Name: Método de bioimpresión de alto rendimiento para modelar la permeabilidad vascular en placas estándar de seis pocillos con flexibilidad de tamaño y patrón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: Aprende bioimpresión 3D de alto rendimiento para modelar permeabilidad vascular en placas de seis pocillos. Este método automatizado mejora la reproducibilidad y permite análisis en tiempo real para desarrollo terapéutico.

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1. Generación de código G para la bioimpresora
<ol><li>Para generar y visualizar la ruta de impresión, visite una herramienta de simulación de código G en línea (por ejemplo, NCviewer).</li>
	<li>Haga clic en el icono Nuevo archivo en la interfaz para crear un nuevo archivo de código G.</li>
	<li>Genere una ruta de impresión escribiendo manualmente los comandos de código G para el canal de sacrificio y la cámara de silicio. Utilice las dimensiones de una placa estándar de seis pocillos como referencia para crear la geometría. NOTA: El código G utilizado aquí se basa en el código de control numérico por computadora (CNC). Las funciones de cada comando se proporcionan en la Tabla Suplementaria S1. Se seleccionó el formato de placa de seis pocillos debido a su compatibilidad con los lectores de microplacas comerciales y las configuraciones de microscopía y su capacidad para acomodar volúmenes adecuados de medio para apoyar la maduración del endotelio, minimizando así la necesidad de cambios frecuentes de medio. Este protocolo de fabricación también se puede adaptar para su uso con otras placas de pocillos estándar.</li>
	<li>Una vez completado el código G, haga clic en el icono Guardar archivo en la interfaz para descargar el archivo con una extensión .nc. NOTA: Se puede utilizar cualquier otro algoritmo de generación de código G disponible para generar las rutas de impresión. La geometría del canal vascular se puede manipular en este código G.</li>
</ol>2. Preparación de tintas de sacrificio y de cámara de silicona
NOTA: Las fuentes de todos los materiales utilizados en este protocolo se enumeran en la Tabla de Materiales.
<ol><li>Combine dos tipos de polímeros de silicona, SE1700 y polidimetilsiloxano (PDMS), en una proporción de 10:2. Agregue el agente de curado de cada polímero en una proporción de 10:1, polímero a agente de curado.</li>
	<li>Utilice un mezclador planetario para mezclar y desgasificar completamente la mezcla de polímeros a 2.000 rpm.</li>
	<li>Con una espátula, transfiera el polímero de silicona mezclado a una jeringa desechable de 10 ml. Centrifugar la jeringa cargada a 400 × g durante 3 min a 5 °C para garantizar una consistencia uniforme y evitar burbujas durante la impresión. NOTA: La tinta de la cámara debe usarse dentro de las 2 horas posteriores a la adición de los agentes de curado para garantizar una calidad de impresión óptima. Guarde la jeringa a 5 °C mientras la prepara para la impresión. Este proceso ayuda a ralentizar el curado de la tinta, que de otro modo podría alterar los parámetros de impresión.</li>
	<li>Pesar Pluronic F-127 (PF127) para preparar una solución madre al 40% (p/v) de PF127 en agua destilada.</li>
	<li>Mezclar la solución PF127 en una batidora planetaria durante 3 min a 400 × g para lograr la homogeneidad. Mantenga la mezcla homogeneizada a 4 °C para la disolución completa de PF127.</li>
	<li>Prepare una solución madre de trombina de 1.000 unidades/mL en solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco. NOTA: Almacene la solución madre de trombina en alícuotas de 100 μL para evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación. Las alícuotas deben almacenarse a -20 °C durante no más de 6 meses.</li>
	<li>Antes de imprimir, prepare la tinta de sacrificio mezclando trombina en una dilución 1:10 con PF127 hasta una concentración de trabajo final de 36% (p/v) para PF127 y 100 unidades/mL para trombina. Para preparar 1 ml de tinta de sacrificio, mezcle 100 μl de solución madre de trombina con 900 μl de solución madre PF127. NOTA: Al preparar la tinta de sacrificio para imprimir una sola plancha, un volumen total de 1 mL es más que suficiente.</li>
</ol>3. Proceso de fabricación
<ol><li>Antes de comenzar el proceso de fabricación, trate una placa de seis pocillos con plasma de oxígeno (O2) a una potencia de 100 vatios durante 1 minuto.</li>
	<li>Siga el procedimiento descrito en la sección 2 para preparar tanto las tintas de sacrificio como las de silicona, asegurándose de que las tintas estén libres de burbujas y se mezclen homogéneamente para una impresión uniforme. Cargue con cuidado las tintas en el cabezal de impresión de la bioimpresora. Ajuste la temperatura del cabezal de la bioimpresora a 37 °C para la tinta de sacrificio y a 5 °C para la tinta de silicona.</li>
	<li>Coloque una boquilla cónica de rosca doble de doble tornillo de 22 G en la jeringa de silicona. Para la tinta de sacrificio, elija el tamaño de la boquilla de acuerdo con el diámetro de canal deseado. NOTA: Aquí, demostramos tres tamaños de boquillas: 18 G, 20 G y 22 G. Los parámetros de impresión óptimos, incluida la presión de impresión y la velocidad del cabezal de impresión, se describen en la Tabla 1.</li>
	<li>Cargue el código G deseado y pulse la función servo ready en la interfaz de software de la bioimpresora durante 3 s. Coloque la placa en la plataforma en el punto de inicio del código G y haga clic en iniciar para iniciar el proceso de impresión. NOTA: Normalmente, la fabricación de una placa que contiene seis cámaras requiere aproximadamente 1 h y 10 min. El paso 3.4, que implica la carga y ejecución del código G, está sujeto a variaciones en función de la bioimpresora específica utilizada. Asegúrese de que se mantengan las condiciones estériles mientras se utiliza la bioimpresora para evitar la contaminación.</li>
	<li>Coloque una tapa sobre la placa y transfiera la placa a una incubadora de CO2 humidificada a 37 °C durante 72 h para curar las cámaras de silicona. NOTA: Aunque el curado del silicona puede ocurrir a un ritmo más lento dentro de la incubadora, la placa no debe colocarse dentro de un horno seco.</li>
</ol>4. Preparación de hidrogel e inclusión de canales
<ol><li>Prepare un tubo cónico de 50 mL que contenga 20 mL de 1x PBS. Coloque 0,01 g de fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato de litio (LAP) en el tubo cónico para hacer una solución de LAP al 0,05% (p/v). Vórdelo hasta que el polvo se disuelva por completo. NOTA: Envuelva el tubo cónico en papel de aluminio para evitar la exposición a la luz. Almacene la solución madre de LAP a 4 °C.</li>
	<li>Añadir 3 g de metacrilato de gelatina (GelMA) y 0,2 g de fibrinógeno a 20 mL de solución de LAP para conseguir una concentración final de 15% de GelMA y 1% de fibrinógeno (denominado GelFib). Coloque la mezcla en un baño de agua a 37 °C y mezcle periódicamente en vórtice hasta que la solución se disuelva por completo.</li>
	<li>Después de la fabricación, como se describe en la Sección 3, agregue 300 μL de GelFib precalentado en cada cámara de hidrogel para incrustar el patrón de sacrificio. Reticulación rápida del GelMA con luz ultravioleta (UV) a una longitud de onda de 405 nm con una intensidad de 85 mW/cm2 durante 120 s. Repita este procedimiento para todos los demás pozos. NOTA: El fibrinógeno se entrecruza rápidamente al entrar en contacto con el patrón de sacrificio que contiene trombina. Recomendamos agregar hidrogel y realizar la reticulación UV individualmente para cada pocillo para evitar la gelificación no deseada de GelMA a temperatura ambiente. Además, se deben mantener condiciones estériles para evitar la contaminación durante el proceso de curado UV.</li>
	<li>Agregue 1 mL de DPBS a cada lado del canal vascular en cada pocillo y mantenga la placa a 4 °C durante 15 min para licuar el PF127.</li>
	<li>Después de 15 minutos, succione el DPBS y repita el paso 4.5 3 veces para completar el lavado de PF127.</li>
	<li>Antes de introducir las células en los canales, perfunda DMEM F12 que contiene un 1% de Matrigel durante 30 minutos a través de los canales para mejorar la adhesión celular.</li>
</ol>5. Cultura HUVEC
<ol><li>Precaliente el medio de crecimiento de células endoteliales (ECGM) en un baño de agua a 37 °C durante 30 min.</li>
	<li>Mientras tanto, recupere un vial de HUVEC criopreservados del tanque de nitrógeno, afloje suavemente la tapa del vial y luego vuelva a apretarla para liberar nitrógeno de las roscas. Descongele inmediatamente las células sumergiendo el vial en un baño de agua a 37 °C durante 2 min, asegurándose de que quede una pequeña cantidad de hielo dentro del vial. Enjuague el vial con etanol al 70% para evitar la contaminación. NOTA: Use gafas de seguridad cuando recupere celdas del tanque de nitrógeno. La tapa del vial debe mantenerse por encima del nivel del agua durante este proceso.</li>
	<li>Prepare un tubo cónico de 15 mL que contenga 5 mL de ECGM precalentado. Con una micropipeta, transfiera con cuidado las células descongeladas del vial al tubo cónico. Para asegurarse de que no queden células, agregue 1 ml de medio fresco precalentado al criovial, enjuague el interior y transfiera las células restantes al tubo cónico.</li>
	<li>Centrifugar el tubo cónico a 200 × g durante 3 min para obtener un pellet de celda. Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender las células en 10 mL de medio fresco, transfiera las células a un matraz T75 y coloque el matraz dentro de una incubadora de CO2 humidificada a 37 °C. NOTA: Este paso es importante para eliminar el dimetilsulfóxido presente en el medio de congelación en el criovial mediante centrifugación.</li>
	<li>Refresque el medio cada dos días hasta que las células alcancen el 80-90% de confluencia.</li>
</ol>6. Endotelización de canales
<ol><li>Precaliente ECGM, DPBS, solución neutralizante de tripsina y ácido etilendiaminotetraacético (TE) de tripsina en un baño de agua a 37 °C durante 30 min.</li>
	<li>Con una confluencia del 90%, enjuague las células en un matraz T75 con 10 mL de DPBS, agregue 1 mL de TE al 0,25% al matraz e incube durante 3 min.</li>
	<li>Golpee suavemente los lados del matraz y agregue 5 mL de solución neutralizante de tripsina para neutralizar el TE. Transfiera las células a un tubo cónico de 15 mL. Utilice 5 ml de ECGM fresco para recoger las células restantes y añadirlas al tubo cónico.</li>
	<li>Centrifugar el tubo cónico a 250 × g durante 3 min para recoger el pellet de la célula.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 1 mL de ECGM fresco. Cuente las células con un hemocitómetro y repita el paso 6.4 para obtener una pastilla de células. Resuspenda 3 millones de células en 90 μL de ECGM fresco.</li>
	<li>Antes de introducir la suspensión celular en el canal, aspire brevemente el canal para despejar el lumen. NOTA: Evite la succión prolongada del canal para evitar dañar su integridad.</li>
	<li>Cargue suavemente el canal con una suspensión de celdas a una densidad de siembra de 0,5 millones de celdas por pocillo. Utilice una micropipeta para añadir ~15 μL de esta suspensión para llenar el canal. NOTA: La densidad de siembra puede variar dependiendo del tamaño del canal. Esta densidad está optimizada para un canal impreso con una boquilla de 20 G y un diámetro interno de aproximadamente 900 μm.</li>
	<li>Coloque la placa plana dentro de la incubadora durante 2 h. Posteriormente, invierta la placa a 180°, manteniéndola en posición plana durante las siguientes 2 h.</li>
	<li>Después de 4 h, lavar el canal con DPBS para eliminar las células no adherentes y muertas. Agregue 2 mL de ECGM fresco a cada pocillo (1 mL a cada lado del canal). Inicie el cultivo dinámico en un balancín con un ángulo de inclinación de 10° y 5 rpm colocando la placa en el balancín con los canales paralelos a la dirección de balanceo. Refresque el medio de crecimiento cada dos días. NOTA: El cultivo dinámico mejora el intercambio de medios entre los reservorios y los canales y ayuda a que las células proliferen durante la noche.</li>
</ol>7. Evaluación de la maduración del endotelio
<ol><li>Precaliente ECGM y DPBS en un baño de agua a 37 °C durante 30 min y reactivo Cell Counting Kit-8 (CCK8) a temperatura ambiente.</li>
	<li>Prepare una solución de trabajo de CCK8 mezclando 100 μL de reactivo CCK8 con 1 mL de ECGM fresco para cada pocillo. Mientras trabaja para una placa/canal de 6, prepare 600 μL de reactivo CCK8 combinándolo con 6 mL de ECGM fresco.</li>
	<li>Retire el medio de crecimiento por succión y enjuague los canales con DPBS. Agregue 1 mL de solución de trabajo CCK8 a cada pocillo y deje que la placa permanezca plana dentro de la incubadora durante 30 minutos. Después, inicie el cultivo dinámico en un balancín como se describe en el paso 6.9 y continúe este proceso durante las próximas 3 h.</li>
	<li>Después de 3 h, retire el contenido de cada pocillo inclinando la placa hacia un lado y transfiéralos a una nueva placa de seis pocillos. Enjuague los canales con DPBS y agregue medio fresco. NOTA: Cubra la placa con papel de aluminio hasta la medición de la absorbancia. Mantenga un volumen de reactivo constante en todos los pocillos para garantizar lecturas uniformes. Durante el pipeteo, evite cuidadosamente introducir burbujas de aire, que pueden alterar la precisión de las lecturas de densidad óptica.</li>
	<li>Después de agitar suavemente la placa durante 15 s para garantizar una mezcla uniforme de los colores, utilice un lector de microplacas para medir la absorbancia a 450 nm.</li>
	<li>Repita este procedimiento en intervalos de tiempo predefinidos. Calcule la densidad óptica media para cada punto de tiempo y trace una curva de crecimiento en un software de gráficos. Esta curva indica la maduración relativa del endotelio a lo largo del tiempo.</li>
</ol>8. Ensayo de permeabilidad
<ol><li>Retire el medio de un pozo de interés. NOTA: Para el ensayo de permeabilidad, se recomienda procesar cada pocillo por separado para evitar que otros canales se sequen, lo que podría alterar su permeabilidad vascular.</li>
	<li>Prepare 6 mL de solución de 0,1 mg/mL de dextrano conjugado con FITC disolviendo 70 kDa de dextrano FITC en DPBS. NOTA: Prepare una solución madre de 20 mg/mL de dextrano FITC disolviendo 100 mg de dextrano FITC en 5 mL de DPBS. Después de vorexizar suavemente la solución, alícuota 500 μL en tubos de 1,5 mL para evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación. Estas alícuotas pueden almacenarse a -20 °C durante un máximo de 6 meses. Antes de realizar el ensayo, diluya la solución madre hasta una concentración de trabajo de 0,1 mg/ml.</li>
	<li>Coloque la placa firmemente en la platina del microscopio y ajuste el aumento del objetivo en el modo de contraste de fase para garantizar una visibilidad clara de la pared del canal en la región de interés, junto con el gel ubicado cerca, dentro del campo de visión. NOTA: Para una evaluación efectiva de la permeabilidad, intente maximizar el área del gel que rodea la región de interés en el campo de visión; Este aspecto es clave para un seguimiento preciso del transporte de dextrano.</li>
	<li>Después de enfocar el área deseada, cambie del contraste de fase al modo de fluorescencia. En la pestaña de adquisición de imágenes , agregue FITC en el canal de campo amplio y adquiera una imagen antes de agregar la solución de dextrano, para calcular la intensidad de fluorescencia de fondo. Luego, agregue 1 mL de solución de trabajo de dextrano FITC a un lado del canal y deje que la solución fluya hacia el otro lado del pozo, impulsada por la diferencia de presión hidrostática.</li>
	<li>Adquiera imágenes a intervalos de tiempo predeterminados, con más frecuencia para los canales con alta permeabilidad y con menos frecuencia para aquellos con menor permeabilidad.</li>
</ol>9. Medición de la intensidad de fluorescencia en ImageJ
<ol><li>En el software de análisis de imágenes ImageJ, mida la intensidad en el punto de tiempo inicial (It1), la intensidad promedio observada en el punto de tiempo posterior (It2) y la intensidad debida al ruido de fondo (Ib), como se describe a continuación. Utilice la ecuación (1) para calcular el coeficiente de permeabilidad (Pd). T1 y T2 se refieren a los puntos de tiempo inicial y posterior de la adquisición de imágenes. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66676/66676eq01.jpg" style="margin: auto;">(1)<ol><li>Inicie ImageJ y abra la imagen adquirida en el punto de tiempo inicial.</li>
		<li>Establezca la escala en ImageJ. Vaya a Analizar | Establecer escala. Introduzca la escala y la unidad de medida conocidas.</li>
		<li>Seleccione la herramienta rectángulo y dibuje un rectángulo sobre el área del gel donde se requiere la medición de la intensidad de fluorescencia.</li>
		<li>Vaya a Analizar | Establezca Mediciones y asegúrese de que el valor medio de gris esté marcado. NOTA: Esta opción mide la intensidad media dentro del área seleccionada. Se pueden seleccionar otros parámetros según sea necesario para el análisis dado.</li>
		<li>Con el área aún seleccionada, vaya a Analizar | Mida o simplemente presione M. Espere a que se abra una ventana de resultados que muestra la intensidad de fluorescencia media y cualquier otro parámetro seleccionado.</li>
		<li>Realice tres mediciones y calcule el valor medio de la intensidad de fluorescencia en una hoja de cálculo.</li>
		<li>Repita este procedimiento para las imágenes capturadas en el punto de tiempo posterior t2, así como las tomadas antes de la adición de la solución de dextrano para el cálculo de la intensidad de fluorescencia en el punto de tiempo posterior, para determinar la fluorescencia de fondo.</li>
	</ol></li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Bioimpresión 3D para la fabricación rápida de redes vasculares mediante recipientes en una placa

<table><tbody><tr><td>Pipeta serológica de 10 mL</td><td>SPL</td><td>SPL 91010</td><td></td></tr><tr><td>jeringa de 10 mL&nbsp;</td><td>Shinchang Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL tubo cónico</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>Bioimpresora 3D&nbsp;</td><td>T& R Biofab</td><td>3DX-Printer</td><td></td></tr><tr><td>placa de 6 pocillos&nbsp;</td><td>SPL</td><td>37206</td><td></td></tr><tr><td>Cabinas de seguridad biológica</td><td>CHC LAB</td><td>PCHC-777A2-04,&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Microscopios invertidos de campo claro Kit de recuento de</td> células <td>Leica</td><td>DMi1</td><td></td></tr><tr><td>(CCK8)</td><td>GlpBio</td><td>GK10001</td><td></td></tr> kit de <tr><td>recuento de células (CCK8)</td>Matraz de cultivo celular <td>GK10001</td><td></td> <td>GlpBio</td></tr><tr><td>75T</td><td>SPL</td><td>70075</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Matriz de membrana basal con factor de crecimiento reducido (GFR), sin LDEV, 10 mL</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Agua</td><td></td><td></td><td></td>destilada</tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, Grado de Cultivo Celular</td><td>Sigma aldrich</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>Dow-Corning, PDMS-Sylgard 184a Kit</td><td>DOW</td><td>DC-184</td><td></td></tr><tr><td>DOWSIL SE 1700 Clear W/C 1.1 KG Kit&nbsp;</td><td>DOW</td><td>2924404</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS - 1x</td><td>Welgene</td><td>LB001-01</td><td></td></tr><tr><td>Medio de crecimiento de células endoteliales MV 2 (Listo para usar)</td><td>Promocell</td><td>C-22022</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Micro pipeta (1000,200,100,20,10)</td><td>eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alcohol etílico 99.9%</td><td>Duksan</td><td>D5</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibrinógeno de plasma bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8630-1G</td><td></td></tr><tr><td>FITC Dextrano 70 kDa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46945-100MG-F</td><td></td></tr><tr><td>Perlas fluorescentes (1.0 &mu; m, verde)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L1030-1ML</td><td></td></tr><tr><td>GelMA-polvo (Metacrilato de gelatina) 50 g</td><td>3D Materiales&nbsp;</td><td>20JT29</td><td></td></tr><tr><td>Gibco, Medio de congelación de cultivo celular de recuperación, 50 mL</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HUVECs (células endoteliales de la vena umbilical humana)</td><td>Software Promocell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td> Incubadora <td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermo</td><td>SCIENTIFIC</td><td>Forma STERI-CYCLE i160 CO2 Incubadora</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen, Kit de viabilidad viva/muerta/citotoxicidad (para células de mamíferos)</td><td>Thermo Fisher</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Polvo de fosfato de litio fenil (2,4,6-trimetilbenzoil)&nbsp;</td><td>Tokoyo Industria Química CO.</td><td>85073-19-4&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Marienfeld Superior, Tapa de la cámara de recuento</td><td>Marienfeld Superior</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Marienfeld Superior, Hemocitómetro, cámara de recuento de células</td><td>Marienfeld Superior</td><td>HSU-0650030</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Centrífuga eppendorf</td><td>5920 R</td><td></td></tr><tr><td>NCViewer.com</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tanque de nitrógeno</td><td>WORTHINGTON INDUSTRIES</td><td>LS750</td><td></td></tr><tr><td>Láser UV OMNICURE</td><td>EXCELITAS</td><td>SERIES 1500</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>amcor</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Solución de penicilina-estreptomicina (100x)</td><td>GenDEPOT</td><td>CA005-010</td><td></td></tr><tr><td>Mezclador planetario</td><td>THINKY CORPORATION, japón</td><td>ARE-310</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de tratamiento de plasma</td><td>FEMTO SCIENCE</td><td>CUTE-1MPR</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma aldrich</td><td>P2443-250G</td><td></td></tr><tr><td>Tampón prefabricado, (P2007-1) 10x PBS</td><td>Biosesang</td><td>PR4007-100-00</td><td></td></tr><tr><td>Armario de almacenamiento de reactivos</td><td>ZIO FILTER TECH</td><td>SC2-30F-1306D1-BC</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de imagen de célula viva en tiempo real</td><td>Carl ZEISS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Refrigerador</td><td>SAMSUNG</td><td>RT50K6035SL</td><td></td></tr><tr><td>ROCKER 2D digital</td><td>IKA</td><td>4003000</td><td></td></tr><tr><td>Scoop-Espátula</td><td>CachePor</td><td>SL-SCO7001-EA</td><td></td></tr><tr><td>sigma,Tripsina-EDTA solition, 0.25%</td><td>Sigma aldrich</td><td>T4049-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de Dodecilo de Sodio (SDS)</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>151-21-3</td><td></td></tr><tr><td>Tapa de punta de barril de jeringa</td><td>FISNAR</td><td>3051806</td><td></td></tr><tr><td>Contador</td><td>de conteo Compañía de control</td><td>&nbsp; C23-147-050</td><td></td></tr><tr><td>Boquilla cónica (18 g)</td><td>Mushashi</td><td>TPND-18G-U</td><td></td></tr><tr><td>Boquilla cónica (22 g)</td><td>Mushashi</td><td>TPND-22G-U</td><td></td></tr><tr><td>Boquilla cónica 20 g</td><td>Musashi</td><td>TPND-20G-U</td><td></td></tr><tr><td>Trombina de plasma bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7326-1KU</td><td></td></tr><tr><td>Temporizador, 4 canales</td><td>ETL</td><td>SL. Tim3005</td><td></td></tr><tr><td>Solución de Azul de Tripano 0.4%</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Solución Neutralizante de Tripsina</td><td>Promocell</td><td>C-41120</td><td></td></tr><tr><td>UG 24 mL Tarro de ungüento UG</td><td>Yamayu</td><td>Nº 3-53</td><td></td></tr><tr><td>UG 58 mL Tarro de ungüento UG</td><td>Yamayu</td><td>Nº 3-55</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>DAIHAN Scientific</td><td>WB-11</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de pesas</td><td>Sartorius</td><td>bce2241-1skr</td><td></td></tr></tbody></table>

método de bioimpresión de alto rendimiento para modelar la permeabilidad vascular en placas estándar de seis pocillos con flexibilidad de tamaño y patrón

High-Throughput Bioprinting Method for Modeling Vascular Permeability in Standard Six-well Plates with Size and Pattern Flexibility

La plataforma VOP, con flexibilidad de tamaño y patrón, se fabricó con un sistema de bioimpresión de múltiples cabezales. Los canales, tanto huecos como con capacidad de perfusión, se sembraron con HUVEC para facilitar la endotelización y posteriormente se evaluaron con un ensayo de permeabilidad (Figura 1A). Para demostrar la capacidad de fabricación multiescala de este método, imprimimos tres configuraciones distintas: recta, bifurcada y enrevesada (Figura 1B). A través de un enfoque de fabricación sencillo, se pueden producir seis canales vasculares huecos y perfusibles incrustados dentro de una matriz de hidrogel dentro de una placa estándar de seis pocillos. A continuación, estos canales pueden ser endotelializados con HUVECs (Figura 2A). Las células se adhieren y proliferan rápidamente para cubrir la superficie luminal del canal vascular (Figura 2B). Las células adheridas a las superficies luminales inferior y superior exhiben una distribución uniforme dentro del lumen (Figura suplementaria S1).
La placa se colocó en una incubadora humidificada durante 3 días para permitir que la tinta de silicona se curara y al mismo tiempo garantizar que el patrón de sacrificio permaneciera libre de desecación (Figura 3A). Para evaluar el flujo a través de estos canales, se introdujeron microperlas verdes, demostrando que los canales son efectivamente perfusibles (Video Suplementario S1). El diámetro de los canales varió de 558 ± 38 μm a 1094 ± 45 μm modificando el tamaño de la boquilla de 22 G a 18 G durante la impresión del patrón de sacrificio. Además, se manipuló la configuración geométrica de los canales mediante la modificación del código G de la bioimpresora (Archivo Suplementario 1) para permitir la impresión de patrones enrevesados y bifurcados (Figura 3B).
La duración de la reticulación con UV se optimizó a 120 s, lo que favorece la proliferación celular efectiva (Figura suplementaria S2). Esta duración de la reticulación dio como resultado un entorno fisiológicamente más relevante que promueve la proliferación de células endoteliales, probablemente debido a las propiedades mecánicas equilibradas y la porosidad del hidrogel, lo que facilita una mejor unión celular y la posterior proliferación. Los HUVEC proliferaron eficazmente en la superficie luminal y mostraron una morfología similar a la de un adoquín el día 5 después de la siembra. La maduración del endotelio se evaluó con el ensayo CCK8 realizado en los días 1, 3 y 5 (Figura 4A,B). La maduración del endotelio se verificó mediante inmunotinción para CD31 5 días después de la siembra celular, lo que demostró la localización de CD31 en las uniones estrechas (Figura 4D).
Para evaluar la función barrera del endotelio, perfundimos una solución de dextrano de 70 kDa a través de los canales en el día 5 de maduración. Para la comparación, se seleccionó un canal de control sin endotelio (desnudo). El canal endotelizado exhibió cambios mínimos en la fluorescencia dentro de la región del gel perivascular a lo largo del tiempo, lo que sugiere que el endotelio mantuvo efectivamente su función de barrera. Sin embargo, los canales desnudos mostraron un aumento de la fluorescencia en la región del gel perivascular, lo que indica una mayor permeabilidad debido a la ausencia de endotelio (Figura 4C y Figura 4E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66676/66676fig01.jpg"> Figura 1: Preparación de los canales vasculares impresos y sus configuraciones. (A) Esquema de fabricación, endotelización y ensayo de permeabilidad de los canales vasculares impresos. (B) Esquema de las tres configuraciones demostradas en este método: recta, bifurcada y enrevesada. Abreviatura: VOPs = recipientes en un plato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66676/66676fig02.jpg"> Figura 2: Cronología de fabricación para imprimir el patrón de sacrificio y la cámara de silicio, así como la endotelización del canal vascular. (A) La ilustración representa un solo pocillo de la placa del pocillo y AA' se refiere a la vista a lo largo del plano de la sección transversal. (B) Imágenes representativas de los pasos involucrados en el proceso de fabricación. Barras de escala = 5 mm (B1), 200 μm (B2-4). Abreviaturas: GelFib = 15% de gelatina de metacrilato y 1% de fibrinógeno en solución de fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato de litio al 0,05% p/v; HUVECs = Células endoteliales de la vena umbilical humana. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66676/66676fig03.jpg"> Figura 3: Vasijas en una placa. (A) Imagen bruta de las vasijas en una placa después de la impresión del patrón de sacrificio y la cámara de silicona. (B) Demostración de fabricación multiescala de canales vasculares con una variedad de configuraciones y tamaños, perfundidos con microperlas verdes. Barras de escala = 200 μm (canales rectos), 1.000 μm (canales contorneados y bifurcados). Abreviaturas: ID = diámetro interno. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66676/66676fig04.jpg"> Figura 4: Canales vasculares y su maduración y permeabilidad endotelial. (A) Imágenes microscópicas de fluorescencia de canales vasculares en los días 1, 3 y 5 después de la siembra con HUVECs marcadas con proteínas fluorescentes verdes, que muestran la proliferación y la morfología de adoquines de HUVECs en el día 5. (B) La maduración endotelial se evaluó con el ensayo CCK-8 a los días 1, 3 y 5 después de la siembra de células. (C) Ensayo de permeabilidad de canales vasculares endotelizados (endotelio +) y desnudos (endotelio -). (D) Imágenes representativas de la tinción de CD31 ilustran la localización de CD31 en uniones estrechas en el día 5. E) Cuantificación de la permeabilidad a la difusión. Barras de escala = 200 μm (A, C, D). Abreviaturas: HUVECs = Células endoteliales de la vena umbilical humana; GFP = proteína verde fluorescente; GFP HUVECs = HUVECs marcados con GFP; CCK-8 = kit de conteo de células 8; DAPI = 4'6-diamidino-2-fenilindol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Tinta de impresión</td>
			<td colspan="2">Parámetros de impresión</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Calibre de boquilla</td>
			<td>Temperatura (°C)</td>
			<td>Presión de aire (kPa)</td>
			<td>Velocidad del cabezal (mm/min)</td>
		</tr><tr><td>Tinta de sacrificio</td>
			<td>18</td>
			<td>37</td>
			<td>40-48</td>
			<td>200</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>20</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>22</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Tinta de silicona</td>
			<td>22</td>
			<td>5</td>
			<td>100</td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Parámetros de impresión para las tintas de sacrificio y silicona.
Archivo complementario 1: Script de código G que contiene los comandos para imprimir en 3D el patrón de sacrificio y la cámara de silicio dentro de una placa de seis pocillos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676_GCode%20File_Jove.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura suplementaria S1: Imágenes representativas de la superficie luminal inferior y superior después de la siembra celular que muestran la unión de GFP-HUVEC en los planos focales inferior y superior. Barras de escala = 200 μm. Abreviaturas: UU' = plano focal superior; LL' = plano focal inferior. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676_Supp%20S1%20rev.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura suplementaria S2: Proliferación de GFP-HUVEC bajo diferentes duraciones de reticulación con UV (405 nm). Barras de escala = 200 μm. Abreviaturas: HUVECs = Células endoteliales de la vena umbilical humana; GFP = proteína verde fluorescente; GFP HUVECs = HUVECs marcados con GFP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676_Supp%20S2%20rev.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Video complementario S1: Perfusión con microesferas verdes que muestran la perfusión efectiva a través de los canales rectos, contorneados y bifurcados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/Channels%20Perfusion.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Tabla complementaria S1: Funciones de los comandos de código G y código M. NOTA: En el código G, X, Y y Z indican las coordenadas del movimiento a lo largo de los ejes X, Y y Z, respectivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676_Supplementary%20Table%201.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Método de bioimpresión de alto rendimiento para modelar la permeabilidad vascular en placas estándar de seis pocillos con flexibilidad de tamaño y patrón

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Bioengineering

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