Evaluación de la ruptura de la barrera hematoencefálica en un modelo de ratón de lesión cerebral traumática leve

Buscamos comprender los intrincados mecanismos que subyacen a las lesiones cerebrales traumáticas leves causadas por la exposición a ondas de choque inducidas por explosiones. También estamos investigando métodos para aliviar estos síntomas. Ha sido una descripción exhaustiva de la fase inicial de la ruptura de la barrera hematoencefálica debida a ondas de choque inducidas por explosiones de baja intensidad.

En concreto, la degradación comienza bruscamente aproximadamente tres horas después de la exposición, y las lesiones afectadas se someten a una remodelación durante aproximadamente un día después de su aparición. Este método nos permite examinar la descomposición de la BBB con más detalle, proporcionando una métrica adicional para evaluar la efectividad de varios tratamientos que se pueden emplear en caso de una explosión. Para comenzar, prepare un tubo de choque para exponer al animal a las ondas de choque inducidas por la explosión.

Coloque el ratón anestesiado a cinco centímetros del extremo de salida del tubo de choque, asegurándose de que el eje de su cuerpo esté paralelo al eje del tubo, pero no alineado con él. A continuación, envíe una sola onda de choque con una sobrepresión máxima de 25 kilopascales a la cabeza del animal. Para la inyección de azul de Evans, prepare una solución salina de azul de Evans del 4% en peso por volumen.

Agite la solución en vórtice y guárdela en la oscuridad hasta que la use. Inyecte la solución azul de Evans en la vena de la cola a una dosis de 2,5 microlitros por gramo. Después de perfundir el ratón anestesiado con el tinte FITC-dextrano y el paraformaldehído, use tijeras quirúrgicas y pinzas para extraer cuidadosamente el cerebro.

Postfije el cerebro durante la noche en el mismo fijador a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, reemplace el fijador por PBS. Para empezar, obtenga el cerebro fijo de un ratón tratado con ondas de choque explosivas inyectado con azul de Evans y tintes FITC-dextrano.

Prepare una placa de 24 pocillos con 500 microlitros de glicerol al 20% en tampón de fosfato ajustado a pH 7,4 en cada pocillo. Con una cortadora de cerebros, corte el cerebro coronalmente en 12 rodajas, cada una de un milímetro de grosor. Transfiera cada rebanada al pocillo correspondiente de la placa de 24 pocillos y almacene la placa a cuatro grados centígrados durante al menos dos horas.

A continuación, sustituya la solución por un tampón de fosfato de glicerol al 50% y vuelva a almacenarla a cuatro grados centígrados durante al menos dos horas. Finalmente, reemplace la solución con 100% glicerol. Para una observación microscópica inmediata, deje reposar las rodajas durante al menos dos horas a temperatura ambiente.

Agregue 500 microlitros de glicerol al fondo de un plato con fondo de vidrio de 35 milímetros. Transfiera la rebanada de cerebro a la solución de glicerol y cubra la superficie con un cubreobjetos. Retire el exceso de glicerol del borde del cubreobjetos.

Mida la intensidad de fluorescencia del corte bajo un microscopio de fluorescencia. Después de la medición microscópica, regrese la rebanada al pozo del plato. Agregue 500 microlitros de tampón de fosfato a cada pocillo y almacene la placa de 24 pocillos a cuatro grados centígrados durante la noche.

Reemplace la solución con tampón de fosfato de glicerol al 30% e incube la placa a cuatro grados centígrados durante al menos dos horas antes de realizar la inmunohistoquímica El etiquetado azul de Evans demostró que la ruptura de la barrera hematoencefálica o BBB comenzó dentro de las seis horas posteriores a la exposición a la onda de choque explosiva y duró hasta siete días. Los puntos calientes de fluorescencia variaron en tamaño e intensidad, con puntos calientes solo de azul de Evans que indicaron la ruptura de la BBB durante la inyección de azul de Evans y la reparación después de la inyección de FITC-dextrano. Los grupos de astrocitos reactivos se asociaron estrechamente con los sitios de ruptura de la BHE confirmados por inmunohistoquímica.

Se observaron microglías activadas y microglías ameboideas junto con astrocitos reactivos tres días después de la exposición a la onda de choque de la explosión.