que muestra un patrón de crecimiento de colonias. Es probable que este método de aislamiento produzca todo tipo de células epiteliales, incluidas las células mioepiteliales de tejidos mamarios, que deben caracterizarse más en el futuro. Sin embargo, al comparar el crecimiento de las células en presencia de Y-27632 con el grupo control sin añadir Y-27632 al medio de cultivo inicial, pudimos ver que el método con Y-27632 mejoró significativamente la producción celular y mejoró la eficiencia del cultivo celular (Figura 2A). Por lo general, ~ 9-10 días de cultivo después de la inoculación, las células epidérmicas podrían alcanzar una densidad adecuada para el paso. Además, también demostramos que la presencia de Y-27632 podría mejorar el crecimiento de Hmeēc P1 después de recuperar células P0 congeladas al final del cultivo inicial (Figura 3). En nuestras manos, descubrimos que más del 90% de las células pudieron sobrevivir después de ser descongeladas del almacenamiento congelado. Las células tuvieron un tiempo de duplicación de aproximadamente 72 h, y las HMEC fueron capaces de mantener un crecimiento normal hasta el 7º paso.
En este estudio, las células expresaron altos niveles de los marcadores de células epiteliales mamarias CK7 y GATA3 y, lo que es más importante, casi el 100% de las células en la etapa tardía del cultivo inicial fueron positivas para CK7 y GATA3 (Figura 4), lo que indica una alta pureza de las células epiteliales obtenidas de este método. Finalmente, este estudio comparó los niveles de expresión de CK7 y GATA3 en las células P0 y P3, revelando altos niveles de expresión en ambas, lo que sugiere que el paso no alteró el fenotipo de las células (Figura 5A,B). Además, a pesar de la presencia de Y-27632, CK7 y GATA3 se expresaron consistentemente en un alto rango, lo que implica que la adición de Y-27632 no afectó el fenotipo celular (Figura 5C,D).
La causa principal para el aumento de la proliferación celular a través de nuestro enfoque es la inclusión de Y-27632, que ha demostrado tener impactos ventajosos en la multiplicación y especialización de las células epiteliales humanas19,20. Chapman et al. encontraron que el uso de Y-27632 mejoró significativamente la capacidad de las células epiteliales para multiplicarse y condujo a la inmortalización exitosa de las células sin ningún signo de crisis celular21. En nuestro estudio, Y-27632 aumentó significativamente el rendimiento de estas células epiteliales al mejorar su unión y proliferación19.
Una característica clave de este método es la combinación de dispasa y colagenasa para separar el tejido epitelial del tejido conectivo, mientras que también emplea tripsina para disociar las células epiteliales del tejido epitelial22. La dispasa ha demostrado ser una enzima rápida, eficiente y suave, pero suave, para separar la epidermis no dañada de la dermis, así como las capas no dañadas de células epiteliales en cultivo de la superficie subyacente, al tiempo que mantiene la viabilidad de las células epiteliales23. La colagenasa tipo I facilita el aislamiento de las células epiteliales y asegura la vitalidad e integridad de las células24. Otra característica clave de este método es el uso del medio inicial con Y-27632 para cultivar los HMEC recién aislados. Después de que las células se hayan adherido a la placa al tercer día, el medio de cultivo se cambia a Medio sin suero de queratinocitos. Este enfoque simplifica notablemente los pasos experimentales y reduce el costo del experimento. Como resultado, con este método obtuvimos un número de células muy satisfactorio utilizando solo un pequeño volumen de tejido mamario, lo que indica que no es necesaria una gran cantidad de tejido inicial. Sin embargo, un inconveniente de este enfoque es que la presencia de tripsina no protege adecuadamente la integridad de las células epiteliales. Otro aspecto potencialmente limitante del método es la posibilidad de una pequeña contaminación (<1%) de las células mioepiteliales durante el cultivo inicial9.
Nuestro método ofrece un enfoque simplificado y eficiente para aislar y cultivar HMEC primarios derivados de tejido mamario adulto. Esta técnica se caracteriza por su simplicidad, su naturaleza ahorradora de tiempo y su capacidad para mantener las funciones celulares fundamentales. En consecuencia, esta técnica tiene claras ventajas y es muy prometedora para generar una cantidad sustancial de células epiteliales. Además, el método permite el aislamiento y el cultivo de HMEC de una amplia gama de donantes, lo que es adecuado tanto para la investigación de laboratorio como para aplicaciones clínicas, lo que lo hace muy versátil y ampliamente aplicable.

El cáncer de mama es el principal tipo de cáncer diagnosticado en mujeres a nivel mundial y es la principal causa de muerte por cáncer1. La patogenia del cáncer de mama es compleja e involucra múltiples factores como la genética, el medio ambiente y el estilo de vida. Las HMEC, células activas productoras de leche, son uno de los componentes más importantes del tejido mamario y probablemente son las células originales involucradas en la carcinogénesis del cáncer de mama. Por lo tanto, las HMEC han recibido la mayor atención de los investigadores para el estudio del cáncer de mama2. Además, las células primarias tienen la capacidad de proporcionar una caracterización biológicamente relevante de procesos celulares complejos debido a que conservan estabilidad genética, morfología normal y un conjunto más completo de funciones celulares básicas que no se pueden lograr con líneas celulares inmortalizadas3. Por lo tanto, el aislamiento y cultivo de las HMEC primarias es un paso esencial para el estudio de la mayoría de las enfermedades relacionadas con la mama, como el cáncer de mama y las enfermedades inflamatorias mamarias.
En la actualidad, se ha establecido un sistema estable y reproducible para el aislamiento, cultivo e identificación de células epiteliales mamarias de ratas, vacas, cerdos y cabras 4,5,6,7. Sin embargo, el aislamiento y el cultivo de HMEC primarios son un desafío debido al microambiente complejo y al bajo rendimiento de las células. Durante décadas, los científicos han estado buscando el método más eficaz para aislar y cultivar HMEC, aunque hace casi 20 años se estableció un sistema de cultivo para HMEC. Por ejemplo, Hammond et al. desarrollaron un medio de cultivo sin suero en el que las HMECs crecieron eficientemente8. Recientemente, Zubeldia-Plazaola et al. probaron cuatro métodos de aislamiento diferentes utilizando procedimientos de digestión enzimática rápida/lenta combinados con filtración secuencial o pasos de centrifugación diferencial para obtener HMECs9. Descubrieron que el método de digestión lenta, junto con la centrifugación diferencial, es el método más eficiente para aislar las HMEC del tejido mamario fresco. Sin embargo, ese método de aislamiento requiere grandes trozos de tejido (40-75 g) y utiliza mayores cantidades de enzimas digestivas. Su procedimiento es complicado (al menos tres centrifugaciones diferentes para obtener diferentes fracciones celulares), además de lento. Por lo tanto, todavía se necesita un método simple y rápido para obtener de manera eficiente poblaciones de HMEC a partir de pequeñas cantidades de tejido mamario para aplicaciones clínicas y de investigación9.
Nuestros estudios previos demostraron que la adición del inhibidor de la quinasa asociada a Rho (ROCK) Y-27632 en el medio de cultivo inicial puede simplificar el proceso de aislamiento de células epidérmicas de piel humana10, que también se ha utilizado con éxito para el aislamiento de células epiteliales gingivales11. Además, investigaciones previas realizadas por el grupo de Zubeldia-Plazaola y el grupo de Jin han indicado que Y-27632 tiene la capacidad de estimular el crecimiento in vitro rápido e ilimitado de células epiteliales primarias derivadas del tejido mamario 9,12. El presente estudio tuvo como objetivo probar si el uso de Y-27632 simplificaría el aislamiento y el cultivo de HMEC y establecimos con éxito un método simple y fácil de realizar para aislar HMEC de pequeños trozos (1 g) de tejido mamario.

<table><tbody><tr><td>0.05% Tripsina</td><td>Basalmedia</td><td>K431010</td><td>Para HMECs&nbsp; disociación</td></tr><tr><td>1,5 mL Microcentrífuga Tubos</td><td>NEST</td><td>081722CK01</td><td>Para digestión celular</td></tr><tr><td>100 y micro; Filtro de malla Solarbio</td><td>431752</td><td></td><td>Para la filtración de HMECs</td></tr><tr><td>Placa de cultivo celular de 100 mm</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>Para cultivo</td></tr><tr><td>celular Paraformaldehído al 4% solarbio</td><td></td><td>P1110-100ml</td><td>Para tinción por inmunofluorescencia para comprobar el marcador de diferenciación de HMECs Tubo de</td></tr><tr><td>centrífuga de 50 mL</td><td>Corning</td><td>430829</td><td>Para centrifugación celular</td></tr><tr><td>Filtro</td> <td>de célulasSolarbio</td><td>431752</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td> de filtración <td>celular Eppendorf</td><td>5404HN133048</td><td>Centrífuga de celda</td></tr><tr><td>CO2</td><td>Incubadora Thermo Scientific</td><td>42820906</td><td>Para la incubación de células</td></tr><tr><td>Colagenasa Tipo I</td><td>Merck</td><td>SKU:SCR103</td><td>Para el aislamiento de HMECs</td></tr><tr><td>Dispase&nbsp;</td><td>Solarbio</td><td>CAS:42613-33-2</td><td>Para el aislamiento de HMECs</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>8122622</td><td>Componente del medio de neutralización</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Gibco</td><td>2556132P</td><td>Componente del medio de neutralización</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Thermo Scientific</td><td>15140-122</td><td>Antibióticos</td></tr><tr><td>Solución tamponada de fosfato</td><td>Tecono 20201033</td><td></td><td>Solución de lavado</td></tr><tr><td>conejo anti CK7</td><td>abcam</td><td>ab68459</td><td>Para la tinción de inmunofluorescencia para comprobar el marcador de diferenciación de las HMECs</td></tr><tr><td>conejo anti GATA3</td><td>abcam</td><td>ab199428</td><td>Para la tinción de inmunofluorescencia para comprobar el marcador de diferenciación de las HMECs</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Solarbio</td><td>IY0040</td><td>Inhibidor de ROCK</td></tr></tbody></table>

aislamiento y cultivo de células epiteliales mamarias humanas primarias

Isolation and Culture of Primary Human Mammary Epithelial Cells

La glándula mamaria es una estructura fundamental de la mama y desempeña un papel esencial en la reproducción. Las células epiteliales mamarias humanas (HMEC), que son las células de origen del cáncer de mama y otras enfermedades inflamatorias relacionadas con la mama, han atraído una atención considerable. Sin embargo, el aislamiento y cultivo de HMECs primarias in vitro con fines de investigación ha sido un desafío debido a su naturaleza altamente diferenciada y queratinizada y su corta vida útil. Por lo tanto, el desarrollo de un método simple y eficiente para aislar y cultivar HMEC es de gran valor científico para el estudio de la biología mamaria y las enfermedades relacionadas con la mama. En este estudio, aislamos con éxito HMECs primarias de pequeñas cantidades de tejido mamario por digestión con una mezcla de enzimas combinada con un cultivo inicial en suero fetal bovino-DMEM al 5% que contenía el inhibidor de la quinasa asociada a Rho (ROCK) Y-27632, seguido de la expansión del cultivo en medio de queratinocitos libre de suero. Este enfoque promueve selectivamente el crecimiento de las células epiteliales, lo que resulta en un rendimiento celular optimizado. La simplicidad y conveniencia de este método lo hacen adecuado tanto para la investigación de laboratorio como para la clínica, que debería proporcionar información valiosa sobre estas importantes áreas de estudio.

En la figura 1 se muestra un esquema del procedimiento. El protocolo implica el uso de una combinación de enzimas, a saber, dispasa, colagenasa y tripsina. Esta combinación se utiliza con el propósito de separar la lámina epitelial de la capa de fibroblastos debajo de ella y, posteriormente, utilizar tripsina para disociar las células epiteliales mamarias en una suspensión. Además, se promovió eficazmente el crecimiento de las células epiteliales mediante la adición de Y-27632 al medio de cultivo inicial. Como resultado, este método produce una gran cantidad de HMEC, cumpliendo con los requisitos para el paso en solo un promedio de 10 días.
Para probar el papel crucial de Y-27632 en el crecimiento celular después del aislamiento, dividimos las células recién aisladas en dos grupos: un grupo se sembró con el medio inicial que contenía 10 mM Y-27632 (Figura 2A); el otro grupo se sembró con el medio inicial sin agregar Y-27632 como grupo control (Figura 2B). Después de 2 días de cultivo, las células de ambos grupos se cambiaron a medio celular epidérmico (Figura 1). A partir de la Figura 2, podemos observar que en comparación con el tercer día, el método con Y-27632 aumentó notablemente el número de HMECs en el noveno día. Los HMEC formaban un grupo cohesivo que se asemejaba a una isla que tenía límites distintos y fuertes conexiones entre las células. Estas células se expandieron hacia el exterior en el entorno circundante. Las células plateadas con Y-27632 (Figura 2A) crecieron mucho más rápido que las células del grupo de control (Figura 2B). Para confirmar que Y-27632 mejora el crecimiento de HMEC, las células P0 congeladas se descongelaron y se sembraron con o sin la adición de 10 mM de Y-27632, y se recogieron las células de paso 1 (P1) en diferentes días, como se muestra en la Figura 3. Las células se analizaron para determinar su viabilidad y proliferación mediante el uso del kit de recuento de células-8 (CCK-8). Como se muestra en la Figura 3, la tasa de crecimiento de las células tratadas con el medio que contiene Y-27632 fue significativamente mayor que la de las células del grupo control sin Y-27632. Tomando estos datos en conjunto, se puede ver que la adición de Y-27632 en el medio inicial mejora significativamente el crecimiento de las células unidas después del aislamiento.
Para verificar que las células obtenidas por este método son HMECs, realizamos un análisis de inmunofluorescencia de las HMECs P0 para dos marcadores de células epiteliales mamarias: CK7 y GATA3. CK7, una citoqueratina de importancia diagnóstica, es un marcador de diferenciación glandular en el epitelio mamario normal y sus procesos epiteliales proliferativos13. Además, Kouros-Mehr et al. han reportado que GATA3 funciona como un factor de transcripción dentro de las células epiteliales mamarias y está involucrado en el mantenimiento de la diferenciación epitelial luminal en glándulas mamarias completamente desarrolladas14. Como se muestra en la Figura 3, las células que cultivamos y expandimos expresan fuertemente tanto CK7 (Figura 4A) como GATA3 (Figura 4B). El análisis de cuantificación de las células positivas para CK7 y GATA3 mostró que más del 98% de las células expresaban tanto CK7 como GATA3 (Figura 4C), lo que indica una contaminación limitada de otros tipos de células, como los fibroblastos. Ocasionalmente observamos un número limitado de células similares a fibroblastos (morfología alargada) en el cultivo inicial (P0, Figura 2), pero rara vez vemos que estas células aparezcan en las células pasadas (P3, Figura 4D).
Para comprobar si la característica epitelial de las HMECs puede mantenerse después de varios pases, realizamos el análisis qRT-PCR de los marcadores de células epiteliales mamarias CK7 y GATA3 en las células cultivadas con o sin Y-27632 (Figura 5). Los niveles de expresión de CK7 y GATA3 no fueron significativamente diferentes en las células P0 y P3, con o sin Y-27632, lo que indica que sus características fenotípicas y de diferenciación no cambiaron con el tiempo durante la expansión del cultivo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66638/66638fig01.jpg"> Figura 1: Diagrama de flujo del protocolo para aislar y cultivar HMECs. Inicialmente, los fragmentos de tejido mamario femenino se cortaron con cuchillas quirúrgicas y se digierieron con una combinación de enzimas. Posteriormente, los pellets celulares obtenidos se cultivaron en un medio de cultivo inicial que contenía 10 mM Y-27632. Después de 2 días, el medio de cultivo inicial se reemplazó por medio de células epiteliales. Las células epiteliales mamarias se cultivaron en medio de células epidérmicas para lograr una cobertura satisfactoria después de ~ 8 días, ahora aptas para el paso. Si es necesario, algunas células pueden someterse a criopreservación celular. Abreviatura: HMECs = células epiteliales mamarias humanas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66638/66638fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66638/66638fig02.jpg"> Figura 2: Imágenes de HMECs obtenidas después de la inoculación inicial. Dentro de los 2 días posteriores a la inoculación, (A) las HMEC primarias se cultivaron en medio inicial que contenía Y-27632 y (B) las HMEC primarias se cultivaron en medio inicial sin Y-27632. Después de un período de cultivo de 48 h, se reemplazó el medio de cultivo de queratinocitos libres de suero en ambos grupos. Se tomaron fotos para registrar el estado de crecimiento de las células cada dos días. Ambas series de imágenes representativas se tomaron con un microscopio invertido (100x) en los días 3, 5 y 9 después de la inoculación. Barras de escala = 100 μm. Abreviatura: HMECs = células epiteliales mamarias humanas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66638/66638fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66638/66638fig03.jpg"> Figura 3: Crecimiento mejorado de los HMEC del Paso 1 (P1) con Y-27632. Las células P0 congeladas se descongelaron y cultivaron con o sin Y-27632. Las células (P1) se recolectaron a 1, 3, 5, 7 y 9 días y se analizó la absorbancia a 450 nm utilizando el kit CCK-8. El día 1, el número de células viables adherentes en el medio inicial que contenía Y-27632 fue significativamente mayor que el que no contenía Y-27632. Además, la curva de crecimiento de las células tratadas con Y-27632 mostró un aumento más pronunciado. **p &lt; 0,01, ***p &lt; 0,001. Abreviatura: HMECs = células epiteliales mamarias humanas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66638/66638fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66638/66638fig04.jpg"> Figura 4: Expresión de marcadores HMEC (P0). La expresión de CK7 y GATA3 en HMECs se analizó mediante tinción con inmunofluorescencia. Los HMEC se tiñeron para (A) CK7 (rojo) y (B) GATA3 (rojo); Se utilizó DAPI (azul) para teñir los núcleos. Las imágenes se tomaron utilizando un microscopio confocal de barrido láser (400x). Barras de escala = 20 μm. (C) El porcentaje de células positivas en la tinción; (D) la imagen representativa de los HMEC (P3). Barras de escala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66638/66638fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66638/66638fig05.jpg"> Figura 5: Expresión de CK7 y GATA3 de HMECs en P0 y P3. Uso de qRT-PCR para detectar la expresión de (A) CK7 en HMECs de P0 y P3 en el día 7, (B) GATA3 en HMECs de P0 y P3, (C) CK7 en HMECs P1 cultivadas con o sin Y27632 en el día 7, (D) GATA3 en HMECs P1 cultivadas con o sin Y-27632 en el día 7. nsp &gt; 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66638/66638fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

El presente estudio informa de un protocolo más fácil, económico y que ahorra tiempo para aislar y cultivar de manera eficiente células epiteliales mamarias humanas primarias (HMEC) a partir de pequeñas cantidades de tejido mamario. Este protocolo es adecuado para producir rápidamente HMEC primarios tanto para aplicaciones de laboratorio como clínicas.

Aislamiento y cultivo de células epiteliales mamarias humanas primarias

The mammary gland is a fundamental structure of the breast and plays an essential role in reproduction. Human mammary epithelial cells (HMECs), which are ...

Nuestra investigación se centra en dilucidar las vías de tratamiento de la mastitis granulomatosa refractaria. Aprovechar un enfoque integrador que combine las metodologías medicinales tradicionales chinas y occidentales simultáneamente expondrá los complejos mecanismos patogénicos que impulsan la enfermedad y sus complicaciones, con el objetivo de tratar de aliviar estos problemas y mejorar el pronóstico de los pacientes. Nuestra investigación informa de un protocolo más fácil, económico y que ahorra tiempo para aislar y cultivar de manera eficiente células epiteliales mamarias humanas primarias, o HMEC, a partir de una pequeña cantidad de tejido mamario.Este protocolo es adecuado para producir rápidamente HMEC primarios para aplicaciones clínicas y de laboratorio. Sobre la base de este estudio, nuestro objetivo es desarrollar un modelo de células epiteliales mamarias de mastitis granulomatosa para profundizar nuestra comprensión de la etiología y las estrategias de tratamiento validadas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

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Aprende a aislar y cultivar células epiteliales mamarias humanas primarias mediante disociación enzimática. Este protocolo eficiente permite obtener HMECs viables para investigar la mastitis granulomatosa y desarrollar estrategias terapéuticas.

Aislamiento y cultivo de células epiteliales mamarias humanas primarias

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