Name: Desarrollo de una sonda de microscopía de fuerza atómica biohíbrida basada en un aguijón de mosquitos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-26T14:40:00.000+00:00
Duration: 4 min 51 s
Description: Aprende a fabricar sondas biohíbridas de microscopía de fuerza atómica utilizando aguijones de mosquitos para estudiar mecanismos de picadura con precisión y reproducibilidad en investigación de enfermedades transmitidas por vectores.

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Los autores agradecen el apoyo financiero del Fondo de Nuevas Fronteras en Investigación (NFRF) de Canadá, el programa Discovery del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC) y las becas de formación de maestría del Fondo de Investigación de Naturaleza y Tecnologías de Quebec (FRQNT). Los autores también quieren agradecer al grupo del Prof. Yaoyao Zhao en McGill por su apoyo técnico en la impresión 3D de algunos componentes.

La especie de mosquito utilizada para este protocolo es una hembra adulta no infectada de Aedes aegypti (A. aegypti), recibida congelada y almacenada en un congelador a -20 °C. La especie fue proporcionada por el Centro de Recursos de Reactivos de Investigación de Filariasis de NIH/NIAID para su distribución a través de BEI Resources, NIAID, NIH: Aedes aegypti no infectado, cepa Black Eye Liverpool (Frozen), NR-48920. Los reactivos y equipos utilizados para el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Disección del labio de la probóscide
<ol><li>Con unas pinzas, coloque un mosquito muerto en un portaobjetos de vidrio bajo el microscopio y asegúrese de que haya una punta cónica en el extremo de la probóscide (Figura 2A).</li>
	<li>Mientras mantiene el mosquito en el portaobjetos de vidrio, coloque una hoja de bisturí suavemente sobre el labio cerca de la cabeza del mosquito (Figura 2B).</li>
	<li>Proceda a hacer una incisión a través de toda la mitad superior del labio (un corte de aproximadamente 80 μm) con una profundidad de penetración poco profunda a través del grosor del labio. Asegúrese de aplicar una ligera presión sobre la hoja para cortar solo el labio pero no el fascículo que se encuentra debajo.</li>
	<li>Con un par de pinzas, sujete firmemente la cabeza del mosquito y, con otro par de pinzas de precisión, pellizque ligeramente el labio en cualquier posición entre la punta cónica y la ubicación de la incisión (Figura 2B).<ol><li>Tire de las pinzas que sujetan el labio en la dirección de la punta cónica (Figura 2C). Continúe tirando de las pinzas hasta que el labio se haya desprendido y se haya retirado por completo del fascículo.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloque el mosquito bajo el microscopio y verifique si la punta del labrum está presente. Esto se puede identificar por la presencia de una punta cónica en el fascículo (Figura 2D).</li>
</ol>2. Separar la punta del labrum de los demás miembros del fascículo
<ol><li>Sujete y cierre las puntas de un juego de pinzas de precisión y coloque la punta de las pinzas justo al lado del labrum cerca de su punta.</li>
	<li>Utilice la punta de la pinza para aplicar una fuerza suave sobre el labrum en la dirección perpendicular a la longitud del fascículo (Figura 3A).</li>
	<li>Continúe empujando el labrum a través del portaobjetos de vidrio hasta que se logre la separación del labrum de los otros miembros del fascículo.</li>
	<li>Inspeccione la muestra bajo el microscopio para verificar que se haya logrado una separación adecuada entre el labrum y otros miembros del fascículo (Figura 3, izquierda). Si la separación no se realiza correctamente, consulte el paso 2.1.</li>
</ol>3. Cortar la punta del labrum
<ol><li>Mientras el labrum todavía está en el portaobjetos de vidrio, coloque una hoja de bisturí sobre el labrum a aproximadamente ~200 μm de distancia de la punta del labrum (Figura 4A). Aplique suavemente suficiente presión y corte la punta del labrum por completo. Si bien lo ideal es que la punta del labrum sea lo más corta posible, ~ 200 μm es lo mejor que puede manejar el enfoque actual.</li>
	<li>Mida la longitud del labrum cortado para asegurarse de que no supere los 300 μm (Figura 4B) utilizando cualquier software de medición digital. En este protocolo se utilizó ImageJ14.</li>
</ol>4. Agarrar la punta del labrum
<ol><li>Con un par de pinzas de precisión, localice y aísle la punta del labrum en el portaobjetos de vidrio. Deseche todas las partes que queden en el portaobjetos de vidrio que no sean la punta del labrum.</li>
	<li>Con las mismas pinzas de precisión, pellizque lenta y ligeramente el labrum para que el extremo cortado quede libre y no esté obstruido por las pinzas. Además, asegúrese de que la orientación del labrum sea paralela a la dirección de la longitud de las pinzas y que el extremo cortado del labrum apunte en dirección opuesta al cuerpo de las pinzas.</li>
	<li>Una vez que la muestra esté firmemente apretada, retire la fuerza de sujeción que mantiene unidas las puntas de las pinzas. La punta del labrum se pegará a una de las puntas de las pinzas.</li>
	<li>Bajo un microscopio, inspeccione las puntas de las pinzas y asegúrese de que la punta del labrum esté presente en una de las puntas de las pinzas (Figura 5). Si la punta del labrum no está en las pinzas, consulte el paso 4.2, y si la punta del labrum no está en las pinzas ni en el portaobjetos de vidrio, consulte el paso 1.</li>
</ol>5. Aplicación de epoxi en la viga en voladizo sin punta
<ol><li>Coloque una gota (~0,05 ml) de epoxi en el borde de un nuevo portaobjetos de vidrio fundiendo directamente el adhesivo desde su botella/recipiente original. Coloque el portaobjetos de vidrio que contiene epoxi debajo de la estación de sonda y concéntrelo.</li>
	<li>Monte el voladizo AFM sin punta en el conjunto de abrazadera asegurando la base (es decir, el extremo más grande), dejando el extremo del voladizo libre y suspendido en el espacio. Asegúrese de que la parte inferior del voladizo AFM esté hacia abajo.</li>
	<li>Monte el manipulador en la estación de sonda.</li>
	<li>Eleve el eje Z del manipulador a una posición en la que el voladizo sin punta esté unos milímetros por encima del portaobjetos de vidrio que contiene epoxi.</li>
	<li>Mueva manualmente el manipulador de modo que el voladizo sin punta sea visible en la vista de campo de la cámara en la estación de sonda.</li>
	<li>Con el manipulador, mueva el voladizo AFM a lo largo de las direcciones X e Y hasta que la punta del voladizo descanse directamente sobre el epoxi en el borde del portaobjetos de vidrio.</li>
	<li>Usando el manipulador nuevamente, baje lentamente el voladizo sin punta en la dirección Z sobre el borde del portaobjetos de vidrio.</li>
	<li>A medida que el voladizo se baja y se acerca al portaobjetos de vidrio, siga bajando el voladizo muy lentamente hasta que primero toque el epoxi. No baje más el voladizo.</li>
	<li>Con cuidado, active el manipulador para mover lentamente el voladizo en la dirección X o Y y retire el voladizo del charco de epoxi moviendo continuamente el voladizo en la dirección seleccionada hasta que el voladizo esté completamente separado del epoxi en el portaobjetos de vidrio. El voladizo sin punta debe tener una burbuja en miniatura de epoxi en su punta, visible debajo de la estación de sonda.</li>
	<li>Levante el voladizo en la dirección Z con el manipulador.</li>
</ol>6. Unir la punta del labrum a la viga en voladizo sin punta
<ol><li>Gire el manipulador alrededor del eje largo del voladizo 90 grados y apoye el manipulador en la estación de sonda de lado. En esta configuración, los espesores a lo largo de la longitud del voladizo AFM están en la dirección vertical.</li>
	<li>Coloque las pinzas de precisión que contienen la punta del labrum debajo de la cámara de la estación de sonda de modo que toda la longitud de la punta del labrum sea visible en el monitor de la computadora.</li>
	<li>Coloque el conjunto del manipulador que sujeta la abrazadera y el voladizo sin punta debajo de la cámara de la estación de sonda de modo que toda la longitud del voladizo sin punta sea visible en el monitor de la computadora.</li>
	<li>Enfoque el microscopio de la estación de sonda en la punta del labrum y en el voladizo sin punta.</li>
	<li>Oriente el voladizo perpendicularmente a la punta del labrum girando cuidadosa y manualmente el manipulador (Figura 6A).</li>
	<li>Usando los grados de libertad del manipulador, mueva lentamente el voladizo sin punta en las direcciones XY de modo que el pegamento del voladizo haga contacto con el extremo cortado de la punta del labrum (Figura 6B).</li>
	<li>Cura el epoxi, solidificando la intersección entre el voladizo y el labrum de los mosquitos.</li>
	<li>Una vez que el epoxi se haya curado, enganche suavemente el manipulador en las direcciones XY y aleje el voladizo de las pinzas, verificando que la punta del labrum esté ahora en la viga del voladizo sin punta (Figura 6C).</li>
</ol>

Sonda AFM biohíbrida con labrum de mosquitos para estudiar los comportamientos de picadura

<ol><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+vector+control+response+2017%E2%80%932030%5BTitle%5D)+AND+%22World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Global vector control response 2017–2030.</a> World Health Organization. , (2017).</li>
<li>Gurera, D., Bhushan, B., Kumar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+from+mosquitoes%E2%80%99+painless+piercing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mech+Behav+Biomed+Mater%22%5BJournal%5D)">Lessons from mosquitoes’ painless piercing.</a> J Mech Behav Biomed Mater. 84, 178-187 (2018).</li>
<li>Ma, G., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microneedle%2C+bio-microneedle+and+bio-inspired+microneedle%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journ+of+Contr+Relea%22%5BJournal%5D)">Microneedle, bio-microneedle and bio-inspired microneedle: A review.</a> Journ of Contr Relea. 251, 11-23 (2017).</li>
<li>Kong, X., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micronano+structure+and+mechanics+behavior+of+mosquito%E2%80%99s+proboscis+biomaterials+with+applications+to+microneedle+design%5BTitle%5D)+AND+%22Advan+Mater+Res%22%5BJournal%5D)">Micronano structure and mechanics behavior of mosquito’s proboscis biomaterials with applications to microneedle design.</a> Advan Mater Res. 299-300, 376-379 (2011).</li>
<li>Li, A. D. R., Putra, K. B., Chen, L., Montgomery, J. S., Shih, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito+proboscis-inspired+needle+insertion+to+reduce+tissue+deformation+and+organ+displacement%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Mosquito proboscis-inspired needle insertion to reduce tissue deformation and organ displacement.</a> Sci Rep. 10 (1), 12248(2020).</li>
<li>Meyer, E., Hug, H. J., Bennewitz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+Scanning+Probe+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning+Probe+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Introduction to Scanning Probe Microscopy.</a> Scanning Probe Microscopy. 1, 1-13 (2004).</li>
<li>García, R., Peréz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+atomic+force+microscopy+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Surf+Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Dynamic atomic force microscopy methods.</a> Surf Sci Rep. 47 (6), 197-301 (2002).</li>
<li>Thurner, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy+and+indentation+force+measurement+of+bone%5BTitle%5D)+AND+%22WIREs+Nanomed+and+Nanobio%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy and indentation force measurement of bone.</a> WIREs Nanomed and Nanobio. 1 (6), 624-649 (2009).</li>
<li>Müller, D. J., Dufrêne, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy+as+a+multifunctional+molecular+toolbox+in+nanobiotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotech%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy as a multifunctional molecular toolbox in nanobiotechnology.</a> Nat Nanotech. 3 (5), 261-269 (2008).</li>
<li>Hussain, D., Ahmad, K., Song, J., Xie, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+atomic+force+microscopy+for+-critical+dimension+metrology%5BTitle%5D)+AND+%22Meas+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">Advances in the atomic force microscopy for -critical dimension metrology.</a> Meas Sci Technol. 28 (1), 012001(2017).</li>
<li>Kong, X. Q., Wu, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito+proboscis%3A+An+elegant+biomicroelectromechanical+system%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+E%22%5BJournal%5D)">Mosquito proboscis: An elegant biomicroelectromechanical system.</a> Phys Rev E. 82 (1), 011910(2010).</li>
<li>Kong, X. Q., Wu, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+and+prediction+of+insertion+force+for+the+mosquito%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bionic+Eng%22%5BJournal%5D)">Measurement and prediction of insertion force for the mosquito.</a> J Bionic Eng. 6 (2), 143-152 (2009).</li>
<li>Ramasubramanian, M. K., Barham, O. M., Swaminathan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+a+mosquito+bite+with+applications+to+microneedle+design%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinspir+Biomim%22%5BJournal%5D)">Mechanics of a mosquito bite with applications to microneedle design.</a> Bioinspir Biomim. 3 (4), 046001(2008).</li>
<li>Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ user guide. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://imagej.nih.gov/ij/docs/guide">http://imagej.nih.gov/ij/docs/guide</a> (2012).</li>
<li>Dai, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+surface+measurements+at+sidewalls+of+nano-+and+micro-structures%5BTitle%5D)+AND+%22Measur+Sci+and+Technol%22%5BJournal%5D)">Nanoscale surface measurements at sidewalls of nano- and micro-structures.</a> Measur Sci and Technol. 18 (2), 334-341 (2007).</li>
</ol>

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que declarar.

El paso 1 del protocolo está destinado a limpiar la muestra biológica del labio no deseado. Para ello, se realiza una incisión en el labio, pero no en el fascículo, que descansa directamente debajo del labio (Figura 1). Debido a que el fascículo y el labio no están unidos en su interfaz (es decir, el labio puede deslizarse libremente a lo largo del fascículo y solo se mantiene en su lugar mediante su unión a la cabeza del mosquito), la incisión realizada está destinada a separar parte del labio de la cabeza del mosquito, facilitando así la eliminación de la cubierta exterior. A medida que se extrae el labio de la muestra, el técnico debe experimentar una ligera resistencia causada por la mitad inferior del labio aún adherida al mosquito. Se espera que esta fuerza de resistencia se libere con relativa facilidad porque la incisión promoverá la propagación del material biológico por grietas, induciendo así que el segmento no cortado del labio se desgarre y haga que todo el labio se deslice fuera del fascículo durante la acción de tracción. Si se realiza una incisión insuficiente, el técnico puede experimentar una resistencia excesiva durante la extracción y se le recomienda intentar otra incisión antes de continuar con el protocolo.
Es importante ejercitar un tacto suave y paciencia en los pasos 1 y 4 al manipular el labrum pellizcando con pinzas. Aunque el labrum es relativamente resistente, aún puede sufrir daños si las pinzas lo comprimen de manera demasiado agresiva. Se guía al técnico para que pellizque ligeramente el labio/labrum, lo que significa que debe ejecutar la cantidad mínima de fuerza necesaria en las pinzas para sujetar el labio/labrum. La evaluación de la presencia de daño se puede realizar al final del paso 1 y el paso 4 al inspeccionar la muestra bajo el microscopio. Se aconseja inspeccionar la probóscide en busca de anomalías a lo largo de su longitud (es decir, abolladuras, rasgaduras, separaciones en segmentos). Si se sospecha que una muestra está dañada en la punta del labrum, deséchela y reinicie el protocolo.
Los pasos clave del proceso del protocolo, como el paso 3 y el paso 6, requieren un cuidado especial. Para realizar el paso 3, la punta del labrum debe cortarse manualmente con un bisturí. Cortar demasiado corto hará que el resto del experimento sea exponencialmente más difícil porque puede ser demasiado pequeño para manipularlo. Por el contrario, si la punta supera los 300 μm de longitud, se vuelve demasiado larga para ser montada en el voladizo AFM debido al excesivo desplazamiento perpendicular que se introduce entre la punta del labrum y el voladizo AFM. Este desplazamiento se debe a imperfecciones en el proceso de montaje y/o a una curvatura que puede estar presente en la muestra, que se vuelven problemáticas a mayores longitudes de labrum. Además, los voladizos con puntas muy largas también serán muy difíciles de usar debajo del AFM. Durante el paso 3, es importante tener en cuenta que es probable que todos los fascículos de estilete (labrum, maxilares, mandíbulas e hipofaringe) se corten en este procedimiento. El labrum se localizará y aislará fácilmente de los estiletes restantes en el paso 4 debido a la separación manual que se realizó durante el paso 2. En el paso 6, aunque es casi imposible asegurar que la punta sea perfectamente normal al voladizo bajo un microscopio óptico, todavía es necesario minimizar el ángulo de inclinación para evitar condiciones de carga no deseadas en el uso futuro.
También es importante elegir el epoxi adecuado para la fijación del aguijón al voladizo AFM. Se probaron varios epoxis de dos partes de curado lento, que luego se demostró que no eran ideales porque cualquier pequeña vibración del suelo del laboratorio durante el proceso de curado puede hacer que el experimento falle. Por lo tanto, finalmente se adoptó un epoxi curable por UV. El adhesivo utilizado es un epoxi de baja viscosidad y curado rápido que es capaz de curar dentro de los 5 segundos de exposición a los rayos UV. Tras la solidificación, el pegamento se vuelve muy rígido y tiene una excelente resistencia, lo que hace que la sonda labrum-voladizo fabricada se comporte como un solo cuerpo y no falle ni se deforme en el lugar de la adhesión. Esta opción proporcionó suficiente tiempo antes del curado para configurar la configuración en la posición adecuada para adherir el aguijón al voladizo AFM (paso 6.3) y eliminar cualquier problema relacionado con las vibraciones ambientales debido a su comportamiento de curado a pedido.
El resto de los equipos cruciales de este protocolo son la estación de sonda, las pinzas afiladas y el voladizo. La estación de sonda utilizada está equipada con una lente 5x montada en la cámara; Sin embargo, no es esencial utilizar este modelo exacto de estación de sonda para este protocolo. Al seleccionar la estación de sonda, la única prioridad es garantizar una visibilidad clara y fácil del voladizo AFM y el labrum. Las pinzas afiladas utilizadas tenían un tamaño de punta de 0,5 mm por 0,1 mm. Es imprescindible el uso de pinzas de esta dimensión de punta o similares porque el uso de pinzas con una finura más baja puede provocar dificultades durante la manipulación del labrum. El voladizo utilizado en este protocolo se obtiene de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales). Este modelo de voladizo fue seleccionado debido a su alta rigidez, ya que se debe transferir una gran fuerza a la punta de la sonda del mosquito para emular la penetración de la piel en la vida real. En general, para todas las sondas basadas en aguijón, un voladizo AFM no puede ser demasiado blando porque la falta de rigidez provocará la flexión del voladizo durante la prueba AFM, lo que a su vez conducirá a una falta de desarrollo de presión en la punta de la sonda de aguijón. Esto hará que la sonda imite incorrectamente el proceso de picadura, lo que hace que los voladizos AFM sin punta altamente rígidos sean un requisito para este protocolo.
En resumen, el uso de una sonda AFM biohíbrida basada en aguijón tiene beneficios únicos para estudios cuantitativos de penetración/picadura mecánica en comparación con otros métodos que requieren mosquitos vivos y voluntarios humanos 4,11,12 para realizar estudios similares. La resolución de detección ultra alta de AFM puede permitir la medición con una precisión sin precedentes, y la sonda biohíbrida permite una emulación casi realista de escenarios reales de mordida, incorporando un número estadísticamente significativo de mediciones sin necesidad de voluntarios humanos 4,11,12. Además, los materiales utilizados para la fabricación de microagujas de ingeniería suelen ser propensos a fracturarse o pandearse 3,4, lo que no es representativo de la probóscide del mosquito. El uso de las partes del mosquito se asemeja mejor al escenario real de picaduras. Este protocolo puede desarrollarse y automatizarse potencialmente para una producción de alto rendimiento. Por último, el protocolo desarrollado podría utilizarse potencialmente para producir otras sondas AFM biohíbridas utilizando aguijones de diferentes animales para estudios cuantitativos de diversos comportamientos de mordida/penetración.

La Organización Mundial de la Salud (OMS) informó que las enfermedades transmitidas por vectores (VBD) representan más del 17% de todas las enfermedades infecciosas, que causan más de 7.00.000 muertes por año en todo el mundo. Por ejemplo, como el animal más mortífero del mundo, los mosquitos propagan numerosos patógenos, como el dengue, la malaria y el zika, a través de los artrópodos que se alimentan de sangre, lo que resulta en 700 millones de infeccionescada año. Las exploraciones hacia el desarrollo de medidas efectivas para prevenir las VBD son de crucial importancia, incluida la imitación de los comportamientos de penetración de los mosquitos para investigar sus mecanismos de picadura y estudios de barreras potenciales para demostrar su eficacia en la prevención de la penetración. Un desafío clave es desarrollar enfoques adecuados para llevar a cabo tales investigaciones. Se han realizado esfuerzos en la literatura, incluido el desarrollo de agujas a microescala que se asemejan a la geometría de un aguijón de mosquito; sin embargo, muchos de los materiales utilizados para fabricar estas microagujas (es decir, materiales viscoelásticos2, silicio (Si), vidrio, cerámica3, etc.) tienen propiedades mecánicas diferentes a las del material biológico de la probóscide del mosquito. Los materiales de ingeniería pueden ser frágiles y propensos a fracturarse y pandearse 3,4, mientras que la probóscide del mosquito puede resistir mejor la fractura o el pandeo4. La ventaja de tener una sonda biohíbrida que utiliza el labrum de un mosquito en lugar de materiales de ingeniería es que puede ser una representación más precisa del mecanismo de perforación de los mosquitos. Además, se deben integrar herramientas especializadas con microagujas para realizar estudios cuantitativos, como la medición precisa de la fuerza5, que no se puede lograr fácilmente con configuraciones personalizadas que utilizan microagujas diseñadas.
El enfoque basado en la microscopía de fuerza atómica (AFM) es prometedor porque funciona mediante el empleo de un voladizo con una punta ultrafina que se coloca cuidadosamente cerca de la superficie de una muestra. La punta puede escanear a través o ser presionada hacia/dentro de una superficie, experimentando diferentes fuerzas de atracción o repulsión debido a sus interacciones con una muestra6. Estas interacciones conducen a la deflexión del voladizo, que es rastreada por el reflejo de un rayo láser desde la parte superior del voladizo en un fotodetector6. La excepcional sensibilidad al movimiento del sistema permite a AFM realizar una amplia gama de mediciones, que incluyen, entre otras, el mapeo morfológico con precisión de pisómetro, mediciones de fuerza que van desde piconewtons hasta micronewtons, e investigaciones multifísicas exhaustivas7. Por ejemplo, las indentaciones de AFM se pueden realizar para evaluar con precisión la respuesta a la fuerza aplicada de una muestra y también para medir la dureza, elasticidad y otras propiedades mecánicas de una muestra mediante el acoplamiento con modelos analíticos apropiados8. La sonda del AFM está hecha más comúnmente de silicio (Si) o nitruro de silicio (Si3N4)8 con una longitud de 20-300 μm9 y un radio de punta del orden de varios a decenas de nanómetros10. El radio de la punta a escala nanométrica puede ser ideal para aplicaciones como imágenes de alta resolución; Sin embargo, no posee las características de los aguijones biológicos para los estudios que intentan imitar los comportamientos de penetración en términos de rigidez, radio, forma y relación de aspecto. Por ejemplo, la estructura de la microaguja de un mosquito es el fascículo, que tiene una relación de aspecto de ~6011 (longitud ~1,5 mm a 2 mm; diámetro ~30 μm)12. Si bien se puede suponer que una sonda AFM convencional se asemeja a un aguijón biológico como un labrum, sus distintas propiedades y dimensiones del material no reflejarán la situación real durante una mordedura.
Para permitir investigaciones cuantitativas de comportamientos de penetración que imitan mordeduras biológicas de insectos u otros animales con aguijones, aquí se desarrolla un proceso para fabricar voladizos AFM biohíbridos con un aguijón biológico como punta. Como caso de estudio, se demostró con éxito un voladizo de AFM con la punta de un labrum de mosquitos adherida. Aprovechando la información existente de la literatura sobre las fuerzas de inserción típicas que utiliza un mosquito para perforar la piel de una víctima12,13, este voladizo de AFM biohíbrido puede permitir potencialmente la imitación casi real de las picaduras de mosquitos bajo una AFM regular. El protocolo de aprovechamiento de aguijones microbiológicos para fabricar voladizos AFM biohíbridos también se puede aplicar al desarrollo de otros voladizos AFM biohíbridos basados en aguijones afilados para investigaciones cuantitativas de una variedad de mecanismos de mordida.
Terminologías En la Figura 1 se muestra un esquema de una probóscide y sus componentes de interés, y sus definiciones son (1) Probóscide: una parte del cuerpo de la boca de un mosquito que permite que el mosquito se alimente a sí mismo, con una estructura núcleo-concha compuesta por el fascículo (núcleo) y el labio (caparazón), (2) Labio: la cubierta exterior oscura y roma de una probóscide2, (3) Fascículo: un grupo de agujas delgadas contenidas en el interior del labio, incluyendo dos maxilares, dos mandíbulas, una hipofaringe y un labrum2, (4) Hipofaringe: responsable de secretar saliva en el torrente sanguíneo del huésped2, (5) Maxilares: miembro dentado que ayuda en el mecanismo de alimentación2, (5) Mandíbulas: similares al maxilar, ayudan al mosquito en el mecanismo de alimentación y tienen una punta afilada2, (6) Labrum: el miembro principal para penetrar la piel de una víctima, que es mucho más grande que los maxilares, las mandíbulas y la hipofaringe. También tiene estructuras sensoriales que le permiten encontrar vasos sanguíneos y canales internos debajo de la piel2, (7) Manipulador: un conjunto con tres grados de libertad y precisión a escala de micras para el posicionamiento, lo que permite el movimiento en direcciones XYZ, (8) Conjunto de abrazadera: una abrazadera de 2 partes hecha a medida montada en el manipulador utilizada para sujetar el voladizo AFM sin punta durante el experimento.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; 5-SA-SE Pinzas rectas cónicas de punta ultrafina</td><td>Excelta</td><td>N/A</td><td>Para manipular/diseccionar la probóscide.</td></tr><tr><td>Estación de sonda C-4D</td><td>Everbeing Int' l Corp&nbsp;</td><td>N/A</td><td>Se utiliza para el montaje de AFM.</td></tr><tr><td>Modo de roscado sin punta Voladizo</td><td>NanoAndMore USA</td><td>TL-NCH</td><td>AFM voladizo utilizado para montar el labrum. Las especificaciones se muestran aquí: Shape: Beam Force Constant: 42 N/m (10 - 130 N/m) Frecuencia de resonancia: 330 kHz (204 - 497 kHz) Longitud: 125 y micro; m (115 - 135 y micro; m) Width: 30 &micro; m (22,5 - 37,5 y micro; m) Espesor</fuerte>: 4 y micro; m ( 3 - 5 y micro; m)</td></tr> <tr><td>UV Expoxy</td><td>Vamos a resinar</td><td>ALR00146</td><td>para la fijación del aguijón.</td></tr></tbody></table>

desarrollo de una sonda de microscopía de fuerza atómica biohíbrida basada en un aguijón de mosquitos

Development of a Bio-Hybrid Mosquito Stinger-Based Atomic Force Microscopy Probe

Los mosquitos, conocidos por ser los animales más mortíferos para los humanos debido a su capacidad de transmitir enfermedades, representan un desafío persistente para la salud pública. La estrategia de prevención primaria que se utiliza actualmente consiste en el uso de repelentes químicos, que a menudo resultan ineficaces ya que los mosquitos desarrollan resistencia rápidamente. En consecuencia, la invención de nuevos métodos preventivos es crucial. Tal desarrollo depende de una comprensión profunda de los comportamientos de picadura de mosquitos, lo que requiere una configuración experimental que replique con precisión escenarios reales de picaduras con parámetros de prueba controlables y mediciones cuantitativas. Para cerrar esta brecha, se diseñó una sonda de microscopía de fuerza atómica (AFM) biohíbrida, con un aguijón biológico, específicamente, un labrum de mosquitos, como punta. Esta sonda biohíbrida, compatible con los sistemas AFM estándar, permite una simulación casi auténtica de los comportamientos de penetración de los mosquitos. Este método supone un paso adelante en el estudio cuantitativo de los mecanismos de picadura, lo que podría conducir a la creación de barreras eficaces contra las enfermedades transmitidas por vectores (VBD) y abrir nuevas vías en la lucha contra las enfermedades transmitidas por mosquitos.

Las imágenes de microscopía electrónica de barrido (SEM) de la sonda AFM biohíbrida fabricada se pueden encontrar en la Figura 7. El extremo del labrum se pegó con éxito a la viga en voladizo sin punta. Debido a la curvatura natural de los aguijones de mosquitos y a la operación manual del protocolo presentado, es extremadamente difícil obtener un voladizo con una punta de aguijón perfectamente perpendicular al voladizo. El ángulo descentrado entre el aguijón y una línea central imaginaria perpendicular al voladizo suele ser de ~10 grados. Si bien parece un problema común cuando se monta una sonda en un voladizo AFM15, la inclinación involuntaria debe tenerse en cuenta al realizar un análisis de fuerza / tensión. Sería interesante que los estudios futuros se centraran en mejorar el protocolo de fabricación y realizar estudios utilizando la sonda biohíbrida. Este es el primer intento de hacer una sonda AFM biohíbrida utilizando el aguijón de un insecto.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66675/66675fig01.jpg"> Figura 1: Esquema de la probóscide de un mosquito. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66675/66675fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66675/66675fig02.jpg"> Figura 2: Extracción del labio de una probóscide de mosquito. (A) Un mosquito con una probóscide completa que muestra la presencia de la punta cónica intacta. (B) La ubicación de la incisión del labio y la colocación de la pinza en el labio durante el proceso de extracción del labio. (C) La dirección de la tracción de la pinza durante la extracción del labio. (D) El fascículo final disecado con una punta intacta después de la extracción del labio, con la punta del labrum cónica aún presente e intacta. Barras de escala: 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66675/66675fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66675/66675fig03.jpg"> Figura 3: Separación del labrum de los miembros del fascículo no deseados. (A) Ubicación de la colocación de la pinza y dirección del empuje de la pinza como técnica para separar los miembros del fascículo de la probóscide. (B) Probóscide después de ser manipulada para separar el labrum de otros miembros del fascículo. Barras de escala: 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66675/66675fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66675/66675fig04.jpg"> Figura 4: Aislamiento de la punta del labrum deseada para el montaje en el voladizo AFM. (A) La ubicación de la incisión del labrum para la extracción de la punta del labrum. Barra de escala: 200 μm. (B) La punta del labrum, una vez cortada del cuerpo del labrum, mide aproximadamente 200-300 μm de longitud. Barra de escala: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66675/66675fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66675/66675fig05.jpg"> Figura 5: Montaje de la punta del labrum en una pinza antes del proceso de pegado. La punta del labrum se pegó a una de las puntas de las pinzas, con el extremo sin cortar del labrum libre y apuntando en dirección opuesta al cuerpo de las pinzas. Barra de escala: 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66675/66675fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66675/66675fig06.jpg"> Figura 6: Secuencia para montar la punta del labrum en el voladizo sin punta. (A) Orientar el voladizo sin punta en posición perpendicular con respecto al labrum. (B) Fusionar el voladizo sin punta con el labrum y curar el adhesivo epoxi utilizado para solidificar la unión entre los dos componentes. (C) La sonda AFM biohíbrida curada final sin que el labrum esté soportado por la pinza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66675/66675fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66675/66675fig07.jpg"> Figura 7: Imágenes SEM de la sonda AFM biohíbrida. (A) Una vista global de la punta del labrum y el voladizo sin punta. Barra de escala: 200 μm. (B) Una vista ampliada de la punta del labrum. Barra de escala: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66675/66675fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Las investigaciones cuantitativas y controladas sobre los comportamientos de picadura de insectos son cruciales para diseñar estrategias efectivas para combatir las enfermedades transmitidas por vectores. En este contexto, se introduce un método para fabricar una sonda de microscopía de fuerza atómica (AFM) biohíbrida.

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Estamos buscando desarrollar un voladizo AFM para estudiar potencialmente cuantitativamente los mecanismos de picadura del mosquito. Nuestro protocolo ofrece un nuevo método para crear sondas AFM precisas, controlables y fiables con el fin de estudiar los procesos de mordedura o picadura de animales. Nuestro protocolo tiene como objetivo simular con precisión el proceso de mordida de los animales, lo que hace que las metodologías actuales sean incontrolables, reproducibles de manera confiable o, en ciertos casos, completamente inexactas.El impacto de nuestro trabajo es doble. En primer lugar, creamos un protocolo que permite a otros investigadores fabricar sus propios voladizos AFM biohíbridos personalizados. En segundo lugar, nuestro trabajo allana el camino para la creación de otros protocolos que fusionan los sistemas de pruebas con material biológico para crear escenarios de prueba más realistas.

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